全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 767 - 770
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 02 - 01; 修回日期 : 2007 - 04 - 23
基金项目 : 中德农业合作项目 (2001 /2002)3 E2mail: yhdin@ sina1com
致谢 : 本试验得到 A lmut Garve女士的大力协助 , 在此深表感谢。
甘蓝型油菜―萝卜附加系中萝卜染色体的 ( dp)
RAPD标记
丁云花 13 , BUDAHN Holger2 , 简元才 1 , PETERKA Herbert2
(1 国家蔬菜工程技术研究中心 , 北京 100097; 2 德国栽培作物育种研究中心 , Quedlinburg D206484)
摘 　要 : 在已掌握甘蓝型油菜―萝卜附加系染色体构成 , 并构建萝卜分子连锁图谱的基础上 , 以甘蓝
型油菜―萝卜附加系为材料 , 利用 ( dp) RAPD分子标记技术 , 筛选附加系中外源萝卜 9条染色体 (A～ I)
的分子标记 , 为进一步研究萝卜染色体与连锁群对应关系奠定基础。试验筛选了 576个随机引物 (组合 ) ,
有 413个能从附加系中扩增出萝卜染色体的 ( dp ) RAPD标记 , 平均有效引物 (组合 ) 占 7117% , 其中
RAPD反应有效引物率 6717% , dpRAPD 反应有效引物率 7312%。试验共得到 899个萝卜染色体 ( dp )
RAPD标记 , 包括 354个 RAPD标记和 545个 dpRAPD标记 , 覆盖萝卜整个基因组的全部 9条染色体 , 不同
染色体的标记数目变化范围在 41～160, 其中最多的是染色体 C, 最少的是染色体 I。
关键词 : 萝卜 ; 甘蓝型油菜 ; 附加系 ; 染色体 ; ( dp) RAPD
中图分类号 : S 63111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320767204
Rad ish Chrom osom e2spec if ic ( dp ) RAPD M arkers Screened from Rape2
rad ish Add ition L ines
D ING Yun2hua13 , BUDAHN Holger2 , J IAN Yuan2cai1 , and PETERKA Herbert2
(1N ational Engineering Research Cen tre for V egetable, B eijing 100097, China; 2 Federa l Centre for B reed ing Research on Culti2
vated Plants, Q ued linburg D 206484, Germ any)
Abstract: In p revious researches, a series of rape2radish addition lines with known additional radish
chromosomes and a linkage map of oil radish consisting of 9 group s have been developed. To study the assign2
ment between the linkage group s and the chromosomes of radish, this work was carried out to screen radish
chromosome2specific molecular markers from rape2radish addition lines by means of ( dp ) RAPD technology so
as to integrate radish chromosome markers into the linkage group s in further research. 576 decamer p rimers
and pair2p rimers were tested to identify molecular markers for radish chromosomes (A - I). A s a result, 413
p rimers and pair2p rimers were effectual to amp lify radish chromosome2specific ( dp) RAPD markers, the effec2
tual p rimers (pair2p rimers) occup ied averagely 7117%. This ratio in p rotocol of RAPD was 6717% , and that
in dpRAPD was 7312%. A ltogether 899 ( dp) RAPD markers for all 9 chromosomes of radish were obtained,
including 354 RAPD markers and 545 dpRAPD markers. The number of markers for individual chromosome
varied from 41 for chromosome I to 160 for chromosome C.
Key words: Radish; Rape; Addition line; Chromosome; ( dp) RAPD
萝卜中存在多种抗源和优异材料 , 至今已有多种有益基因被挖掘利用 , 如细胞质雄性不育基因
O gu cm s、抗根肿病基因等均已在甘蓝型油菜、甘蓝、花椰菜等蔬菜作物中利用 (Ogura, 1968; Pel2
letier et al. , 1983; Hagimori et al. , 1992)。
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
为了将萝卜中抗线虫基因转移至甘蓝型油菜 , Peterka等 ( 2004) 通过远缘杂交获得系列甘蓝型
油菜―萝卜附加系 , 每个附加系含 19条甘蓝型油菜染色体和 1条或 3条萝卜染色体。在此基础上 ,
Moussa (2004) 利用 F2群体构建了由 9个连锁群组成的萝卜分子图谱。连锁群是生物染色体在分子
水平的反映。
为了搞清萝卜 9个连锁群与其 9条染色体之间的对应关系 , 作者试图从甘蓝型油菜―萝卜附加系
中筛选萝卜 9条染色体的分子标记 , 为进一步进行染色体在连锁群上的定位研究奠定基础。
1　材料与方法
111　试验材料
试验材料包括附加系的供体萝卜 (A24 /2和 A107 /1) , 受体甘蓝型油菜 (A3 /1和 A246 /1) , 一套
甘蓝型油菜―萝卜多体附加系 st11 (附加萝卜染色体 B、D和 E) , st12 ( E、G和 I) , st13 (A、B和
F) , st14 (D、G和 H) , st15 ( F、H和 I) , st16 (B、C和 F) , st17 (A、C和 H ) 和 st18 (A、E和
I) , 一套甘蓝型油菜―萝卜单体附加系 A2 /824 (附加萝卜染色体 A ) , B2 /11221 (B ) , C3 /26221 (C) ,
D3 /3322 (D) , E1 /9 (E) , F1 /54241 ( F) , G1 /621 ( G) , H1 /8 (H) 和 I4 /1525 ( I)。每个附加系所附加
的萝卜染色体均已知 (Peterka et al. , 2004)。
112　试验方法
DNA 提取方法参考 Dellaporta等 ( 1983) 的报道 , 采用 RAPD - PCR和双引物 ( double2p rimer)
dpRAPD - PCR扩增 , 前者产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 , 后者由 RAPD - PCR演变而来 , 即在一
个 PCR反应中同时加入等量的两个随机引物对模板进行扩增 , 其中一个引物标记荧光 , 使得扩增产
物既可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 , 还可以用 Genetic Analyzer (AB I Prism 310) 分离 , 具体操作步
骤见丁云花等 (2004) 的报道。
本试验使用了 3个分别标记 3种不同荧光的随机引物 : OPD11FAM (蓝色 )、OPG19Tet (绿色 )
和 OPH15Hex (黑色 ) , 在 PCR反应中取一个普通随机引物与该 3个荧光标记引物中的一个配组 , 等
量加入反应混合物。
2　结果与分析
211　萝卜染色体 ( dp) RAPD标记的确定
由于每份材料所含萝卜染色体的情况均已知 , 因此萝卜染色体的 ( dp ) RAPD标记可根据材料中
已知萝卜染色体附加情况来判定。
如已知材料中只有供体萝卜 A24 /2和 A107 /1、甘蓝型油菜―萝卜附加系 st11、 st14和 D3 /3322
含萝卜 D染色体 , 当 PCR产物中这几份材料都扩增出了某片段 , 而其它材料中没有扩出时 , 该片段
就可以确定为萝卜 D染色体所特有的扩增产物。
为了保证试验结果的可靠性 , 试验安排了两套附加系 : 甘蓝型油菜―萝卜多体附加系和甘蓝型油
菜―萝卜单体附加系 , 扩增片段只有在两套附加系中结果一致的情况下才被认定为是某染色体的标
记 , 如果只在一套附加系中扩增出来 , 而另一套相应染色体附加系中没有扩出 , 则该片段不能认为是
某染色体的标记。
如图 1为双引物组合 OPE05 +OPG19Tet的扩增结果 , 在第一套附加系的 st11和 st14两份材料中
扩出了大小为 587 bp的片段 , 在第二套附加系的 D3 /3322中也扩出了该片段 , 2个萝卜供体 A24 /2和
A107 /1也有该片段 , 所以它就可以判定为萝卜 D染色体的 dpRAPD标记 , 记为 OPE05 + OPG19Tet2
587 (D)。
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　3期 丁云花等 : 甘蓝型油菜―萝卜附加系中萝卜染色体的 ( dp) RAPD标记 　
图 1　萝卜 D染色体的 dpRAPD标记 O PE05 +O PG19Tet2587 ( D )
F ig. 1　dpRAPD marker O PE05 +O PG19Tet2587 for rad ish chrom osom e D
M, P1 , P2 , P3 , P4 , 1 - 17: Rep resent 100 bp DNA ladder, A24 /2, A107 /1, A3 /1, A246 /1,
st11, st12, st13, st14, st15, st16, st17, st18, A2 /824, B2 /11221,
C3 /26221, D3 /3322, E1 /9, F1 /54241, G1 /621, H1 /8, 4 /1525, respectively.
212　引物的筛选
试验用了 576个随机引物 (组合 ) , 包括 235个单引物和 341个双引物组合 , 其中有 413个能从
附加系中扩增出萝卜染色体 ( dp) RAPD标记 , 平均有效引物 (组合 ) 占 7117%。
应用于 RAPD反应的 235个随机引物中有 159个能扩出染色体 ( dp ) RAPD标记 , 有效引物占
6717%。
在 dpRAPD反应中 , 有 139个引物与荧光标记引物 OPD11FAM配组 , 其中 112个能扩出萝卜染
色体标记 , 占 8016% ; 有 138个引物与 OPG19Tet配组 , 其中 99个能扩出萝卜染色体标记 , 占
7117% ; 有 64个引物与 OPH15Hex配组 , 其中 43个能扩出萝卜染色体标记 , 占 6712%。因此 ,
dpRAPD反应中平均引物有效率为 7312% , 略高于常规 RAPD方法。
各种方法产生的单引物 (组合 ) 标记数也稍有差异 , 但不明显 (表 1)。
表 1　萝卜染色体 ( dp) RAPD标记的引物 (组合 ) 筛选
Table 1　Screen ing of pr im ers ( pa ir2pr im ers) to am plify rad ish chrom osom e2spec if ic ( dp) RAPD markers
标记方法
Protocols
引物 (组合 )数
Number of
p rimers
(pair2p rimers) 有效引物 (组合 )数Number ofeffectual p rimers(pair2p rimers) 引物 (组合 )有效率Ratio ofeffectual p rimers(pair2p rimers) ( % ) 萝卜染色体标记数Number ofradish chromosomemarkers 单引物 (组合 )标记数Number of markersper p rimer(pair2p rimer)
RAPD 235 159 6717 354 212
dpRAPD +OPD11FAM
　　　 +OPG19Tet
　　　 +OPH15Hex
139
138
64
112
99
43
8016
7117
6712 25920878 213211118
合计 Total 576 413 7117 899 212
用 Genetic Analyzer分离 PCR产物 , 虽然只能检测带荧光的 DNA片段 , 但它一次可以同时分析 3
个带不同荧光的 PCR产物 , 检测 DNA片段大小范围在 35～500 bp。
用 4%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 PCR产物 , 理想的检测范围是 200～2 000 bp, 每次电泳只能分
析 1个扩增产物 , 但产物不管是否带有荧光标记 , 都能检测出来。
所以 , 本试验结合 RAPD和 dpRAPD两种方法筛选附加系中萝卜染色体的分子标记 , 可以提高引
物的利用和工作效率。
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
213　萝卜染色体的 ( dp) RAPD标记
　　整个试验共筛选出 899 个萝卜染色体的
( dp) RAPD标记 , 包括 354个 RAPD 标记和 545
个 dpRAPD标记。
这些标记覆盖萝卜基因组的全部 9条染色体
A、B、C、D、E、F、G、H和 I。
因为 ( dp) RAPD引物扩增的随机性 , 不同染
色体的标记数目有明显差异 , 其中最多的是染色
体 C, 有 160个标记 , 占总数的 1718% ; 其次是
染色体 E, 有 123个 , 占 1317% ; 而染色体 H只
有 47个 , 占 512% ; 最少的是染色体 I, 41个 ,
占 416% (表 2)。
在已发表的有关萝卜连锁图谱的研究结果中 ,
表 2　萝卜基因组 9条染色体 ( A～ I) 的 ( dp) RAPD标记
Table 2　The ( dp) RAPD markers spec if ic for
rad ish chrom osom es
染色体
Chromosome
分子标记数
Number of markers
占总数比例
Percentage ( % )
A 115 1218
B 110 1212
C 160 1718
D 90 1010
E 123 1317
F 112 1215
G 101 1112
H 47 512
I 41 416
合计 Total 899
未见有萝卜分子连锁群的染色体归属关系的报道 ( Kirstin & Derek, 2004; Moussa, 2004)。
本研究利用已知染色体构成的甘蓝型油菜―萝卜附加系 , 找到了萝卜全部 9条染色体的 ( dp )
RAPD标记。下一步通过这些标记在萝卜分子连锁群上的定位就可知道连锁群与染色体的对应关系 ,
因此本试验结果对研究萝卜连锁群的染色体归属关系具有重要意义。
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