全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (2) : 385～388
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 06 - 08; 修回日期 : 2005 - 11 - 01
基金项目 : 湖南省自然科学基金资助项目 (05JJ40124) ; 湖南省科技三项基金项目 ( 0JZY2155) ; 湖南省教育厅青年基金资助项
目 (1010586) ; 中南林学院青年基金资助项目 (10120023) ; 中南林学院人才引进基金资助项目
白梨新 S基因的克隆
乌云塔娜 1 　谭晓风 1 　曹玉芬 2 　李秀根 3
(1 中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 , 长沙 410004; 2 中国农业科学研究院果树研究所 , 兴
城 125100; 3 中国农业科学研究院郑州果树研究所 , 郑州 450000)
摘 　要 : 采用 PCR - RFLP检测、DNA序列分析和田间杂交试验 , 从白梨中分离鉴定了 1个新的 S 2
RN ase基因。该 S2RN ase基因 PCR扩增产物大小与 S8 2RN ase基因 PCR产物相似 , 为 450 bp左右。但 PCR -
RFLP和 DNA序列分析均表明 , 它与 S8 2RN ase基因存在较大差异 , 该基因内含子为 252 bp, 而 S8 2RN ase的
内含子为 234 bp, 并在高变区中具有 10个氨基酸出现替换 , 有两个氨基酸出现缺失。而该 S 2RN ase基因却
与 S12 2RN ase基因具有较高的相似性 , 在 HV区中只有 1处碱基被替换 , 周边区中有 10处出现碱基替换或
缺失。因此 , 继梨 S18 2RN ase基因 , 将它命名为 S19 2RN ase基因 (AY250987)。与 S基因型已确定的梨品种
的杂交坐果率也说明了该基因是一个新的 S2RN ase基因。
关键词 : 梨 ; 自交不亲和性 ; S2RN ase基因 ; 基因分离
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0220385204
Clon ing of a New Self2incompatibility S2allele in W hite Pear( Pyrus bretschneideri)
W uyun Tana1 , Tan Xiaofeng1 , Cao Yufen2 , and L i Xiugen3
(1 The Key Labora lory of N on2w ood Forest Product of Forestry M inistry, Central2sou th of Forestry and Technology U niversity,
Changsha 410004, Ch ina; 2 F ruit Tree Research Institu te, Ch inese A cadem y of A gricultural Sciences, X ingcheng 121600, China;
3 Zhengzhou Fru it Tree Research Institu te, Ch inese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, Zhengzhou 450000, Ch ina)
Abstract: A new S 2RN ase gene was identified in white pear ( Pyrus bretschneideri) by PCR - RFLP,
DNA sequencing analysis and cross pollination tests. The fragment length of PCR amp lification using p rimers
specific for S1 2RN ase to S9 2RN ase, sim ilar to that of S8 2RN ase, was around 450 bp. RFLP and DNA sequence
analyses revealed that the two genes had great variations in introns and hypervariable (HV) regions. The nu2
cleotide size of intron of this new gene was 252 bp, whereas that of S8 2RN ase was merely 234 bp. By compa2
ring the am ino acids (AA) of the HV regions between the new S 2RN ase gene and S8 2RN ase, this new gene
had substitutions of 10AA and deletion of 1AA , respectively. Nevertheless, it showed a high identity to S12 2
RN ase that we p reviously identified in white pear, only 1 bp was substituted in the HV region, and 10 bp were
substituted or deleted in the around regions. Based on our current results, the new S 2RN ase gene was named
as S19 2RN ase ( accession number in GenBank: AY250987). The results of recip rocal cross pollination tests
between pear cultivars whose S genotypes have been determ ined and those containing S19 2RN ase further con2
firmed that the isolated fragment was a new S 2RN ase gene.
Key words: Pyrus bretschneideri; Self2incompatibility; S2allele; Gene isolation
1　目的、材料与方法
20世纪中叶日本学者用杂交试验亲和力研究方法鉴定了 7个自交不亲和等位基因 ( S 等位基
因 )〔1, 2〕, 为梨自交不亲和性的分子遗传学研究奠定了基础。Norioka等根据其自交不亲和糖蛋白的氨
基酸序列合成引物 , 从成熟雌蕊 cDNA中分离得到了 S1 ～S7 等位基因的 cDNA克隆 , 而且在基因组
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
DNA和 cDNA的序列比较中发现 , S1 ～S7 2RN ase的 HV区中存在一个内含子 , 并描述了不同 S等位基
因特异识别部位 ———HV区的氨基酸序列特点〔3～6〕。根据 HV区和内含子序列的差异 , 建立了从基因
组 DNA水平上检测日本梨 S1 ～S7 - 等位基因 PCR - RFLP系统 , 并用该检测系统 , 确定了部分日本
梨和韩国梨的 S基因型〔7, 8〕。2000～2001年 , 用日本梨 S1 ～S7 - 等位基因 PCR - RFLP系统鉴别日本
梨品种时 , 发现了两个新的 S基因 , S8 - 和 S9 - 等位基因 , 并对其 cDNA进行了克隆。2002年 , 韩
国梨中发现 S10 -等位基因。国内 , 作者开展中国沙梨和白梨基因组 DNA的 S基因研究 , 鉴定了 S11
～S18 - RN ase基因 , 并确定了近 40个中国沙梨和中国白梨品种的 S基因型〔9〕。本文报道从中国白梨
六瓣等 7个品种中鉴定了一个新的基因 , 为梨自交不亲和性机理研究和克服梨自交不亲和性研究提供
依据。
111　植物材料
7个中国白梨 ( Pyrus bretschneideri Rehd) 品种 : 六瓣 (L iuban)、海棠酥 ( Haitangsu)、香椿
(Xiangchun)、恩梨 ( Enli)、博山池 (Boshanchi)、大核白 (Dahebai)、青梨 (Q ingli) , 采集于中国
农业科学院果树研究所白梨种质资源圃。采集嫩叶 015 g左右 , 存储于液氮中。带回实验室后于 -
70℃冷冻保存。
112　引物和试剂
3条引物 , 组合成 2对。P1是正向引物 , P2为反向引物。 P1和 P2是 HV区两边的保守序列。
P1: 5pi2TTTACGCAGCAATATCAG23pi; P2: 5pi2AC (A /G) TTCGGCCAAATAATT23pi; 限制性核酸内切酶
N ruⅠ、Taq DNA聚合酶、λ/H indⅢ digest DNA Ladder购自日本 TAKARA公司。DNA回收试剂盒 Gene
CleanⅡKit购自日本 B IO101公司。其它生化试剂和常规试剂均为超纯或分析纯。高保真酶 KOD2Plus2
Polymerase system为日本 TOYOBO公司产品 , 由日本神户大学农学部果树研究室中西哲教授赠送。
图 1　梨 S 2RN ase基因结构及引物的位置
HV: 高变区 ; C1～C5: 保守区。
F ig. 1　The gene structure of pear S2RN ase and the position of pr im ers
HV: Hyper variable region; C1 - C5: Conserved region.
113　总 D NA提取、纯化和 PCR扩增
总 DNA提取主要依据改良的 CTAB方法〔10〕, 纯化方法见文献 〔11〕。 PCR扩增反应体系和循环
条件见文献 〔12〕。
114　限制酶酶切、高保真酶扩增、片段回收和测序
限制酶酶切按照 N ruⅠ和 S fcⅠ的说明书进行。
高保真酶扩增和目的片段的回收分别依 KOD2Plus2Polymerase system和 Gene CleanⅡ Kit的说明书
进行。PCR产物进行直接测序 , 引物 P1和 P2双向测序委托上海申友生物技术公司进行。
115　杂交试验
大蕾期前 1～2 d, 在梨树冠外围中下部短果枝上 , 选取即将开放、花质均一的花朵套塑料袋
(保鲜袋 ) , 防止非目的花粉的污染。花粉采集选用花瓣健壮 , 即将开放的大蕾期 “铃铛花 ”。在每天
黄昏前采集 100个花序。用镊子剥去花瓣 , 镊下花药 , 摊在硫酸纸上。在 28℃的日灯光下晒 12 h,
花粉囊完全开裂、花粉散出后 , 将散出的花粉装入玻璃瓶 (干燥青霉素瓶 ) 中待用。选花梗健壮、
花朵无损的大蕾期花作授粉对象 , 每个品种 50个花序 , 每序 2朵小花 (宜取花序两侧的小花 )。将
直径约 3 mm的胶管套在粗度相当的牙签上 , 供授粉时使用。将花粉点授于每个待授花朵的柱头上 ,
除去其余花朵 , 授粉后套纸袋 , 挂牌。授粉 1周后去除纸袋 , 落花 1个月后调查坐果率。
683
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　2期 乌云塔娜等 : 白梨新 S基因的克隆 　
2　结果与分析
211　白梨品种 S基因的分离
用 S基因特异性引物 ‘FTQQYQ’和 ‘anti2
IIW PNV’分别对海棠酥、六瓣、香椿、恩梨、博
山池、大核白、香椿、青梨等 7个中国白梨品种
的基因组 DNA进行 PCR扩增 , 结果见图 2。每个
品种分离得到了 1～3个 S 基因特异 DNA 片段。
以上 7个品种有 1条 450 bp左右的共同带 , 其片
段与日本梨的 S8 2RN ase ( P1和 P2引物的扩增产
物大小为 434 bp) 基因相似。
212　目的片段的鉴定 　 图 2　中国梨品种 S基因特异性引物 PCR扩增1. 海棠酥 ; 2. 六瓣 ; 3. 恩梨 ; 4. 博山池 ; 5. 大核白 ;6. 香椿 ; 7. 青梨。F ig. 2　Am plif ica tion of S2RN ase fragm en ts from Ch inese pears1. Haitangsu; 2. L iuban; 3. Enli; 4. Boshanchi; 5. Dahebai;6. Xiangchun; 7. Q ingli
21211　限制酶酶切检测、测序和相似性比较 　N ruⅠ和 S fcⅠ是 S8 2RN ase基因的特异性限制酶 , N ruⅠ
特异切割 S8 2RN ase (434 bp) 基因 PCR产物产生 249 bp和 185 bp的片段 , S fcⅠ切割 S8 2RN ase基因
PCR产物后产生 182 bp和 252 bp的片段。用 N ruⅠ和 S fcⅠ进行切割海棠酥、六瓣、恩梨、博山池、
大核白、香椿、青梨的 S 基因 PCR产物 , 结果表明以上品种均没有被 N ruⅠ和 S fcⅠ切割 (电泳图
略 )。因此可推测该片段不是 S8 2RN ase基因 , 为了进一步鉴定 , 对该片段进行了回收和测序。
对海棠酥、六瓣、香椿、恩梨、博山池、大核白、香椿、青梨 S基因特异性产物 450 bp左右的
片断进行回收和测序。结果表明 , 以上 8个品种的 450 bp左右的片断的序列完全相同 , 大小为 447
bp。而且与 S1 ～S18 2RN ase基因的 DNA和氨基酸序列的同源性均较高 , 其中 HV区 +周边区的推导氨
基酸序列一致性分别为 76%、79%、70%、71%、76%、79%、76%、75%、74%、67%、76%、
92%、72%、72%、72%、76%、70%、69%。DNA序列分析表明 , 从白梨品种中所分离的片段其
内含子大小为 252 bp, 而 S8 2RN ase基因的内含子为 234 bp, 且该片段的推导氨基酸序列与 S8 2RN ase
基因间存在较大的差异 , 在 HV区中具有 10个氨基酸的替换 , 有两个氨基酸缺失 , 周边区中 10氨基
酸出现替换或缺失。而该片段却与 S12 2RN ase基因的同源性最高 , 在 HV区中只有 1处碱基序列被替
换 , 其它区域碱基替换和缺失较多 , 具有 10处出现碱基替换或缺失 , 见图 3。因此 , 我们将该片段
确定为新的 S 基因 , 继梨 S18 2RN ase基因之后将其命名为 S19 2RN ase基因 , GenBank中的接受号为
AY250987。
图 3　S19 2RN ase与 S8 2、S12 2RN ase基因 HV区 +周遍区氨基酸序列相似性比较
HV区 : 高变区 ; C1、C2: 保守区 ; P1、P2: 引物。
F ig. 3　A lignm en t of am ino ac id sequences around the HV reg ion of S19 2RN ase and S8 2, S12 2RN ase in the pear.
HV: Hyper variable region; C1, C2: Conserved region; P1, P2: Primer.
21212　杂交鉴定 　将 S基因型已知的日本梨品种今村秋 ( S1 S6 )、二十世纪 ( S2 S4 )、丰水 ( S3 S5 )、
晚三吉 ( S5 S7 )、明月 ( S1 S8 )、新高 ( S3 S9 )〔21, 22〕分别与六瓣、海棠酥、香椿、恩梨、博山池、大核
白、青梨进行正反交试验 , 结果 (杂交试验调查表略 ) 表明 , 含有 S1 ～S9 2RN ase基因的日本梨品种
与含有新 S基因的中国梨品种间的正反交坐果率在 6418% ～9218%之间 , 说明以上日本梨品种与含
有新 S基因的中国梨之间的杂交是亲和的 , 该结果支持用分子生物学方法确定六瓣、海棠酥、香椿、
恩梨、博山池、大核白、青梨等中国梨品种中含有新的 S 2RN ase基因的结果。
783
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
参考文献 :
1　Ogaki C. The sterility2factors in new varieties of the Japanese pear ( Pyrus serotina Rehd. var. culta Rehd) . Res. Rep. Kanagawa Agr.
Sta. Hort. , 1958, 5: 23～26
2　Machida Y, Sato Y, Kozaki, I Seiki K. S2genotypes of several cultivars of Japanese pear and the question of the parents of‘Hosui’. In:
Abstr. Japan. Soc. Hort. Sci. Autumm Meet, 〔s. l. 〕: 〔s. n. 〕, 1982. 58～59 ( in Japanese)
3　Norioka Y, Ishim izu S, Nakanishi T. Nucleotide sequences of cDNA s encoding S2 2 and S4 2RN ases (D49527 and D49528 for EMBL) from
Japanese pear ( Pyrus pyrifolia Nakai) ( PGR95020) . Plant Physiol. , 1995, 108: 1343～347
4　Norioka N, Norioka S, Ohnishi Y. Molecular cloning and nucleotide sequences of cDNA s encoding S2allele specific stylar RNase in a self2
incompatible cultivar and self2compatible mutant of Japanese pear. Pyrus pyrifolia Nakai. J. B iochem. , 1996, 120: 335～345
5　 Ishim izu T, Shinkawa T, Sakiyama F, Norioka S. Primary structural features of rosaceous S2RN ases associated with gametophytic self2in2
compatibility. PlantMol. B iol. , 1998, 37: 931～941
6　Hugot K, PonchetM, Marais A, R icci P, Galiana E. A tobacco S2like RNase inhibits hyphal elongation of p lant pathogens. Mol. , Plant
M icrobe Interact, 2002, 15 (3) : 243～250
7　Kim H T, H irata Y, Nou I S. Determ ination of S2Genotypes of pear ( Pyrus pyrifolia) cultivars by S 2RN ase sequencing and PCR2RFLP an2
alyses. Mol. Cell, 2002, 13 (3) : 444～451
8　Castillo C, Takasaki T, Saito T, Yoshimura Y, Norioka S, Nakanishi T. Reconsideration of S2genotype assignments, and discovery of a
new allele based on S2RNase PCR2RFLPs in Japanese pear cultivars. B reed Sci. , 2001: 51, 5～11
9　谭晓风 , 乌云塔娜 , 中西 ƒ ⁄ , 李秀根 , 曹玉芬 , 杨谷良. 中国梨品种自交不亲和新基因的分离鉴定. 中南林学院学报 , 2005,
25 (2) : 1～3
Tan X F, W uyun T N , Nakanixi T S, L i X G, Cao Y F, Yang G L. Isolation and identification of self2incompatible gene of Chinese pear.
Jourrnal of Central South Forestry University, 2005, 25 (2) : 1～3 ( in Chinese)
10　乌云塔娜 , 张党权 , 谭晓风. 梨不同 DNA提取方法的效果研究. 中国生物工程杂志 , 2003, 23 (7) : 98～101
W uyun T N , Zhang D Q, Tan X F. Studies on methods of isolating pear DNA. China B iotechnology, 2003, 23 (7) : 98～101 ( in Chi2
nese)
11　奥斯伯 F. 精编分子生物学实验指南. 北京 : 科学出版社 , 1998. 30～31
Ausubel F. Current p rotocols in molecular biology. Beijing: Science Press, 1998. 30～31 ( in Chinese)
12　乌云塔娜. 中国白梨自交不亲和基因的分离鉴定 : 〔博士论文〕. 长沙 : 中南林学院 , 2003. 28～29
W uyun T N. Isolation and identification of self2incompatible genes of Chinese Pyrus B retschneideri: 〔Ph. D. D issertation〕. Changsha: Cen2
tral South Forestry University, 2003. 28～29 ( in Chinese)
13　李树玲 , 曹玉芬 , 黄礼森. 梨优良新品种授粉试验. 天津农学院学报 , 1997, 4 (2) : 30～32
L i S L, Cao Y F, Huang L S. Pollination tests on excellent pear cultivars. Journal of Tianjin Agricultural College, 1997, 4, (2) : 30～
32 ( in Chinese)
14　刘助生. 日本梨授粉品种的选择及人工授粉技术. 柑桔与亚热带果树信息 , 2001, 17 (3) : 39～40
L iu Z S. Selection of Japanese pear ( Pyrus pyrifolia) pollen donor varieties and artifica pollination technique . Citrus and Subtrop ical Zone
Fruit Trees, 2001, 17 (3) : 39～40 ( in Chinese)
15　 Ishim izu T, Inoue K, Shimonaka M. PCR2based method for identifying the S2genotypes of Japanese pear cultivars. Theor. App l. Genel. ,
1999, 98: 961～967
16　Castillo C A. Identification of a new allele of self2incompatibility of Japanese pear: 〔Ph. D. D issertation〕. Kobe: Kobe University, 2000.
56～65
883