全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 649 - 654
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 10 - 17; 修回日期 : 2007 - 01 - 30
基金项目 : 农业部蔬菜遗传育种和生理重点开放实验室项目 ; 中—荷联合园艺作物基因组技术实验室资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: dyqu@mail1caas1net1cn)
cDNA文库与 RACE方法结合克隆马铃薯 D naJ 2like
基因全长 cDNA
李广存 1, 2 , 金黎平 1 , 王晓武 1 , 谢开云 1 , 谢丙炎 1 , 屈冬玉 13
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 山东省农业科学院高新技术研究中心 , 济南 250100)
摘 　要 : 以青枯病菌小种 3号 (生化变种 2) PO41诱导 24 h和 48 h的马铃薯抗青枯病基因型 ED13叶
片为材料 , 应用 SMART技术构建了一个富集青枯病抗性相关基因的 cDNA文库。继而利用 RACE技术与该
cDNA文库相结合克隆了一个马铃薯分子伴侣基因的全长 cDNA。该 cDNA长 735 bp, 5′端有 25 bp的非翻译
区 , 3′端具有完整的 polyA 尾 , 包含一个编码 177 个氨基酸的完整开放阅读框架 ( GenBank登录号 :
DQ885360)。该分子伴侣基因与拟南芥 D naJ 2like 20的部分核苷酸序列具有 84%的一致性 , 与其编码的氨基
酸序列具有 59%的一致性 , 暂命名为 S tD naJ。目前在马铃薯中尚未发现与之同源的已知基因。半定量 RT2
PCR结果表明 , 该基因同时受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节 , 可能在青枯病菌和茉莉酸胁迫下具有促使
胁迫损害细胞恢复活性的功能。
关键词 : 马铃薯 ; cDNA文库 ; RACE; D naJ 2like基因
中图分类号 : S 532　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320649206
C lon ing of D naJ 2like Gene cD NA in D iplo id Pota to Using RACE M ethods
Com b ined w ith cD NA L ibrary
L I Guang2cun1, 2 , J IN L i2p ing1 , WANG Xiao2wu1 , X IE Kai2yun1 , X IE B ing2yan1 , and QU Dong2yu13
(1 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, China; 2 H igh2Tech Research
Cen ter, Shandong A cadem y of A gricu ltura l Sciences, J ipinan 250100, Ch ina)
Abstract: A cDNA library, enriched with full2length resistance2related genes, was constructed by
SMART ( Switching mechanism at 5′end of RNA transcrip t) technique using dip loid potato leaves infected
with race 3 (B iovar 2) PO41 of R alston ia solanacearum for 24 h and 48 h. A full2length cDNA of D naJ 2like
homolog with comp leted open reading frame of 177 am ino acids was cloned from potato using the strategy of
RACE ( rap id amp lification of cDNA ends) combined with cDNA library. This cDNA homolog was designated
as S tD naJ , which contains 735 bp with an un2translated region of 25 bp at its 5′end and a polyA tail at the 3′
end ( GenBank accession number: DQ885360). BLAST search against NCB I showed that the S tD naJ gene
shared 84% identity with D naJ 2like 20 of A rabidopsis tha liana in nucleotide and 59% in am ino acid, but no
sim ilar genes have been reported from potatoes in the NCB I database. Analysis of sem i2quantitative RT2PCR
indicated that this gene was induced by R alston ia solanacea rum as well as up2regulated by jasmonic acid
(JA). That suggests S tD naJ gene may p lay a role in recovering the activity of p rotein destroyed by R. so2
lanacearum or Jasmonic acid (JA) stress.
Key words: Potato; cDNA library; RACE; D naJ 2like gene
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在生物体内 , 多肽合成后将获得一系列必要的信息来指导其正确的折叠 , 从而发挥其必要的功
能 , 然而在细胞内有限的环境中存在大量的其它分子成分 , 将会大大降低这些多肽的折叠效率或减慢
其折叠的速度 , 因此需要另外一些分子来帮助它进行快速有效的正确折叠 , 避免聚集造成危害。
分子伴侣是一类与其它蛋白不稳定构像相结合并使之稳定的蛋白 , 其本身并不含有相关蛋白质正
确折叠的任何特定信息 , 而只是通过疏水键阻止非天然状态的蛋白分子间或分子内的不正确相互作
用 , 从而增加正确折叠的产率。
分子伴侣在生物体内广泛存在 , 是细胞内蛋白质折叠和组装的重要调节者。自 1991年第一个分
子伴侣基因 hsp70 (D naK) 从萼柱珊瑚 (S ty lophora pistilla ta) 分离出来以后 , 陆续有 hsp40 (D naJ ) ,
hsp90, hsp23 ( g rpE) 等被分离和鉴定 (W alsh et al. , 2004)。
D naK和 D naJ分别作为分子伴侣和协同分子伴侣 ( cochaperone) , 通过促进部分变性的蛋白复性
(重新折叠 ) 来保护胁迫损害的细胞并使其恢复正常功能 ( Glover & L indquist, 1998; Macario & de
Macario, 1999; W eber2Ban et al. , 1999)。
不同的分子伴侣具有不同的亚细胞定位 , 也具有不同功能 : 参与蛋白折叠、翻译起始 ( Transla2
tion initiation)、mRNA剪接 (mRNA sp licing)、蛋白的转移 ( translocation) 及降解等 (W alsh et al. ,
2004; Q iu et al. , 2006)。
全长 cDNA文库的构建是获得基因全长 cDNA的重要基础 , 而 RACE方法又提供了快速获得全长
cDNA的策略。因此 , 作者拟通过构建 SMART2cDNA文库 , 利用 RACE方法自马铃薯中克隆分子伴侣
D naJ 2like基因的全长 cDNA, 并对其在青枯病菌及茉莉酸诱导下的表达动态进行研究 , 为深入探讨该
基因的功能提供依据。
1　材料与方法
111　材料与处理
青枯病菌处理 : 采用茎枝菌液共培养法 (李广存 等 , 2006) 接种处理二倍体马铃薯高抗青枯病
基因型 ED13 (由中国农业科学院蔬菜花卉所马铃薯组保存 ) , 所用病原菌为青枯病菌小种 3号 (B io2
var 2) PO41 (由中国农业科学院蔬菜花卉所植保室提供 )。分别于病原菌处理 0、6、12、24、48、
72和 96 h时取样 , 液氮冷却后 , - 80℃保存。
ED13的亲本 E (原编号为 : 772102137) 来源于二倍体抗青枯病原始栽培种 S. phureja和野生种
S. vernei, 含有青枯病抗性基因。
茉莉酸处理 : 取生长正常、旺盛、整齐、无其它病虫害的块茎繁殖的 ED13植株 , 待植株长至 7
～8片展叶时 , 用 50μmol/L的茉莉酸进行喷洒 , 同时以喷水作为对照 , 分别于 0、3、6、12、24、
48和 72 h取样 , 液氮冷却后 , - 80℃保存。
Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准、各种生化试剂及试剂盒等分别购自 Clontech公司、 Invitro2
gen公司、Promega公司、TAKARA公司、上海生工公司及北京天为时代公司等。
112　cD NA文库的构建
采用 TR IZOL Regent一步法抽提试剂盒 ( Invitrogen, USA) , 依试剂盒说明书提取接菌处理 24和
48 h的叶片总 RNA。等量混合后 , 参照 Clontech SMARTTM L ibrary构建试剂盒操作说明书逆转录合成
cDNA第一链 , LD2PCR法合成 cDNA双链。双链 cDNA经 S fi I酶切后 , 用 CHROMA SP IN2400分离柱
进行分级分离 , 根据需要合并部分组分 , 回收纯化后与λTrip IEx2载体臂 (S fi I2digested arm s) 相连。
采用 Packagene Lambda DNA Packaging System ( Promega) 进行噬菌体包装 , 测定文库滴度并进行文
库扩增。
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　3期 李广存等 : cDNA文库与 RACE方法结合克隆马铃薯 D naJ 2like基因全长 cDNA　
113　目的基因 5′端序列的扩增
依据 SSH文库所得 EST L248片段 (含有完整的 3′末端 ) 的测序结果 , 在其序列内部设计基因特
异引物 GSP2R: 5′2CTTGAACCCGAATAAACCTTTGGG23′。以噬菌体 cDNA文库为模板 , 利用 SMAR2
TTM cDNA L ibrary Construction Kit提供的 5′测序引物和 GSP2R引物扩增该基因的 cDNA 5′端。PCR产物
克隆、测序后 , 根据扩增片段与已有 EST的重叠区将 cDNA 5′和 3′端拼接起来。PCR反应体系参见
SMARTTM RACE cDNA Amp lification Kit说明书。
114　青枯病菌及茉莉酸诱导表达
总 RNA提取及 cDNA 第一链合成同上。依据所获得的 L248全长 cDNA 序列设计其正向引物
L2482F: 5′2ACCACCCAGATGTTTCACCC23′和反向引物 L2482R: 5′2TGCCAACGATTCTTCCATTCAC23′。
以 A ctin基因为内参 , 采用半定量 RT2PCR方法研究其青枯病菌及茉莉酸诱导表达模式。
PCR扩增条件为 : 94℃ 3 m in; 94℃ 30 s, 56℃ 45 s, 72℃ 60 s, 17～35个循环 ; 72℃延伸 5
m in。PCR产物进行 110%的琼脂糖凝胶电泳 , 根据扩增的 DNA条带的亮度来判断基因在不同时间点
的表达水平。
为使所分析基因在不同时间点的表达具有可比性 , 首先利用持家基因 A ctin的特异引物对所有不
同时间点的 cDNA第一链进行 PCR扩增 , 根据其 PCR扩增产物量调整不同时间点的 cDNA第一链的
起始浓度 , 使其趋于一致 ; 其次 , 在进行 PCR扩增时 , 扩增停止于指数增长期 , 使 PCR扩增为不饱
和扩增 , 保持所分析基因的起始差异。
2　结果与分析
211　cD NA文库的质量检测
参照文库构建试剂盒说明书测定原始文库滴
度为 414 ×106 pfu /mL, 重组率为 96% , 插入片段
大小主要分布在 700～1 000 bp之间。扩增文库的
滴度为 118 ×1010 pfu /mL。
212　分子伴侣 D naJ 2like基因的分离
利用 RACE的策略 , 以 cDNA文库的 1 /1 000
的稀释液为模板进行 PCR扩增 , 取 5μL 5′2RACE
扩增产物进行 112%琼脂糖胶电泳 (图 1)。
5′2RACE扩增片段特异性较好 , 大小约为
400 bp , 去除接头序列的 45 bp, 所扩增 cDNA的
5′端大小约为 350 bp。
图 1　5′2RACE结果
M: DNA marker Ⅱ; 1: 5′2RACE产物。
F ig. 1　5′2RACE result
M: DNA marker Ⅱ; 1: 5′2RACE p roduct.
213　序列分析
将所得的 5′2RACE的 PCR产物克隆测序 , 去除载体序列和引物序列后 , 在 NCB I上进行 BLAST
比对分析 , 并通过与 EST L248的重叠进行拼接。将拼接后的序列再次在 NCB I上进行 BLAST比对分
析 , 并与对应 EST序列的 BLAST比对结果进行比较以进一步验证。
L248包含一个完整的 531 bp的开放读码框架 (Open Reading Frame, ORF) , 5′端有 25 bp的非翻
译区 ( untranslate region, UTR) , 3′端具有完整的 PolyA尾 , 编码区编码 177个氨基酸 (图 2)。
该基因已在 GenBank注册 , 登记序列号为 DQ885360, 暂命名为 S tD naJ。
S tD naJ cDNA序列与拟南芥 D naJ 2like 20 cDNA ( GenBank序列号 : NM _17904512) 的部分核苷酸
序列有 84%的一致性 , 与其编码的氨基酸序列 ( GenBank序列号 : NP_19311911) 有 59%的一致性
(图 3)。
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图 2　S tD naJ 基因核酸序列及推断氨基酸序列
推导氨基酸序列标示于相应核苷酸之下 ; 非编码区用下划线标出 ;3 标示终止密码子。
F ig. 2　Nucleotide sequence and the deduced am ino ac id sequence of the pota to S tD naJ gene
The nucleotide sequence is numbered on the left; The deduced am ino acid sequence
is showed underneath the corresponding nucleotide sequence;
The un2coding region is underlined;
Stop code indicated with 3 .
图 3　马铃薯 S tD naJ 基因氨基酸序列与拟南芥 D naJ 2like 20氨基酸序列比较
F ig. 3　Com par ison of deduced am ino ac id sequences of pota to S tD naJ gene
w ith D naJ 2like 20 of A. tha liana
214　青枯病菌及茉莉酸的诱导表达分析
为研究 S tD naJ基因是否受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节及它们可能的功能 , 本试验采用半定
量 RT2PCR的方法对 S tD naJ基因在不同时间点的诱导表达进行了分析 (图 4)。
S tD naJ基因同时受青枯病菌和茉莉酸的诱导 , 但二者又有明显不同的表达模式 : 在青枯病菌诱
导下 , 该基因的表达水平缓慢升高 , 6 h时其表达量尚无明显变化 , 至 12 h时其表达量明显升至最
高 , 然后缓慢回落到其自然低水平 , 至 96 h时已基本难以检测出来 (图 4, a)。在茉莉酸的刺激下 ,
S tD naJ基因上调表达明显提前 , 处理 3 h时 , 其表达量即明显升高 , 6～12 h迅速升至最高 , 而后迅
速下降 , 至 24 h已降至很低接近自然水平 (图 4, b) , 但 36 h和 72 h时该基因的表达量又高于 24
h, 这可能与 JA处理后的取材部位或叶龄有关 , 尚需探讨。
总之 , S tD naJ基因表达的总体趋势为既受青枯病菌的诱导 , 又受茉莉酸的调节 , 均为上调。
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图 4　马铃薯叶片中 S tD naJ 基因的 RT2PCR分析
RT2PCR模板来源于不同处理、不同接种时期样品总 RNA反转录合成的 cDNA第一链 ,
并根据持家基因 A ctin在不同时间点样品的 PCR扩增量来调整 RT2PCR的起始模板用量。
图的上方标出了处理的不同时间点。a: 青枯病菌诱导处理的样品 ; b: 茉莉酸诱导处理的样品。
F ig. 4　RT2PCR ana lysis of tran scr ipt levels of S tD naJ gene in pota to leaves
cDNA was synthesized from total RNA s of different samp les harvested at different time points.
Primers for A ctin gene were used to verify that the quantity of cDNA temp late for each samp le was equal.
D ifferent time points are indicated on the top of the figure. a: Inoculated
with R alston ia solanacearum at different time points;
b: Treated by JA at different time points.
3　讨论
DnaK是热激蛋白 hsp70家族的成员 , 所编码的蛋白较为保守 , 并被认为是在进化中最保守的蛋
白之一 ( Gup ta & Singh, 1994)。但并非所有物种中都存在 hsp70 (Bult et al. , 1996) , 是什么替代了
hsp70来行使其功能尚不清楚。DnaJ是热激蛋白 hsp40家族 (也称为 J蛋白家族 ) 的成员 , 该家族的
成员对 hsp70家族成员的活性具有调节作用。 hsp70首先结合于未折叠 (如初生肽链 ) 多肽的疏水
区 , 促进蛋白的装配 ( disassembly) , 同时它也具有促使蛋白解装配 ( disassembly) 的功能 : 例如蛋
白穿膜移位过程中的解装配 , 降解一些变性后无法复性的多肽等 ( Hoskins et al. , 1998; Jensen &
Johnson, 1999)。
hsp40家族的成员可以作为 hsp70家族成员的耦合因子 ( coup ling factors) 来促使 ATP水解 , 以
调节其活性 , 如含有病毒的分子伴侣 J结构域 ( J domain) 的融合蛋白系统中 , J结构域可以稳定的
结合在组成性表达 hsp73蛋白上 , 并能够引发细胞内源性的抗原 / hsp73复合物的积累 (R iedl et al. ,
2006)。
基于序列的组成结构不同可将 DnaJ分为 Ⅰ、Ⅱ和 Ⅲ 3种类型 , 通常所说的 DnaJ同源物是指 I型
J蛋白 (Cheetham & Cap lan, 1998)。J结构域是 hsp40家族的基本特征。本文所获得的 S tD naJ基因也
具有典型的 J结构域 , 为马铃薯分子伴侣 hsp40家族的重要成员 , 也可能对分子伴侣 hsp70家族成员
的活性具有重要的调节作用。
目前研究认为 , 分子伴侣可能通过一个由 hsp90、 hsp70、Hop、 hsp40和 p23 五个蛋白组成的类
固醇受体 : hsp90的复合物装配模型来起作用。在这个复合物模型中 , hsp40通过激活 hsp70的 ATP
酶活性而扮演着重要的角色 ( Fan et al. , 2003) , 推测 S tD naJ基因也可能在这个复合物模型中具有重
要的作用。
有研究表明 hsp40在受到热激后上调表达 (Clarens et al. , 1995; Conway de Macario et al. , 1995)。
本研究中 , S tD naJ基因在青枯病菌和茉莉酸的胁迫下也均为上调 , 这是否预示着该基因与 hsp40相
似 , 在青枯病菌和茉莉酸胁迫下具有促使胁迫损害细胞恢复活性的功能及参与蛋白质组装尚需探讨。
同时这也与寄主植物的青枯病抗性对温度敏感且特异 , 在低温下表现为抗病的植株 , 多数则在高温下
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表现为感病的研究是吻合的。
在植物的抗病信号转导中 , 茉莉酸是很重要的信号分子 , 本研究中 S tD naJ基因在青枯病菌和茉
莉酸诱导下具有相似的表达模式 , 推测对于 S tD naJ基因而言 , 青枯病菌的侵染刺激和茉莉酸的诱导
在信号传递中可能共用某一成分或具有相似的信号转导途径 , 尚需进一步验证。
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