全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1209～1214
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 04 - 07; 修回日期 : 2006 - 09 - 05
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (39970517, 30270915, 30471182)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: shensx@mail1hebau1edu1cn)
利用小孢子培养创建大白菜初级三体的研究
申书兴 1, 23 　侯喜林 1 　张成合 2
(1 南京农业大学作物遗传与种质资源创新国家重点实验室 , 园艺学院 , 江苏南京 210095; 2 河北农业大学园艺学院 ,
河北保定 071001)
摘 　要 : 创建大白菜初级三体是开展基因染色体定位等细胞分子遗传学方面研究的基础。本研究从四
倍体大白菜 9405自交系游离小孢子培养获得的植株中 , 筛选出 79个 2n + 1植株。通过根尖中期染色体核
型分析 , 并结合减数分裂和植株外部形态特征观察 , 从中鉴定筛选出了一整套初级三体。各初级三体在植
株的形态特征上表现出不同程度的差异。四倍体大白菜游离小孢子培养是创建初级三体的快捷简便的有效
途径。
关键词 : 大白菜 ; 小孢子 ; 三体 ; 核型
中图分类号 : S 63411　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621209206
A Study on O bta in ing Pr imary Tr isom ics by the Isola ted M icrospore Culture
of Autotetraplo id Ch inese Cabbage
Shen Shuxing 1, 23 , Hou Xilin1 , and Zhang Chenghe2
(1 S ta te Key Labora tory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, College of Horticulture, N an jing A gricu ltra l U niversity,
N angjing, J iangsu 210095, Ch ina; 2 College of Horticulture, Hebei A gricu ltura l U niversity, B aoding, Hebei 071001, Ch ina)
Abstract: Selection of p rimary trisom ics of Chinese cabbage 〔B rassica cam pestris L. ssp. pek inesis
(Lour) O lsson〕is an important foundation for the gene chromosome mapp ing and other genetic studies. The
aneup loid p lantswith one extra chromosome (2n + 1) were obtained from the isolated m icrospore cultured p la2
ntlets of the tetrap loid Chinese cabbage. By karyotype analysis of the root tip metaphase chromosome, meiosis
observation and p lant characters investigation, a set of p rimary trisom ics ( Tri21, Tri22, Tri23, Tri24, Tri25,
Tri26, Tri27, Tri28, Tri29 and Tri210) was identified. Each trisom ic was with some unique characters on p lant
morphological traits. The isolated m icrospore culture of tetrap loid Chinese cabbage is a convenient and effec2
tive way to select trisom ics in Chinese cabbage.
Key words: Chinese cabbage; B rassica cam pestris L. ssp. pekinesis (Lour) O lsson; M icrospore; R i2
som ics; Karyotype
分子标记技术因其简便易行 , 广泛应用于高密度连锁群的构建 , 但要将连锁群定位于染色体 , 进
行基因的物理作图 , 最简单有效的工具是初级三体和单体。由于单体一般只存在于异源多倍体植物 ,
因此三体对二倍体植物的基因定位和遗传作图尤为重要。此外 , 三体还可用于确定相互易位所涉及的
染色体以及染色体的重复效应。
大白菜 〔B rassica cam pestris L. ssp. pekinesis (Lour) O lsson〕原产中国 , 是重要的蔬菜作物。虽
然在大白菜与结球甘蓝杂交获得异源三倍体方面已有报道〔1〕, 但目前国内外尚没有创建大白菜初级
三体成功的报道。
创建初级三体的方法一般是先通过二、四倍体间杂交获得三倍体 , 再从三倍体与二倍体的回交子
代中逐一鉴定筛选出不同的三体。这种传统的方法费工费时 , 选育一套初级三体一般需要多年的时
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
间 , 而且 , 研究发现大白菜二倍体与四倍体杂交不能获得三倍体〔2〕, 进而阻碍了三体的获得。若采
用植物组织和细胞培养技术 , 对同源四倍体植株进行小孢子培养 , 利用同源四倍体减数分裂不规则、
可产生较高频率 2n + 1配子的特点 , 直接从其小孢子植株中筛选 2n + 1个体 , 然后再从 2n + 1个体中
鉴定不同类型的三体 , 这将会大大提高初级三体的选择效率 , 缩短选择年限。
近年来 , 作者在同源四倍体大白菜游离小孢子培养中 , 获得了大量小孢子植株〔3〕, 在此基础上 ,
通过细胞学鉴定 , 从中获得了 79个 2n + 1植株 , 并由此成功地鉴定筛选出了一整套初级三体 ( Tri21
～Tri210)。这不仅为大白菜的基因定位等遗传研究提供了关键材料 , 也为植物初级三体的创建提供
了新方法。
1　材料与方法
111　材料
供试材料为从同源四倍体大白菜 9405自交系 (2n = 4x = 40) 获得的小孢子植株中鉴定出的染色
体数为 2n + 1试管无性系及其田间植株。
112　方法
11211　小孢子单株无性系的建立 　采用遗传性稳定的腋芽增殖途径 , 以 MS为基本培养基 , 将小孢
子植株繁殖成单株无性系 , 供染色体数目鉴定及核型分析。
11212　染色体数目鉴定 　按单株无性系分别切取生长健壮的腋芽接种在 1 /2MS培养基上 , 待根长
015～110 cm时 , 在无菌操作条件下 , 切取根尖速置 0105%的秋水仙素水溶液中预处理 2 h, 然后用
Carnoy固定液 (95%乙醇 ∶冰醋酸为 3∶1) 固定 , 24 h后转入 70%乙醇中 , 于 4℃冰箱中保存备用。
常规压片法鉴定染色体数目 , 将确定为 2n + 1的单株无性系保留并继代繁殖。
11213　初级三体类别鉴定　采用核型分析、减数分裂观察及植株外部形态观测等方法 , 对 2n + 1株
系逐一进行鉴定分析 , 确定是否为真正的三体及其类别。
核型分析用根尖有丝分裂中期染色体 , 前处理液为 01002 mol·L - 1的 8 - 羟基喹啉水溶液 , 处理
时间 2 h, 然后用 Carnoy固定液固定。压片法或去壁低渗 —火焰干燥法制片 , 挑选染色体分散良好、
结构完整、形态清晰的中期分裂相 , O lympus2BH2显微镜观察照相。参照李懋学等〔4〕的方法进行核型
分析。减数分裂采用常规涂片法制片。
依据核型分析和减数分裂观察结果 , 并结合植株外部形态特征的观测比较 , 确定各 2n + 1株系额
外染色体的类别。
11214　不同初级三体的特征特性观察　在栽培管理条件一致的情况下 , 以正常二倍体为对照 , 对各
初级三体生殖生长期植株的生长发育特性和外部形态特征进行观测和比较 , 找出不同初级三体的标记
性特征。
2　结果与分析
211　小孢子植株染色体数
对四倍体大白菜小孢子培养获得的 534个小孢子植株的染色体数目进行了鉴定 , 结果表明 ,
二倍体为 324 株 (占 60167% ) , 四倍体为 115 株 (占 21154% ) , 非整倍体为 95 株 (占
17179% )。非整倍体植株中 , 比二倍体多 1条染色体 ( 2n + 1) 的为 79株 (占 83116% ) , 多 2条
染色体 ( 2n + 2) 的为 7株 (占 7137% ) , 少 1条染色体 ( 2n - 1) 的为 9株 (占 9147% )。2n + 1
的植株是直接获取三体的材料 ; 2n + 2植株尚需通过自交或回交 , 然后再从其子代中分离获得初级
三体。
212　2n + 1植株的三体鉴定
2n + 1植株是否是三体 , 需根据染色体在减数分裂中的配对行为来确定。若为三体 , 大白菜的 21
0121
　6期 申书兴等 : 利用小孢子培养创建大白菜初级三体的研究 　
条染色体在减数分裂前期 Ⅰ应出现 9个二价体和 1个三价体 (9Ⅱ + Ⅲ) 的联会形式。观察表明 , 在
获得的 79个 2n + 1株系中 , 减数分裂终变期或中期 Ⅰ均见有 9Ⅱ + Ⅲ的联会方式 , 这表明它们都属
于三体类型。
213　初级三体的类别
为提高鉴定效率 , 首先对各 2n + 1单株无性株系的部分试管苗进行田间移栽、观察和分类。结果
表明 , 依据植株外部表型特征 , 79个 2n + 1株系大致可分为 10个类群 , 各类群的株系数不等 , 最多
的有 21个株系 , 最少的为 3个株系。
对各类群的 2n + 1株系分别进行核型分析 , 并参照李懋学等〔4〕的核型分析标准 , 通过反复的分
析比较 , 最终从 79个 2n + 1株系中获得了大白菜的一整套初级三体 (三体 - 1～三体 - 10)。各初级
三体的核型图见图 1, 核型参数的平均值见表 1。
由表 1可见 , 1号、2号、4号、5号和 7号染色体的臂比 (L /S) 在 1113～1162之间 , 为中部着
丝点染色体 ; 3号、6号、8号和 9号染色体的臂比在 1173～2105之间 , 为近中部着丝点染色体 ; 10
号染色体的臂比为 3104, 属近端部着丝点染色体 , 且为具随体的染色体。
大白菜的染色体虽然较小 , 但形态差别较明显 , 不同染色体间比较容易区分和识别 , 所以依
据染色体长度、臂比及其它形态指标可以识别出不同染色体。首先可以确认出 1号染色体和 10号
随体染色体 , 因为 1号染色体相对长度最长 , 10号随体染色体具有明显的随体 ; 然后将余下的染
色体按相对长度大小可以分为两组。一组为相
对较长的染色体即 2、3、4、5号染色体 , 其中
2、3号染色体相对长度明显比 4、5号长 ; 另
外 , 2号染色体臂比明显比 3号小 , 2号染色体
为中部着丝点染色体 , 3号染色体为近中部着丝
点染色体 ; 4号和 5号染色体长度相近 , 但 4号
染色体臂比明显比 5号小 , 4号染色体几乎为正
中部着丝点染色体。另一组染色体为 6、7、8、
9号染色体 , 其中 6号染色体相对长度最长 , 且
为近中部着丝点染色体 ; 7号和 8号染色体长度
相近 , 但 7号染色体臂比明显比 8号的小 ; 9号
染色体最小。
表 1　大白菜三体的核型参数
Table 1　Karyotype da ta of the tr isom ics of Ch inese cabbage
染色体编号
No. of chromosome
相对长度
Relative length ( % )
臂比
A rm ratio
类型
Type
1 8. 24 + 6. 41 = 13. 65 1. 29 m
2 7. 21 + 4. 66 = 11. 87 1. 55 m
3 7. 09 + 3. 77 = 10. 86 1. 88 sm
4 5. 47 + 4. 86 = 10. 33 1. 13 m
5 5. 33 + 3. 89 = 9. 22 1. 37 m
6 5. 67 + 2. 79 = 8. 46 2. 03 sm
7 4. 86 + 3. 01 = 7. 87 1. 62 m
8 4. 99 + 2. 44 = 7. 43 2. 05 sm
9 4. 09 + 2. 37 = 6. 46 1. 73 sm
10 8. 84 + 2. 91 = 11. 75 3. 04 st( SAT)
214　不同三体的形态特征
观察鉴定发现 : 各初级三体营养期植株形态特征不如生殖生长期植株的形态特征差别明显。各三
体间在生殖生长阶段的性状差异可作为识别不同三体的形态特征。
各初级三体的主要特征如下 :
1号三体 ( Tri21) : 生殖生长植株直立 , 生长势较强 , 分枝数较少 , 花序内花蕾数中等 , 花蕾中
等大小 , 结荚较正常 , 但自然结籽率 (种子数占胎座数的百分率 ) 低 (10%左右 )。
2号三体 ( Tri22) : 生殖生长植株直立 , 生长势较弱 , 分枝数较少 , 花序内花蕾数较少 , 花蕾钝
圆 , 自然结籽率高 (78%左右 )。
3号三体 ( Tri23) : 生殖生长植株易倒伏 , 生长势较强 , 分枝数中等 , 花序内花蕾数中等 , 花蕾
钝圆 , 自然结籽率低 (13%左右 )。
4号三体 ( Tri24) : 生殖生长植株直立 , 生长势较弱 , 花序内花蕾数多 , 花蕾较小 , 荚短小 , 自
然结籽率低 (22%左右 )。
5号三体 ( Tri25) : 生殖生长植株直立 , 生长势较弱 , 分枝数较多 , 花序内花蕾数较少 , 花蕾较
小且钝圆 , 自然结籽率中等 (53%左右 )。
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6号三体 ( Tri26) : 生殖生长植株直立 , 生长势较强 , 分枝数较多 , 花序内花蕾数多 , 花蕾较小 ,
自然结籽率高 (62%左右 )。
7号三体 ( Tri27) : 生殖生长植株易倒伏 , 生长势较强 , 分枝数中等 , 花序内花蕾数中等 , 花蕾
较小 , 自然结籽率中等 (55%左右 )。
8号三体 ( Tri28) : 生殖生长植株直立 , 生长势较强 , 分枝数中等 , 花序内花蕾数多 , 花蕾中等
大小 , 自然结籽率中等 (43%左右 )。
9号三体 ( Tri29) : 生殖生长植株易倒伏 , 生长势较强 , 分枝数较少 , 花序内花蕾数中等 , 花蕾
钝圆 , 自然结籽率高 (70%左右 )。
10号三体 ( Tri210) : 生殖生长植株易倒伏 , 生长势较弱 , 分枝数较多 , 花序内花蕾数较多 , 花
药小且花粉少 , 自然结籽率很低 (5%左右 )。
3　讨论
植物初级三体是基因定位、确定连锁群与染色体对应关系的关键材料之一 , 在基因剂量效应和染
色体工程育种等研究中亦有十分重要的作用。大白菜 〔B rassica cam pestris L. ssp. pek inesis (Lour) O l2
sson〕原产中国 , 种质资源丰富 , 其初级三体的成功创建对大白菜遗传和育种的深入研究无疑会起到
积极地推动作用。
创建植物初级三体一般需要经历人工诱导获得同源四倍体、四倍体与二倍体杂交获得三倍体、三
倍体再与二倍体回交获得回交子代、从回交子代中筛选鉴定出不同的初级三体等步骤。这种传统的创
建方法比较费工费时 , 选育一套初级三体一般需要多年的时间。如水稻 IR36三体系的建立用了近 14
年〔5〕。此外 , 由于植物不同倍性间杂交大都存在着杂交不育或育性极低的现象 , 致使传统选育三体
的方法受到限制或难以进行。因此 , 迄今也只在水稻〔5, 6〕、谷子〔7〕、大麦〔8〕、番茄〔9〕甜菜〔10〕等少数
作物中人工创造出了整套初级三体。
植物小孢子培养为三体的选育提供了新手段。利用同源四倍体减数分裂不规则、可产生较高频率
2n + 1小孢子的特点 , 对同源四倍体植物进行小孢子培养 , 然后从其小孢子植株中直接筛选三体 , 这
不仅克服了杂交不育问题 , 而且会大大提高三体的选择效率 , 缩短选育年限。刘宗贤等〔11〕在四倍体
水稻花药培养中曾获得大量的 2n + 1植株 , 并获得了部分初级三体。
我们通过四倍体大白菜游离小孢子培养 , 从中筛选出了许多 2n + 1和 2n + 2等非整倍体小孢子植
株 , 并由此成功地获得了一整套初级三体 (三体 - 1～三体 - 10) , 充分证实了由小孢子培养途径创
建初级三体的可行性。
三体植株常常会由于额外染色体的增加而表现出一些特征效应。由于不同三体所增加的额外染色
体不同 , 使得不同三体之间 , 以及各三体与正常二倍体之间 , 在特征特性上往往会表现某些差别 , 这
些差别可作为识别不同三体的重要标志 , 也为三体的应用提供了便利条件。但要准确地鉴定出不同三
体还需要用鉴定染色体方法进行。
对田间三体植株鉴别的方法一般采用从易到难、从间接到直接鉴定 , 即首先从植株形态特征鉴
别 , 再对花粉活力和整齐度及花粉母细胞减数分裂过程中染色体联会形式、染色体分离行为等鉴定 ,
确定是否为三体 , 最后对侧枝的生长点或根尖有丝分裂中的染色体进行核型分析 , 鉴定具体是哪种三
体。
根据我们的研究结果和工作实践〔12〕可知 : 大白菜染色体虽属小型染色体 , 但把有丝分裂中的
染色体长度与臂比二者结合起来 , 可较容易地区分不同染色体 , 关键技术是有高质量的染色体制
片。
2121
　6期 申书兴等 : 利用小孢子培养创建大白菜初级三体的研究 　
图 1　大白菜各初级三体核型图
1. 初级三体 - 1; 2. 初级三体 - 2; 3. 初级三体 - 3; 4. 初级三体 - 4; 5. 初级三体 - 5;
6. 初级三体 - 6; 7. 初级三体 - 7; 8. 初级三体 - 8; 9. 初级三体 - 9; 10. 初级三体 - 10。
F ig. 1　Karyotype of tr isom ics in Ch inese cabbage
1. Trisom ic21; 2. Trisom ic22; 3. Trisom ic23; 4. Trisom ic24; 5. Trisom ic25;
6. Trisom ic26; 7. Trisom ic27; 8. Trisom ic28; 9. Trisom ic29; 10. Trisom ic210.
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