全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (4) : 853 - 858
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 12 - 12; 修回日期 : 2007 - 04 - 13
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671437) ; 教育部科技重点项目 (105089)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: nnzsl@ sina1com1cn)
12个梨品种 S基因型的鉴定
衡　伟 1 , 张绍铃 13 , 张妤艳 1 , 吴　俊 1 , 李秀根 2
(1 南京农业大学园艺学院 , 南京 210095; 2 中国农业科学院郑州果树研究所 , 郑州 450009)
摘 　要 : 应用 PCR扩增技术 , 根据目的 S基因与 GenBank中已知 S基因同源性 100%原理鉴定了我国
育成的 12个梨品种的 S基因型 , 分别是 : ‘红酥脆 ’为 S4 S36 , ‘新梨 7号 ’为 S28 Sd , ‘金水 3号 ’为 S5
S29 , ‘八月酥 ’为 S3 S16 , ‘金水 1号 ’为 S3 S29 , ‘龙泉酥 ’为 S3 S22 , ‘雪花 ’为 S4 S16 , ‘雪芳 ’为 S4 S16 ,
‘雅青 ’为 S4 S34 , ‘新雅 ’为 S4 S34 , ‘德胜香 ’为 S3 S29 , ‘富源黄 ’为 S16 S33。通过对 S基因的 DNA序列分
析 , 确认 S16、S31为同一 S基因。本研究结果丰富了我国梨品种的 S基因型信息 , 为田间合理配置授粉品种
提供了依据。
关键词 : 梨 ; 自交不亲和性 ; DNA序列分析 ; S基因型
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0420853206
Iden tif ica tion of S 2genotypes of Twelve Pear Cultivars by Ana lysis of D NA
Sequence
HENG W ei1 , ZHANG Shao2ling13 , ZHANG Yu2yan1 , WU Jun1 , and L I Xiu2gen2
(1 College of Horticulture, N anjing A gricu ltura l U niversity, N an jing 210095, China; 2 Zhengzhou Fru it Research Institu te,
Chinese A cadem y A gricultura l Sciences, Zhengzhou 450009, Ch ina)
Abstract: U sing PCR amp lification method, S 2genotypes of twelve Chinese pear cultivars were deter2
m ined. The S 2genotypes were S4 S36 for Hongsucui, S28 Sd for Xinli 7, S5 S29 for J inshui 3, S3 S16 for Bayuesu,
S3 S29 for J inshui 1, S3 S22 for Longquansu, S4 S16 for Xuehua, S4 S16 for Xuefang, S4 S34 for Yaqing, S4 S34 for
Xinya, S3 S29 for Deshengxiang, S31 S33 for Fuyuanhuang. Based on the analysis of the S gene, Itwas confirmed
that S16 and S31 were the same S gene. The study results enriched the genotype information of pear cultivars in
China, p roviding the basis for app rop riate arrangement of pollination tree in pear orchards.
Key words: Pear; Pyrus; Self2incompatibility; Analysis of DNA sequence; S 2genotype
梨品种 S基因型的鉴定可以为合理配置授粉树提供科学依据。一些学者利用田间杂交授粉试验首
先在日本梨中鉴定出 S1 ～S7等 7个 S基因及数十个梨品种的 S基因型 (Castillo et al. , 2001)。但是该
方法受外界环境和生理因素的影响很大 , 而且劳动量大 , 周期长。
为了克服这些缺点 , 人们开发出了应用分子生物学技术来鉴定 S基因型的方法。
Ishim izu等 (1996) 率先建立了一种用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 (2D2PAGE) 鉴定梨品种 S基因
型的方法 , 并利用该方法鉴定出丰水梨的 S基因型。此后 , 他们又建立了一种操作更为简单的 S位点
特异限制性内切酶法 , 鉴定出 9个日本梨品种的 S基因型 ( Ishim izu et al. , 1999)。
Kim等 (2002) 利用 PCR - RFLP和 S基因序列分析法鉴定了 15个韩国育成和 5个日本育成的梨
品种 S基因型。
Zisovich等 (2004) 利用特异引物和基因克隆的方法在西洋梨中鉴定出 7个新的 S基因。
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徐国华等 (2004)、张妤艳等 ( 2006)、乌云塔娜等 ( 2005, 2006) 及谭晓风等 ( 2006 ) 利用
PCR - RFLP系统检测和 DNA序列分析 , 分别鉴定出我国育成的部分梨品种的 S基因型。
目前我国育成的多数梨品种的 S基因型尚不清楚。
作者在本实验室建立了梨 S 基因型鉴定技术体系的基础上 (徐国华 等 , 2004; 张妤艳 等 ,
2006) , 快速、准确的对我国十多个主栽梨品种的 S基因型进行了鉴定 , 为指导这些梨品种授粉树的
配置和杂交育种时亲本的选配提供参考。
1　材料与方法
111　试验材料
供试品种为 : ‘新梨 7号 ’, ‘红酥脆 ’, ‘金水 3号 ’, ‘八月酥 ’, ‘金水 1号 ’, ‘龙泉酥 ’, ‘雪
花’, ‘雪芳 ’, ‘雅青 ’, ‘新雅 ’, ‘德胜香 ’, ‘富源黄 ’, ‘菊水 ’, ‘丰水 ’, ‘晚三吉 ’, ‘今村秋 ’
等 (表 1)。
2004年和 2005年春季从南京农业大学江浦园艺场和中国农业科学院郑州果树研究所梨品种资源
圃采集各品种幼嫩叶片 , 液氮中保存备用。
112　试验方法
利用改良的 CTAB法提取各品种基因组 DNA (徐国华 等 , 2004 )。80 V电压下 , 取 2μL基因组
DNA在 018%琼脂糖凝胶上电泳 , 紫外检测 DNA的纯度和完整性 , 并于 - 20℃保存备用。
参考 Ishim izu等 ( 1999 ) 的方法合成 PCR扩增引物。正向引物 : FTQQYQ ( 5′2TTTAC GCAGC
AATAT CAG23′) , 反向引物 : IIW PNV (5′2ACA /GTT CGGCC AAATA ATT23′)。
PCR反应所用 TaqDNA聚合酶购自宝生物工程 (大连 ) 有限公司。参考本实验室的反应程序
(徐国华 等 , 2004; 张妤艳 等 , 2006) , 应用 PTC2200扩增仪进行扩增。取 PCR产物 5μL, 112%
琼脂糖凝胶电泳检测扩增图谱。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( polyacrylam ide2gel electrophoresis, PAGE) 进行分离、回收扩增片段 ,
并将回收片段进行二次扩增。
PCR产物经 112%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带的有无。
将 S基因目的片段二次扩增产物克隆到 TA载体 (pGEM 2T Easy vector system; Promega, W I) , 其
DNA序列由上海英骏公司测定。
测序结果在 NCB I中利用 BLAST与 GenBank + EMBL + DDBJ + PDB等数据库的已知序列进行比
较 , 再应用 DNAMAN对 DNA序列进行分析 , 进而确定其 S基因型。
2　结果与分析
211　梨品种 S基因型鉴定
供试梨品种均可扩增出两条 S基因特异的条带 , 用聚丙烯酰胺凝胶电泳对 PCR产物进行分离 ,
片段大小大多在 330～540 bp之间 (图 1)。
用 ‘菊水 ’ (S2 S4 )、‘丰水 ’ (S3 S5 )、‘晚三吉 ’ ( S5 S7 ) 和 ‘今村秋 ’ ( S1 S6 ) 4个已知 S基因
型的日本梨品种作为参照 , 这些梨品种中 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7基因的片段大小分别为 367、
1 347、376、368、376 、347、352 bp ( Ishim izu et al. , 1999)。
对各品种的 S基因特异条带进行测序后 , 经过 DNA序列比较分析 , 依据 S基因相同时其 DNA序
列同源性应为 100%的原理 , 通过对比已知 S基因与供试品种 S基因的 DNA序列来确定各品种的 S基
因型。
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　4期 衡 　伟等 : 12个梨品种 S基因型的鉴定 　
图 1　S基因特异性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
1. 新梨 7号 ; 2. 红酥脆 ; 3. 菊水 ; 4. 丰水 ; 5. 金水 3号 ; 6. 八月酥 ; 7. 金水 1号 ; 8. 龙泉酥 ; 9. 晚三吉 ;
10. 雪花 ; 11. 雪芳 ; 12. 雅青 ; 13. 新雅 ; 14. 德胜香 ; 15. 富源黄 ; 16. 今村秋 ; M: PBR322 DNA /M SPⅠmarker。
F ig. 1　The PAGE pa ttern s of the S gene products am plif ied spec if ica lly
1. Xinli 7; 2. Hongsucui; 3. Kikusui; 4. Housui; 5. J inshui 3; 6. Bayuesu; 7. J inshui 1; 8. Longquansu; 9. Okusankitsu;
10. Xuehua; 11. Xuefang; 12. Yaqing; 13. Xinya; 14. Deshengxiang; 15. Fuyuanhuang; 16. Imamuraaki;
M: PBR322 DNA /M SPⅠmarker.
本研究结果 : ‘红酥脆 ’的 S基因型为 S4 S36 , ‘新梨 7号 ’为 S28 Sd , ‘金水 3号 ’为 S5 S29 , ‘八
月酥 ’为 S3 S16 , ‘金水 1号 ’为 S3 S29 , ‘龙泉酥 ’为 S3 S22 , ‘雪花 ’为 S4 S16 , ‘雪芳 ’为 S4 S16 , ‘雅
青 ’为 S4 S34 , ‘新雅 ’为 S4 S34 , ‘德胜香’为 S3 S29 , ‘富源黄 ’为 S16 S33 (表 1)。
表 1　12个梨品种 PCR片段长度、S基因型及其亲本
Table 1　The PCR fragm en t size and S 2genotypes of twelve pear cultivars and the ir paren ts
品种
Cultivars
种名
Species
PCR片段长度
The PCR fragment size ( bp)
S基因型
S 2genotypes供试品种的亲本Parents of the cultivars tested
新梨 7号 Xinli 7 Pyrus bretschneideri Rehd. 426 /368 S28 S d 库尔勒香梨 Kuerle Xiangli(S8 S28 ) ×
早酥 Zaosu (SxS x )
红酥脆 Hongsucui P. pyrifolia (Burm. f. ) Nakai 368 /536 S4 S36 幸水 Kohsui(S4 S5 ) ×火把梨 Huobali(S xS x )
金水 3号 J inshui 3 P. pyrifolia 376 /347 S5 S29 江岛 Ejima (SxS x ) ×麻壳 Make (S xS x )
八月酥 Bayuesu P. bretschneideri 376 /345 S3 S16 栖峡大香水 Q ixiada Xiangshui(S xS x ) ×
郑州鹅梨 Zhengzhou Eli(SxS x )
金水 1号 J inshui 1 P. pyrifolia 376 /347 S3 S29 长十郎 Choujro (S2 S3 ) ×江岛 Ejima (S xS x )
龙泉酥 Longquansu P. pyrifolia 376 /347 S3 S22 金水 2号 J inshui 2 (SxS x ) ×
崇化大梨 Chonghua Dali(S xS x )
雪花 Xuehua P. bretschneideri 368 /345 S4 S16 不详 Unknown
雪芳 Xuefang P. pyrifolia 368 /345 S4 S16 雪花 Xuehua (S4 S16 ) ×新世纪 Shinseiki (S3 S4 )
雅青 Yaqing P. bretschneideri 368 /341 S4 S34 鸭梨 Yali(S21 S34 ) ×杭青 Hangqing(S xS x )
新雅 Xinya P. pyrifolia 368 /341 S4 S34 新世纪 Shinseiki(S3 S4 ) ×鸭梨 Yali (S21 S34 )
德胜香 Deshengxiang P. bretschneideri 376 /347 S3 S29 不详 Unknown
富源黄 Fuyuanhuang P. pyrifolia 345 /531 S16 S33 不详 Unknown
　　注 : S x表示 S基因尚未确定。
Note: S x rep resents the unidentified S gene.
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212　东方梨 (白梨和砂梨 ) 与西洋梨部分 S基因的氨基酸序列比较
为了探讨东方梨 (白梨和砂梨 ) 和西洋梨品种 S基因氨基酸序列的差异 , 作者应用 DNAMAN软
件比较了东方梨 (白梨和砂梨 ) 中 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S17、S19、S20、S22、S26、
S28、S29、S31等 S基因和西洋梨的 Sb、Sd、Sh、S i、S j、Sk、Sm、Sn、So、Sp 等 S基因 (图 2)。
结果表明 : 东方梨 (白梨和砂梨 ) 与西洋梨的 S基因有着相同的保守区域和高变区域 , 并与蔷
薇科其它属植物的 S基因氨基酸序列的基本结构一致。
但由于我们测出的中国育成的梨品种的 S基因序列较短 , 仅得到 C1、C2、RHV区域 ; 在西洋梨
品种 S基因间的氨基酸序列同源性为 66% ～97% ; 东方梨品种的 S基因间氨基酸序列除 S8与 S28基因
的同源性为 99%外 , 其余在 67% ～94%之间。
通过对西洋梨与东方梨 (白梨和砂梨 ) 中的 S基因氨基酸序列之间同源性比较 , S22与 Sh、S9与
So 和 S7与 Sn 基因相对应部分氨基酸序列同源性分别为 100%、100%和 98132%。
图 2　梨 S基因氨基酸序列比较
F ig. 2　Com par ison of deduced am ino ac id sequences of S 2gene fragm en ts in Pyrus
213　S16和 S31基因 D NA序列的比较
本研究对雪花、雪芳梨品种中 S基因 DNA序列进行了比较分析 , 结果表明 : 雪花、雪芳梨中均
有一个 S基因与 S31基因的 DNA序列 (DQ072113) 同源性为 100% , 因此确定它们均含有 S31基因 ;
该 S基因与 S16基因 (AY249431) 相对应部分 DNA序列同源性也为 100%。
对 S16、S31基因进行比较的结果表明 : S16比 S31在 5′和 3′端各缺少 22 bp, 其中 18 bp为引物序列 ,
二者内含子和对应编码区完全相同。
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　4期 衡 　伟等 : 12个梨品种 S基因型的鉴定 　
　　所以本研究认为 S16和 S31为同一 S基因。但是 S16比 S31基因在 GenBank中登录较早 , 所以认为雪
花和雪芳两品种的 S基因型应该为 S4 S16。
3　讨论
本研究应用 PCR技术和对 S基因特异性扩增条带的测序 , 通过 DNA序列分析确定了 12个中国
育成的梨品种 S基因型。
从迄今的文献资料看 , 国内外已经明确的梨属植物 S 基因 , 白梨至少有 S1、S3、S4、S7、S8、
S11、S12、S13、S16、S17、S18、S19、S20、S21、S22、S26、S27、S28、S29、S31、Sd 等 21个 S 基因 ; 砂梨
至少存在 S1、S2、S3、 S4、S5、S6、 S7、S8、S9、 S11、S12、S13、S14、S15、 S16、S17、S21、S22、S26、
S29等 20个 S基因 ; 西洋梨有 Sa、Sb、Sc、Sd、Se、Sh、S i、S j、Sk、S l、Sm、Sn、So、Sp、Sq、S r、S t
等 17个 S基因。
为了更好的理解东方梨 (白梨和砂梨 ) 与西洋梨之间的亲缘关系 , 我们对氨基酸序列同源性高
的 S22与 Sh 基因 , S7与 Sn 基因和 S9与 So 基因的核苷酸序列进行了比较。结果表明 : S22与 Sh 基因相对
应的 345 bp中均含有一个 148 bp的内含子 , 仅内含子中存在 2 bp的差异 , 外显子序列完全相同 , 同
源性为 99142% ; 在 S7、Sn 基因相对应的 537 bp外显子中存在 4 bp的差异 , 同源性为 99126% , 二者
氨基酸序列在高变区完全相同 ; 同样在 S9与 So 基因相对应的 537 bp外显子中存在 8 bp的差异 , 同源
性为 98151%。
因此可以推测 , S22与 Sh , S7与 Sn 和 S9与 So 基因分别为同一 S基因 , 只是在东方梨各个种内与西
洋梨存在不同的命名方式而已。当然这还需要有进一步的试验证据来证明。这些结果也表明 , 东方梨
中的白梨和砂梨与西洋梨种间 S基因存在很高的同源性 , 说明 S基因的分化应该存在梨属各个种形成
之前。
在中国梨品种中存在日本梨品种的多个 S基因也说明了中国梨品种与日本梨品种有着很近的亲缘
关系 , 这也为日本梨起源于中国提供了分子生物学的证据 (滕元文 等 , 2004)。
‘新梨 7号 ’中一条 S 基因特异性条带的 DNA序列与西洋梨中 Sd 基因相对应部分的同源性为
100% , 因此认为该 S基因为 Sd。Sd 基因是以色列 Zisovich等 (2004) 在西洋梨品种 ‘Kalle’中发现
的 , 中国梨品种 ‘新梨 7号’与西洋梨品种 ‘Kalle’含有相同的 S基因 , 表明二者有共同的祖先。
‘新梨 7号 ’ (S28 Sd ) 是母本 ‘库尔勒香梨 ’ (S21 S28 ) (张妤艳 等 , 2006) 与父本 ‘早酥 ’
(Sx Sx ) 的杂交后代 , 其 S28基因是来源于母本的 , 而 Sd 基因应该来源于父本 ‘早酥 ’。母本 ‘库尔勒
香梨 ’是西洋梨种与白梨种杂交后代 ; ‘早酥 ’是 ‘苹果梨 ’与西洋梨品种 ‘身不知 ’的杂交后代 ,
可见 ‘新梨 7号’与西洋梨有较近的亲缘关系。
到目前为止 , 在梨属植物中发现的 S基因共有 56个。日本梨品种中有 S1 ～S9等 9个 S基因 ; 韩
国的砂梨品种中新发现了 1个 S10基因 ; 在中国的梨品种中新发现了 S11 ～S39等 29个 S基因 ; 西洋梨
中报道了 17个 S基因 , 其中来自中国育成的西洋梨品种的 S基因有 1个。从这些统计数据可知 , 中
国育成的梨品种中已发现 30个新的 S基因 , 占迄今公布的梨 S基因总数的 50%以上 , 说明中国梨品
种具有丰富的遗传变异。
大量新 S基因的不断发现 , 为更快地利用分子手段鉴定梨品种的 S基因型提供了便利 , 同时也为
国内外梨新品种的选育、种质资源的创新提供了参考。
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