全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (5) : 947～952
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 01 - 23; 修回日期 : 2006 - 03 - 09
基金项目 : 国家 863课题 (2001AA241142) ; 广东省科技攻关资助项目 (2003B21601) ; 湖北省攻关计划 (2006AA203B05)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: gpwang@mail1hzau1edu1cn; yiganjun@vip11631com)
柑橘黄龙病、裂皮病和衰退病病原的多重 RT2PCR
检测
丁　芳 1, 2 　曹　庆 2 　王国平 13 　易干军 23 　钟　云 2
(1 华中农业大学植物科学技术学院 , 湖北武汉 430070, 2 广东省农业科学院果树研究所 , 广东广州 510640)
摘 　要 : 建立了一种同时检测柑橘黄龙病病原类细菌 ( Cand ida tus L iberibacter asiaticus, HLB )、柑橘
裂皮类病毒 (C itrus exocortis viroid, CEVd)、柑橘衰退病病毒 ( C itrus tristeza virus, CTV ) 的多重 RT2PCR
技术体系。运用根据 3种病原核苷酸保守区序列设计的特异性引物 , 成功的对同一样品中的 HLB、
CEVd、CTV进行多重 RT2PCR扩增 , 得到 1 160 bp、371 bp、273 bp 3条特异性大小与试验设计相符的条
带。就影响多重 PCR的主要因素引物浓度和退火温度进行了一系列优化 , 建立了能同时检测 HLB、
CEVd、CTV的多重 RT2PCR技术体系。该体系最低能从 10 pg总 RNA中检测出黄龙病类细菌和柑橘裂皮
类病毒 , 从 1 pg总 RNA中检测到柑橘衰退病毒。对采自田间 37份材料的实际检测表明 : 存在两种或 3
种病原的复合侵染。
关键词 : 柑橘 ; 多重 RT2PCR; 黄龙病 ; 裂皮病 ; 衰退病 ; 检测
中图分类号 : S 666　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0520947206
Stud ies on the S im ultaneous D etection of C itrus Huanglongb ing Pa thogen,
C itrus exocortis viro id, C itrus tris teza virus by M ultiplex RT2PCR
D ing Fang1, 2 , Cao Q ing2 , W ang Guop ing13 , Yi Ganjun23 , and Zhong Yun2
( 1 Plant Science and Technology A cadem y, Huazhong A gricultural U niversity, W uhan, Hubei 430070, Ch ina; 2 Insititu te of Fru it
Tree Research, Guangdong A cadem y of A gricu ltura l Sciences, Guangzhou, Guangdong 510640, Ch ina)
Abstract: A multip lex RT2PCR was successfully established to simultaneously detect C itrus Huanglong2
bing pathogen (Cand ida tus L iberibacter asiaticus, HLB ) , C itrus exocortis viroid (CEVd) and C itrus tristeza
virus (CTV ). U sing three sets of specific p rimers designed according to the converted sequences of these three
pathogens respectively, expected fragments of 1 160 bp (HLB ) , 371 bp (CEVd) and 273 bp (CTV ) were
successfully amp lified by this multip lex RT2PCR systerm. To op tim ize the multip lex RT2PCR, the concentra2
tion of p rimers and annealing temperature were repeatedly tried. Final results showed that a multip lex RT2PCR
system to simultaneously detect HLB , CEVd and CTV was firstly established successfully. Sensibility test
showed: it could detect out HLB , CEVd in 10 pg, and CTV in 1 pg total RNA respectively. To confirm the
utilization of the multip lex RT2PCR system, 37 samp les collected from field were tested. The results showed:
two or three pathogens m ix2infection was in existence in fields.
Key words: C itrus; Multip lex RT2PCR; Huanglongbing; C itrus exocortis viroid; C itrus tristeza virus;
Detection
据资料显示 , 世界上已报道的柑橘病毒病和类似病毒病大约 80余种〔1〕, 其中柑橘黄龙病、柑橘
裂皮病、柑橘衰退病是威胁我国柑橘生产的三大主要病害。我国的柑橘黄龙病 ( Huanglongbing,
HLB) 病原属于韧皮部杆菌属类细菌 (Cand ida tus L iberibacter asiaticus) , 纯培养尚未获得成功〔2〕, 只
有部分基因组 DNA序列成功测序〔3, 4〕。柑橘裂皮病由柑橘裂皮类病毒 (C itrus exocortis viroid, CEVd )
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
引起 , 致病因子为低分子量的共价闭合环状 RNA〔5〕。柑橘衰退病毒 (C itrus tristeza virus, CTV ) 是长
线性病毒科 (Closteroviridae) 长线性病毒属 (C losterovirus) 的一种正义单链 RNA病毒〔6, 7〕。对于这 3
种病原的检测 , 国内外已有很多相关的报道〔8～11〕, 但未见在一个体系中对 3种病原同时进行检测的
报道。作者在前人研究的基础上 , 通过摸索各主要因素对多重 RT2PCR的影响 , 初步建立了一种同时
检测 HLB、CEVd、CTV病原的多重 RT2PCR技术体系 , 以期为该 3种病原的检测提供快速、简便、
灵敏的方法。
1　材料与方法
111　材料
感染黄龙病菌的供试材料为红江橙 (Citrus sinensis ×C. reticu la ta) 和 　柑 (C. reticula ta B lanco ) ,
采自广东杨村华侨柑橘场 ; 萝岗甜橙 (C. sinensis O sb. ) 采自广东萝岗农业技术推广中心。感染衰退病
毒的甜橙 (C. sinensis O sb. ) 由广东省农业科学院果树研究所提供 ; 北京柠檬 (C. lim on Burm. f) 采
自海南万宁新中农场。感染裂皮类病毒的柑橘材料为暗柳橙 (C. sinensis O sb. )、　柑 , 由华中农业大
学国家果树脱毒种质资源室内保存中心提供。均以上述品种的叶片为阳性材料 ; 以健康的红江橙实生苗
叶片为阴性对照材料。田间材料分别于 2003年 4月 , 2003年 10月 , 2004年 8月集中采具明显症状的叶
2～3片 ; 来自江西的纽荷尔脐橙 (Newhall navel orange) 由深圳白果园公司江西安远果业基地提供。
112　柑橘 HL B、CEVd、CTV RNA 的提
取及 RT2PCR扩增体系的建立
HLB、CEVd、CTV 的 RT2PCR 引物见
表 1。
RNA的提取按 Trizol RNA 提取试剂盒
(北京鼎国生物技术有限责任公司 ) 说明书
进行。
RT反应体系 : 5 ×Buffer 4 μL, dNTPs
015 mmol /L , 9RNA酶抑制剂 20 U , 反义引 表 1　RT2PCR引物Table 1　Pr im er sets used for RT2PCR病原Pathogen 引物对序列Sequence of p rimer pair 片段大小Fragmentsize ( bp) 参考文献ReferenceHLB 5pi2GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA23pi 1 160 125pi2GCGTCGCGACTTCGCAACCCAT23piCEVd 5pi2CCGGGGATCCCTGAAGGACTT23pi 　371 135pi2GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG23piCTV 5pi2AACGCCCTTCGAGTCTGGGGTAGGA23pi 　273 145pi2TCAACGTGTGTTGAATTTCCCAAGC23pi
物 0125μmol/L , M 2MLV反转录酶 50 U , 总 RNA 5μL, DEPC处理水补足总体积 20μL。RT反应程
序 : 42℃温育 60 m in, 95℃酶灭活 3 m in, 立即置于冰上 , 4℃保存备用。
PCR扩增体系 : 10 ×Buffer 215μL, dNTPs 200μmol/L, 同源引物与互补引物各 014μmol/L ,
Taq DNA聚合酶 110 U , 模板 cDNA 110μL, 灭菌双蒸水补足总体积 25μL。
单一 RT2PCR扩增程序 , HLB为 95℃ 3 m in, 95℃ 1 m in, 65℃ 1 m in, 72℃ 2 m in, 35个循环后
72℃延伸 10 m in。CEVd为 95℃ 3 m in, 95℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 30个循环后 72℃延伸 10
m in。CTV为 95℃ 3 m in, 95℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 30 s, 30个循环后 72℃延伸 10 m in。
113　多重 RT2PCR反转录体系
RT体系各成分依次为 : 5 ×Buffer 5μL, dNTPs 110 mmol/L, RNA酶抑制剂 40 U, 互补引物各
0125μmol/L , M 2MLV反转录酶 100 U , 总 RNA各 5μL, DEPC处理水补足总体积 25μL。反应程序 :
42℃温育 60 m in, 95℃酶灭活 5 m in, 立即置于冰上 , 4℃保存备用。试验均在 MJ Research公司 PTC2
100 PCR扩增仪上进行。
114　多重 RT2PCR体系的最佳引物浓度组合与退火温度优化
HLB ( PH ) , CEVd ( PCEVd ) , CTV ( PCTV ) 不同的引物浓度 (μmol/L ) 组合共设定 15种 (图 4)。
根据 3对引物的 Tm值设定退火温度为 63℃、61℃、59℃、57℃和 55℃。
115　多重 RT2PCR产物的检测、克隆和测序
分别将抽提的 HLB、CEVd、CTV总 RNA, 用紫外分光光度计测定浓度后 , 调整浓度为 10 ng/
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　5期 丁 　芳等 : 柑橘黄龙病、裂皮病和衰退病病原的多重 RT2PCR检测 　
μL, 再以 10倍梯度稀释 , 然后采用最佳引物组合和最佳多重 RT2PCR反应模式进行扩增 , 以检测该
体系的敏感性。
取 510μL多重 RT2PCR产物加 110μL上样缓冲液 , 在 115 %的琼脂糖凝胶 (含 EB 015μg/
μL) , 1 ×TBE电泳缓冲液中 , 100 V电压下电泳。B io2Rad凝胶成相系统拍照 , 记录结果。
PCR扩增的靶 DNA 片段经 PCR Fragment Recovery Kit (鼎国 ) 回收纯化 , 与 pMD182T Vector
(TaKaRa) 连接后转化 E1coli JM109菌株感受态细胞 , 经蓝白斑筛选 , 挑取白色菌落进行培养。经
PCR鉴定获得重组质粒 , 交上海生工生物工程公司进行测序 , 测序结果运用NCB IB last进行同源性搜索。
116　多重 RT2PCR体系的实际运用
运用所建立的多重 RT2PCR体系对采自田间的 37份样品材料进行了检测 , 其中包括来自广东萝
岗的 10个带有明显 HLB症状的材料 , 来自江西的 12个纽荷尔脐橙材料 , 来自广东杨村柑桔场柑桔
研究所的 8个红江橙材料 , 来自海南的 7个北京柠檬材料。
2　结果与分析
211　柑橘 HL B、CEVd、CTV单一 RT2PCR扩增体系的建立
本试验成功建立了柑橘 HLB、CEVd、CTV单一 RT2PCR扩增体系。图 1为对 HLB材料的检测 ,
在阳性材料中均得到了目的片段 1 160 bp, 阴性对照中无。图 2和图 3分别是对 CEVd和 CTV阳性材
料的检测 , 都得到了预期的目的片段 371 bp和 273 bp, 而阴性对照中无对应目的带出现。
图 1　HL B材料的 RT2PCR检测
1: HLB红江橙 ; 2: 健康红江橙 ; 3: HLB萝岗甜橙 ;
4: HLB 　柑。
F ig. 1　RT2PCR detection of three HL B sam ples
1: HLB Hongjiang sweet orange; 2: Healthy sweet orange;
3: HLB Luogang sweet orange; 4: HLB Ponkan. M: 100 bp
DNA ladder marker Ⅴ ( SD014, D ingguo) .
212　不同引物浓度对多重 RT2PCR体系的影响
通过多次不同引物浓度 (μmol/L ) 组合试验
发现 (图 4) , 在相同的退火温度 59℃下 , 组合 5
( PH 016, PCEVd 014, PCTV 013) 和组合 8 ( PH 017,
P CEVd 015, PCTV 014) 效果最好。PH引物浓度超过
016时能保证 HLB病原的完全扩增 , 但产物量无
明显的区别 ; PH 引物浓度为 014～015时 , 由于
多重 PCR中存在的引物竞争 , 且 HLB 病原扩增
片段较长 , 故产物带亮度较弱。 PCEVd引物浓度在
013～017之间均能保证完全扩增 , 在 016～017
之间 , 非特异扩增带明显增加。 PCTV引物浓度在
图 2　CEVd材料的 RT2PCR检测
1: CEVd暗柳橙 ; 2: 健康红江橙 ; 3: CEVd 　柑。
F ig. 2　RT2PCR detection of two CEVd sam ples
1: CEVd Anliu sweet orange; 2: Healthy sweet orange;
3: CEVd Ponkan.
M: 100 bp DNA ladder marker Ⅶ ( SD01522, D ingguo) .
图 3　CTV材料的 RT2PCR检测
1: CTV北京柠檬 ; 2: 健康红江橙 ; 3: CTV红江橙。
F ig. 3　RT2PCR detection of two CTV sam ples
1: CTV Beijing lemon; 2: Healthy sweet orange;
3: CTV sweet orange.
M: 100 bp DNA ladder marker Ⅶ ( SD01522, D ingguo) .
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014～018之间均能保证高效扩增 , 由于 CTV扩增产物片段最短 , 故在同等条件下 , 与模板的结合能
力最强 , 扩增带亮度明显较 HLB、CEVd扩增带强。综合考虑各方面因素 , 最终确定最佳引物浓度组
合为 PH 016μmol/L , PCEVd 014μmol/L, PCTV 013μmol/L (组合 5)。
213　不同退火温度对多重 RT2PCR体系的影响
HLB、CEVd和 CTV单一 RT2PCR扩增的最佳退火温度分别为 65℃、60℃和 57℃, 当多重 PCR退
火温度设为 63℃时 , CTV完全无法正常扩增 , 当退火温度低于 57℃时 , 非特异性扩增明显增加。故
最终选定最佳退火温度为 59℃ (图 5)。
214　多重 RT2PCR扩增体系的建立
本试验还就影响多重 RT2PCR扩增的 Taq DNA polymerase, dNTPs的浓度及循环参数进行优化
(结果未列出 ) , 最终建立了多重 PCR优化体系 ( 25μL ) : 10 ×Buffer 215μL, dNTPs 012 mmol/L ,
引物组合 PHLB 016μmol/L, PCEVd 014μmol/L , PCTV 013μmol/L , cDNA各 1μL, Taq DNA聚合酶 115
U。PCR反应程序 : 95℃预变性 3 m in, 95℃ 40 s, 59℃ 1 m in, 72℃延伸 1 m in, 循环 35次 , 最后
72℃延伸 10 m in。
图 4　不同引物浓度 (μm ol/L ) 组合的多重 RT2PCR扩增结果
F ig. 4　M ultiplex RT2PCR am plif ica tion using d ifferen t
com b ina tion of pr im er sets
1: PH 014, PCEVd 014, PCTV 014; 2: PH 014, P CEVd 013,
PCTV 012; 3: PH 015, PCEVd 014, PCTV 013; 4: PH 015, PCEVd 013,
PCTV 012; 5: PH 016, PCEVd 014, PCTV 013; 6: PH 016, PCEVd 013,
PCTV 012; 7: PH 017, PCEVd 016, PCTV 014; 8: PH 017, PCEVd 015,
PCTV 014; 9: PH 017, PCEVd 014, PCTV 013; 10: PH 017, PCEVd 013,
PCTV 012; 11: PH 018, PCEVd 017, PCTV 016; 12: PH 018, PCEVd 016,
PCTV 014; 13: PH 018, PCEVd 015, PCTV 014; 14: PH 018, PCEVd 014,
PCTV 013; 15: PH 018, PCEVd 013, PCTV 012. M: 100 bp DNA
ladder marker Ⅶ ( SD01522, D ingguo) . 1 - 15: Combination
of p rimer sets 1 to 15.
215　多重 RT2PCR的敏感性测验
运用优化的多重 RT2PCR体系 , 能够同步检
测到 10 pg总 RNA中的 HLB和 CEVd病原 , 1 pg
总 RNA中的 CTV病毒 (图 6)。
216　RT2PCR产物的克隆与测序
RT2PCR特异性目的产物克隆测序后 , 对测
序结果用 NCB IB last进行同源性搜索。结果显示 ,
克隆的 3种病原的靶片段与 NCB I中已发表序列
高度同源 ( HLB 序列同源性为 98% ～ 100% ;
CEVd序列同源性为 97% ～99% ; CTV 序列同源
性为 97% ～100% )。
图 5　不同退火温度的 RT2PCR扩增结果
F ig. 5　M ultiplex RT2PCR am plif ica tion w ith
d ifferen t annea ling tem pera ture
M: 100 bp DNA ladder marker Ⅶ ( SD01522, D ingguo) .
1 - 3: 63℃; 4 - 6: 61℃; 7 - 9: 59℃; 10 - 12: 57℃; 13 - 15: 55℃.
图 6　多重 RT2PCR对 HL B、CEVd、CTV敏感性检测结果
1～3: 10 ng RNA单一扩增 (1. HLB, 2. CEVd, 3. CTV) ;
4～8: 多重扩增 (4. 10 ng, 5. 100 pg, 6. 10 pg,
7. 1 pg, 8. 100 fg)。
F ig. 6　The sen sitiv ity of m ultiplex RT2PCR am plif ica tion
of HL B, CEVd and CTV
Lane 1 - 3: Standard PCR amp lification of HLB, CEVd,
CTV in 10 ng total RNA. Multip lex RT2PCR
amp lification of HLB, CEVd, CTV in 10 ng total
RNA ( lane 4) ; in 100 pg total RNA ( lane 5) ; in
10 pg total RNA ( lane 6) ; in 1 pg total RNA
( lane 7) ; in 100 fg total RNA ( lane 8) .
M: 100 bp DNA ladder marker ( ToYoBo).
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217　多重 RT2PCR体系的实际运用测验
试验结果显示 , 来自萝岗的 10份萝岗甜橙中
4份存在 3种病原的复合侵染 , 2份存在 HLB、
CTV的复合侵染 , 3份 HLB单独侵染。12份来自
江西的纽荷尔脐橙中 3份存在 3种病原复合侵染 ,
2份存在 HLB、CTV的复合侵染 , 7份 HLB单独
侵染。8份来自杨村的红江橙中 2份复合侵染 3
种病原 , 1份复合侵染 HLB、CTV , 5份 HLB单
独侵染。7份来自海南的北京柠檬中 2份复合侵
染 HLB 和 CEVd, 1份复合侵染 HLB 和 CTV, 3
份 HLB单独侵染 (图 7)。
多重 RT2PCR检测结果与单重 RT2PCR结果
相一致 (表 2)。
图 7　多重 RT2PCR对田间 17份材料的检测结果
1～3, 9～11, 14: 萝岗甜橙 ; 4～6, 15: 纽荷尔脐橙 ;
7, 8, 17: 北京柠檬 ; 12, 13, 16: 红江橙。
F ig. 7　M ultiplex RT2PCR detection of three pa thogen s in
17 c itrus sam ples na tura lly infected in f ield
1 - 3, 9 - 11, 14: Luogang sweet orange; 4 - 6, 15:
Newhall navel orange; 7, 8, 17: Beijing lemon;
12, 13, 16: Hongjiang sweet orange. M: 100 bp
DNA ladder marker Ⅶ ( SD01522, D ingguo) .
表 2　田间 37份材料的单重与多重 RT2PCR检测结果
Table 2　D etection results of standard RT2PCR and m ultiplex RT2PCR of na tura lly
infected 37 sam ples collected from f ields
田间样品
Field samp les
样品数
Samp le number
单一 Standard
HLB CEVd CTV
多重 Multip lex
HLB + CEVd + CTV HLB + CEVd HLB + CTV HLB
萝岗甜橙 C. sinensis O sb. 10 9 4 6 4 2 3
纽荷尔脐橙 Newhall navel orange 12 12 3 5 3 2 7
红江橙 C. sinensis ×C. reticu la ta 8 8 2 3 2 1 5
北京柠檬 C. lim on 7 6 2 1 2 1 3
3　讨论
影响多重 PCR扩增效果的因素很多 , 引物的设计 (引物间是否存在自身匹配和竞争性扩增 ) 对
扩增效果影响很大 ; 另外 PCR反应体系 (主要成分 dNTP浓度、镁离子浓度、酶浓度 ) 以及反应程
序 (退火温度、退火及延伸时间、循环次数 ) 的调整和优化也很关键。为了达到最佳扩增 , 本试验
在选取适宜的引物后 , 对引物组合和退火温度进行了筛选 , 发现引物的 Tm值直接影响多重 PCR特异
性 , 当退火温度偏向于较高引物 Tm值时 , 特异性扩增明显增强。引物用量与扩增片段的大小明显相
关 , 即片段越长 , 引物用量越多 , 这与谢芝勋〔15〕等的结果一致。
本试验首次建立了国内同时检测 HLB、CEVd、CTV的多重 RT2PCR检测体系 , 与采用单一 PCR
体系分别检测 3种病原相比 , 不仅操作简单 , 而且耗费少 , 时间短。敏感性测验显示该体系能够同时
检测到 10 pg总 RNA中的 HLB和 CEVd病原 , 1 pg总 RNA中的 CTV病毒 , 说明该体系为一种高灵敏
度的病原检测方法。实际运用测验也证明了该多重 RT2PCR体系能够在同一样品中同时检测出 HLB、
CEVd、CTV的 3种、两种或 1种病原的侵染 , 对于柑橘病害快速诊断具有重大意义。
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p lasma gallisep ticum by a trip lex PCR. Chinese Journal of Animal Quarantine, 2000, 17 (11) : 20～22 ( in Chinese)
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本书由中国农业科学院蔬菜花卉研究所主编 , 已于 2002年 9月出版发行。全书分上、下卷 , 1～6章为上卷 , 包
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