全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 59 - 62
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 06 - 27; 修回日期 : 2006 - 10 - 08
基金项目 : 重庆市自然科学基金资助项目 (200227297)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lidaogao@ swu1edu1cn)
根癌农杆菌介导 C ry1Ac基因转化 ‘雪青 ’梨获得
转基因植株
汤绍虎 1 , 孙　敏 1 , 廖志华 1 , 周启贵 1 , 李道高 23
(1 西南大学生命科学学院 , 重庆 400715; 2 西南大学园艺园林学院 , 重庆 400716)
摘 　要 : 以 ‘雪青 ’梨叶片愈伤组织为外植体 , 经根癌农杆菌介导将 CaMV35S启动子调控下的
C ry1A c基因导入 ‘雪青 ’梨。698块愈伤组织和 231个 Kanr芽与携带表达载体质粒 pBX203的根癌农杆菌
菌株 LBA4404共培养 3 d后 , 转入含 50 mg·L - 1 Kan的筛选培养基培养 30 d, 15 d转接 1次。结果表明 ,
在 MS + 5 mg·L - 1 62BA + 011 mg·L - 1 IAA筛选培养基中 , Kanr芽率为 34124% , 在 1 /2 MS + 2 mg·L - 1 IBA
+ 015 mg·L - 1 62BA + 500 mg·L - 1AC筛选培养基中 , 15158% Kanr芽生根。共获得再生植株 32株 , 经 PCR
和 Southern2blot分析证明 , 其中 4株的基因组已成功导入和整合 C ry1A c基因。
关键词 : 梨 ; 根癌农杆菌 ; C ry1A c基因 ; 遗传转化
中图分类号 : S 66112; Q 94312　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120059204
O bta inm en t of Tran sgen ic‘Xueq ing’Pear Plan ts w ith a Syn thetic C ry1A c
Gene M ed ia ted by A grobac te rium tum efac iens
TANG Shao2hu1 , SUN M in1 , L IAO Zhi2hua1 , ZHOU Q i2gui1 , and L IDao2gao23
(1 School of L ife Science, Sou thw est U niversity, Chongqing 400715, China; 2 College of Horticulture and Gardening, Sou thw est
U niversity, Chongqing 400716, Ch ina)
Abstract: By using calli from leaves of Xueqing pear ( Pyrus sp. ) as exp lants, the C ry1A c gene regula2
ted by CaMV35S p romoter was introduced into Xueqing pear through A g robacterium 2mediated transformation.
After co2culturing 698 calli and 231 Kanr buds, respectively, with A. tum efaciens strain LBA4404 harboring a
p lasm id pBX203 for 3 days and transferred to the selective medium containing 50 mg·L - 1 kanamycin for 30
days at a 152day interval, 34124% kanamycin2resistant ( Kanr ) buds ( adventitious shoots) regenerated on MS
+ 5 mg·L - 1 62BA + 011 mg·L - 1 IAA and 15158% of Kanr buds rooted on 1 /2 MS + 2 mg·L - 1 IBA + 015
mg·L - 1 62BA + 500 mg·L - 1 AC. A total of 32 p lants were obtained, but only 4 p lants were confirmed by
PCR and Southern2blot analysis that the C ry1A c gene was transferred and integrated into the genome of
Xueqing pear.
Key words: Pear; A g robacterium tum efaciens; C ry1A c gene; Genetic transformation
我国梨的栽培面积和产量居世界首位 , 但病虫害较多。梨因童期长、自交不亲和及杂合程度高等原
因 , 其有性杂交育种成效较低 (赵瑞华 等 , 2004)。通过遗传转化将期望性状导入现有品种 , 不会出现
基因大量重组 , 且能避开童期的干扰。现已获得丰产 (赵瑞华 等 , 2004)、康佛伦斯 (Mourgues et al. ,
1996)、帕西、杜康 (刘翠琼和汤浩茹 , 2003) 和杜梨 ( Kaneyoshi et al. , 2001) 等品种的转基因植株 ,
而引入的外源基因尚无抗虫基因。作者于 2003年 7月～2005年 8月在西南大学生命科学学院采用根癌
农杆菌介导法 , 把 Cry1Ac基因导入梨并获得转基因植株 , 为进一步选育抗虫品种奠定了基础。
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1　材料与方法
试验材料 ‘雪青 ’梨 ( Pyrus sp. ‘Xueqing’) 由重庆市绿康果业有限公司提供。外植体为生
长良好的叶片愈伤组织 ( 3 ～4 mm3 ) , 按汤绍虎等 ( 2005 ) 的方法获得。所用根癌农杆菌
(A g robacterium tum efaciens) 为携带表达载体质粒 pBX203的 LBA4404菌株。质粒 pBX203 ( 23 kb)
含筛选标记新霉素磷酸转移酶基因 ( nptⅡ) 和 CaMV35S启动的 C ry1A c基因 (全长 1 848 bp ) , 其
T2DNA结构简图见图 1。
图 1　质粒 pBX203的 T2D NA结构简图
F ig. 1　D iagram of T2D NA reg ion s of pla sm id pBX203
将菌株接种于 50 mg·L - 1 Kan (卡那霉素 ) + 25 mg·L - 1 Str (链霉素 ) + 50 mg·L - 1 R if (利福
平 ) 的 YEB培养基中 , (28 ±1) ℃振荡培养 16 h, 用不定梢诱导培养基或生根培养基 (汤绍虎 等 ,
2005) 稀释至 OD600 = 012～018作为感染菌液。
转化体再生方式为器官再生型 , 即用叶片愈伤组织筛选 Kanr芽 , 再由 Kanr芽 (长 15～20 mm )
筛选 Kanr苗。
愈伤组织和 Kanr芽分别通过感染、共培养和 Kan抗性筛选 ( 15 d转接 1次 , 30 d统计转化频
率 )。Kanr芽和 Kanr苗筛选培养基分别为含 50 mg·L - 1 Kan + 500 mg·L - 1 Carb (羧苄青霉素 ) 的不
定梢诱导和生根培养基。培养温度 (25 ±1) ℃, 光强 2 000 lx, 12 h·d - 1。
C ry1A c基因的 PCR检测和 Southern2blot分析参照王关林和方宏筠 (2002) 的方法进行。PCR引
物 PrimerⅠ: 5′GGAAACTACACCGACCACGC 3′, PrimerⅡ: 5′CCATAGTTCCATAGAGAGGAAAGG 3′,
反应体系 25μL。反应参数为 : 94℃ 10 m in; 94℃ 45 s, 56℃ 45 s, 72℃ 1 m in, 30次循环 ; 72℃ 1
m in。
在 Southern2blot分析中 , 将 PCR阳性反应的 Kanr植株的基因组 DNA用 EcoRⅠ酶切消化 , 溴乙锭
—琼脂糖电泳后将 DNA转移到带电荷的尼龙膜 (Molecular Sigma B iology公司产品 ) 上。
以 (α232 P) dCTP标记的 C ry1A ( c) 基因为探针进行分子杂交 , 1～2 ×SSC - 011% SDS洗膜 , X
感光片压片。
2　结果与分析
211　菌液浓度对转化频率的影响
用不同浓度的菌液感染外植体 3～5 m in, 共培养 3 d。结果 (表 1) 表明 , 在一定范围内 , Kanr
芽率随菌液浓度提高而提高。OD600 = 016时 , Kanr芽率最高 (18160% ) ; OD600 > 016时 , Kanr芽率反
而下降。因此 , 本试验适宜的菌浓度为菌液 OD600 = 016。
212　感染与共培养时间对转化频率的影响
用 OD600 = 016菌液感染外植体不同时间 , 共培养 3 d。结果 (表 2) 表明 , 感染 3～5 m in, Kanr
芽率最高 (17107% )。感染时间过长 , 农杆菌生长过旺 , 甚至包裹外植体 , 之后即使用含 Carb的抑
菌培养基清洗也不能控制农杆菌生长 , 最终造成外植体褐化、死亡 ; 感染时间过短 , 则不能使足够的
农杆菌附着于外植体伤口 , 影响农杆菌侵入外植体细胞 , 也使转化频率降低。因此 , OD600 = 016菌液
感染梨外植体的适宜时间为 3～5 m in。
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　1期 汤绍虎等 : 根癌农秆菌介导 C ry1A c基因转化 ‘雪青 ’梨获得转基因植株 　
表 1　菌液浓度对 ‘雪青’梨转化频率的影响
Table 1　Effects of bacter ium concen tra tion on
tran sforma tion ra te of Xueq ing pear
菌液浓度 Bacterial
concentration (OD600 )
感染愈伤组织数
No. of calli infected
Kanr芽率
Rate of Kanr buds ( % )
012 40 2150
014 42 7114
016 43 18160
018 39 5113 表 2　感染时间对 ‘雪青’梨转化频率的影响Tabel 2　Effect of infection tim es on tran sforma tionra te of Xueq ing pear感染时间 Infectiontime (m in) 感染愈伤组织数No. of calli infected Kanr芽率Rate of Kanr buds( % )1～3 39 51133～5 41 171075～8 41 121208～10 39 1012610～15 39 7169
　　用 OD600 = 016菌液感染 Kanr芽基部 3～5 m in, 在生根培养基上培养 1～5 m in。结果表明 , 适宜
的共培养时间为 3 d, Kanr苗率最高可达 34138%。共培养时间太短 , 在筛选培养基上仅能获得少量
Kanr苗 ; 共培养时间太长 , 则部分外植体褐变、死亡。
213　Kanr植株的获得
在本试验中 , 由 698块愈伤组织通过感染、共培养和抗性筛选得到 239个 Kanr芽 , 平均 Kanr芽
率为 34124%。之后从 231 个 Kanr芽获得 36 株 Kanr苗 ( Kanr植株 ) , 成活 32 株 , Kanr苗率为
15158%。
214　Kanr植株的 PCR和 Southern2blot检测
PCR扩增产物的电泳分析表明 , 32株 Kanr苗中有 4株的 DNA样品扩增出与阳性对照大小一致、
分子量为 423 bp的目的片段 , 阳性率为 1215% ; 未经转化的对照植株 (阴性对照 ) 和其余 Kanr苗
DNA的 PCR扩增产物中无预期的目的片段。初步证明这 4株 Kanr苗为转 C ry1A c基因植株。部分 PCR
检测结果见图 2, A。
Southern2blot鉴定表明 , 4株 PCR 阳性植株基因组 DNA 的酶切产物均可特异性地与 pBX2032
C ry1Ac基因的分子探针杂交 , 阳性率为 100% , 转化率为 0157% ( 4 /698) ; 而未经转化的植株则无
此特异性杂交带 (图 2, B)。由此进一步证明外源 C ry1A c目的基因已成功整合到 ‘雪青 ’梨基因组
中。
图 2　‘雪青’梨 Kanr植株的 PCR检测 ( A) 和转基因植株的 Southern杂交鉴定 ( B)
M: DNA分子量标准 ; CK + : 质粒 pBX203; CK - : 未转化植株 ;
1～4: Kanr植株 (A) , 雪青 ’梨转基因植株 (B)。
F ig. 2　PCR ana lysis of Kanr plan ts ( A) and Southern2blot iden tif ica tion of tran sgen ic plan ts ( B) of Xueq ing pear
M: DNA marker; CK + : DNA from p lasm id; CK - : Non2transgenic p lant;
1 - 4: Kanr p lants (A) , DNA from transformants of Xueqing pear (B) .
3　讨论
本试验中 , Kanr芽在 Kanr苗筛选培养基上的生根率 (15158% ) 和 Kanr苗 PCR阳性率 (1215% )
还较低。表明经 1～2次筛选后 , Kanr芽中转化细胞和与非转化细胞的嵌合现象还较严重 , 使逃逸芽
比例较高 , 这可能与 Kanr芽通过器官再生 (多细胞起源 ) 有关。要进一步提高梨的转化效率 , 除需
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继续优化遗传转化程序外 , 还可采用胚状体途径获得梨的转基因植株。
苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因 (B t2toxin) 是最常用的抗虫基因 (蒋细旺 等 , 2005) , C ry1A c基因
属 B t2toxin家族 , 对鳞翅目昆虫有特异毒杀作用。农杆菌介导法是梨遗传转化中最常用的转化方法
(刘翠琼和汤浩茹 , 2003)。蒋细旺等 (2005) 用根癌农杆菌介导法将 C ry1A c基因转入到了菊花。由
于欧洲梨极易被欧文氏杆菌 ( E rw in ia am y lovora) 侵染导致火疫病 ( Pear fire blight) , 因此国外已向
梨中转入的外源目的基因主要是对火疫病的抗病基因 ( Reynirod et al. , 1999; 刘翠琼和汤浩茹 ,
2003; Malnoy et al. , 2003)。
我国梨的基因工程研究起步较晚 , 目前仅有赵瑞华等 ( 2004) 将抗真菌γ - 硫堇蛋白 R s2afp1基
因导入 ‘丰产 ’梨获得转基因植株。
本试验采用根癌农杆菌介导法将 C ry1Ac基因转入 ‘雪青 ’梨 , 并获得了经分子生物学检测证实
的转基因植株 , 这是国内外梨抗虫基因工程的首次报道。有关 ‘雪青 ’梨转基因植株的田间生物学
鉴定正在进行中。
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