全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (11) : 1621 - 1626
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 09 - 03; 修回日期 : 2008 - 10 - 10
基金项目 : 国家 ‘863’计划子课题项目 (2004AA241170) ; 国家科技支撑计划项目 (2006BAD01A726203) ; 河南省重大科技攻
关项目 (072101110500) ; 河南省自然科学基金项目 (0511030800)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lwgwm@1631com; Tel: 0371265330936)
利用二硝基苯胺类除草剂离体诱导西瓜四倍体
阎志红 , 刘文革 3 , 赵胜杰 , 何 楠
(中国农业科学院郑州果树研究所 , 郑州 450009)
摘 　要 : 以二倍体西瓜单系 Z2A和 Z2R为试验材料 , 采用不同浓度的二硝基苯胺类除草剂 ———胺磺
灵、二甲戊乐灵和氟乐灵处理其离体子叶 , 以秋水仙素和不含任何诱导剂的液体培养基为对照 , 研究诱导
西瓜四倍体的效果。结果表明 , 3种除草剂诱导西瓜四倍体的效果都比秋水仙素好 , 二甲戊乐灵、胺磺灵、
氟乐灵和秋水仙素的四倍体诱导率分别为 4010%、3313%、2617%和 1313%。采用子叶直接处理比间接处
理的四倍体诱导率高。通过 FDA荧光法对西瓜试管苗叶片表皮保卫细胞叶绿体计数 , 进行四倍体变异早期
鉴定 , 准确率为 90%以上。
关键词 : 西瓜 ; 四倍体 ; 二硝基苯胺类除草剂 ; 离体诱导 ; 倍性
中图分类号 : S 651　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1121621206
In V itro Induction of Tetraplo id W a term elon Using D in itroan iline Herb ic ide
YAN Zhi2hong, L IU W en2ge3 , ZHAO Sheng2jie, and HE Nan
( Zhengzhou Fruit Research Institu te, Ch inese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, Zhengzhou 450009, Ch ina)
Abstract: Tetrap loid watermelons were successfully induced in vitro by treating cotyledons of dip loid wa2
termelon lines Z2A and Z2R in liquid MS medium with three dinitroanilines herbicide oryzalin, pendimethalin
and trifluralin in different concentrations, colchicine or no inductor used as control. The results indicated that
the effects of tetrap loid induction were better by using three dinitroanilines than those of colchicine. The in2
duced tetrap loid rate of oryzalin, pendimethalin, trifluralin and colchicine was 4010% , 3313% , 2617%
and 1313% respectively. The induction rate of direct treatment in which the cut cotyledonswere directly p lan2
ted into inductive medium was higher than that of indirect treatment in which the cotyledons were p re2cultured
on differentiation medium (MS +BA 210 mg·L - 1 ) for 7 d before p lanted into inductive medium. The tetra2
p loid of watermelon p lantlets was determ ined in the early stage with FDA fluorescence method in which the
chlorop lasts of ep idermal guard cellswere counted under a m icroscope and UV light. The detective rate was a2
bove 90%. The confirmed tetrap loid p lantlets were transp lanted into a greenhouse and self2pollinated and the
seeds of tetrap loids were obtained.
Key words: watermelon; tetrap loid; dinitroaniline herbicide; in vitro induction; p loidy
培育三倍体无籽西瓜品种的关键是先获得优良的四倍体。目前西瓜四倍体的诱导方法是用秋水仙
素处理幼苗生长点 ( Tan et al. , 1995; 刘文革和阎志红 , 2005)。但此法容易造成幼苗死亡 , 且诱导
频率较低 (刘文革和王鸣 , 2002)。一般西瓜组织培养中有 5%左右的四倍体变异 (Comp ton & Gray,
1993)。用秋水仙素进行离体诱导 , 可使四倍体诱导频率明显提高 (张兴平 , 1996; 马国斌和王鸣 ,
2002)。但在培养初期使用秋水仙素会显著抑制不定芽的再生 (张兴平 , 1996) , 给离体加倍带来困
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难 (Comp ton et al. , 1996)。
近年来发现二硝基苯胺类 (DNH ) 除草剂也具有使染色体加倍的功效 , 并且比秋水仙素的毒性
小 , 诱导四倍体效果好 (Morejohn et al. , 1987; Dunn & L indstrom, 2007)。国内已在黄瓜、甜瓜等作
物上有成功的报道 (韩毅科 等 , 2006; 魏育国和蒋菊芳 , 2006) , 而西瓜这方面的报道较少 (L i et
al. , 1999)。
本试验中以 3种二硝基苯胺类除草剂 : 胺黄灵 (oryzalin)、二甲戊乐灵 (pendimethalin) 和氟乐
灵 ( trifluralin) 作为诱导剂 , 在离体条件下进行西瓜四倍体的诱导 , 以期为西瓜四倍体诱导寻找一条
快速有效的新途径。
1　材料与方法
111　四倍体的离体诱导
以中国农业科学院郑州果树研究所多倍体育种课题组选育的优良二倍体西瓜材料 Z2A和 Z2R为
试验材料。Z2A为大果型品种 , Z2R为小果型品种。试验于 2003—2007年在本所组织培养室进行 ,
田间鉴定在郑州果树研究所中牟试验基地进行。
直接处理 : 将西瓜种子在无菌条件下发芽培养 , 切取 4 d苗龄的整片子叶 , 近轴端向上直接接种
到含 15、30和 45μmol·L - 1胺磺灵的液体培养基 (MS +BA 210 mg·L - 1 , 下同 ) 和含 5、10、50和
100μmol·L - 1二甲戊乐灵或氟乐灵的液体培养基中 , 在 26 ℃弱散射光下转速为 110 r·m in - 1的摇床
上振荡培养 2、4、6 d。分别以含秋水仙素 500、1 000和 1 500μmol·L - 1的液体培养基和不含诱导剂
的液体培养基为对照。每处理 15片子叶。
间接处理 : 切取 4 d苗龄的整片子叶先接种在固体培养基 (MS + BA 210 mg·L - 1 ) 上预培养
7 d, 然后再接种到含 15、30和 45μmol·L - 1胺磺灵的液体培养基 (MS +BA 210 mg·L - 1 ) 中 , 培
养条件同上 , 每处理 15片子叶。上述处理后的材料用无菌水冲洗 4～5遍 , 灭菌滤纸吸干 , 再接种到
不含诱导剂的固体培养基 (MS +BA 210 mg·L - 1 ) 上继续培养 30 d, 继代培养 2次 , 周期 24 d。之
后转接到伸长培养基 (MS + KT 012 mg·L - 1 ) 中 , 待茎生长至 210 cm左右 , 将无根苗切下转至生根
培养基 (MS + IBA 012 mg·L - 1 ) 中诱导生根。
112　倍性鉴定方法
保卫细胞叶绿体数观察 : 采用 FDA荧光鉴定法 (Comp ton et al, 1999; 刘文革 等 , 2005)。具体
步骤如下 : 将 015 g二乙酸盐荧光黄溶于 100 mL丙酮中 , 溶解后置于 0 ℃备用。鉴定时取 FDA溶液
用蒸馏水配成 0101%的溶液 , 取成熟平展的叶片放在载玻片上 , 将 0101% FDA溶液滴于叶片背面 ,
盖上盖玻片 , 在荧光显微镜 UV光下镜检。由同一子叶分化的植株随机抽取 1株进行 FDA鉴定 , 每
株观察 10个气孔保卫细胞 , 记录叶绿体的数量 , 重复 3次。SPSS软件进行统计分析。
根尖细胞染色体数鉴定 : 采用去壁低渗法。上午 8时切取再生植株的幼嫩根尖 , 置于 01002
mol·L - 1的 8 -羟基喹啉中预处理 3 h, 然后用 01075 mol·L - 1的 KCl浸泡 20 m in作为前低渗 , 用蒸
馏水洗净。用 215%纤维素酶和 215%果胶酶混合液在 25 ℃下经过 4 h酶解去壁 , 之后浸泡在蒸馏水
内 20 m in作为后低渗。Giem sa染色 , 显微镜下观察染色体数。
对四倍体植株进行试管苗移栽 , 在温室条件下锻炼 20 d, 然后移栽到大田。田间自交并获得种
子 , 第 2年田间种植再次鉴定。
2　结果与分析
211　二硝基苯胺类除草剂离体诱导四倍体的效果
试验结果表明 : 采用直接处理方式 , 3种除草剂均可诱导产生四倍体 (图 1, A～D ) , 在低浓度
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　11期 阎志红等 : 利用二硝基苯胺类除草剂离体诱导西瓜四倍体 　
下对西瓜四倍体的诱导率都比秋水仙素高 , 未经除草剂和秋水仙素处理的对照经过 FDA鉴定和根尖
染色体鉴定没有四倍体植株 (表 1)。
图 1　诱变的西瓜四倍体
A. 试管苗 ; B. 移栽成活 ; C. FDA鉴定为 4x西瓜叶片保卫细胞的叶绿体数 ; D. 根尖染色体数 , 2n = 4x = 44。
F ig. 1　 Induced tetraplo id wa term elon plan ts
A. Test2tube p lantlet; B. Transp lanted p lantlet; C. Chlorop lasts in guard cell pairs from different tetrap loid watermelon leaves
by FDA under UV light; D. The chromosome number of root tip s of induced tetrap loid watermelon, 2n = 4x = 44.
处理浓度和诱导时间对西瓜子叶不定芽的分化有一定影响 , 从而间接影响四倍体的诱导率。随着
处理浓度和诱导时间的增加 , 发生不定芽的子叶数递减 (表 1)。
结果还表明 : 在相同处理下 , Z2A四倍体的诱导率总体上都比 Z2R高。Z2R分化不定芽较少 , 说
明对除草剂更加敏感 , 容易受到抑制。诱导剂胺磺灵在 100μmol·L - 1处理 4 d时 , Z2R子叶边缘开
始变褐 , 子叶背部上端表面有增厚疏松的褐变组织 , Z2A仅有少量子叶边缘变褐 ; 处理 6 d后 , Z2R所
有叶片都反卷 , 分化不定芽的子叶数为零 , Z2A仅部分叶片反卷。未添加诱导剂的不定芽分化正常。
选用诱导效果较好的胺磺灵对 Z2R子叶进行直接诱导和间接诱导比较 (表 1) , 结果表明 : 四倍
体诱导率直接处理 (2010% ～2617% ) 比间接处理 (1313% ～2010% ) 高 , 而且直接处理褐化较轻 ,
死亡率低。
212　西瓜试管苗早期倍性鉴定
选取西瓜伸长培养阶段平展、正常的叶片 , FDA荧光法进行叶片保卫细胞叶绿体数观察发现 ,
胺磺灵、二甲戊乐灵、氟乐灵以及秋水仙素处理后的部分组培苗叶绿体数为 15左右 (表 2)。这些组
培苗大部分形态上表现叶片相对肥大厚实、叶形指数相对较小、叶色相对深绿、茎相对粗壮 , 而未经
诱导剂处理的空白对照则相反 , 其叶绿体数为 8左右 , 据此推断前者为四倍体 , 后者为二倍体。
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表 1　不同二硝基苯胺类除草剂离体诱导西瓜四倍体
Table 1　In vitro induction of tetraplo id wa term elon by three d in itroan ilines and colch ic ine
处理方式
Treatment
诱导剂
Inducer
处理时间 / d
Treatment
time
诱导剂浓度
/ (μmol·L - 1 )
Concentration
不定芽子叶数
Shoots number
Z2A Z2R 四倍体植株数Confirmed tetrap loidsZ2A Z2R 诱导率 /%Tetrap loid exp lant percentageZ2A Z2R
直接处理 对照 2 　 0 15 15 0 0 0 0
D irect No induced 4 　 0 13 12 0 0 0 0
treatment 6 　 0 12 10 0 0 0 0
秋水仙素 2 500 13 12 0 0 0 0
Colchicine 1 000 10 8 0 0 0 0
1 500 9 7 0 0 0 0
4 500 7 5 0 0 0 0
1 000 6 2 1 0 617 0
1 500 4 1 2 1 1313 617
6 500 4 0 - - - -
1 000 2 0 1 0 617 0
1 500 0 0 0 0 0 0
二甲戊乐灵 2 　 5 14 13 0 0 0 0
Pendimethalin 　 10 13 10 2 2 1313 1313
　 50 11 8 4 4 2617 2617
100 10 5 5 1 3313 617
4 　 5 13 12 0 0 0 0
　 10 11 10 6 2 4010 1313
　 50 9 7 3 1 2010 617
100 5 1 1 0 617 0
6 　 5 9 6 0 0 0 0
　 10 6 3 2 0 1313 -
　 50 4 0 0 - 0 -
100 2 0 - - - -
氟乐灵 2 　 5 14 12 0 0 0 0
Trifluralin 　 10 12 10 1 0 617 0
　 50 10 7 2 2 1313 1313
100 9 4 4 3 2617 2010
4 　 5 12 11 0 0 0 0
　 10 11 9 2 2 1313 1313
　 50 7 6 3 1 2010 617
100 4 0 1 - 617 0
6 　 5 8 4 0 0 0 0
　 10 4 3 - - - -
　 50 2 0 - - - -
100 0 0 - - - -
胺黄灵 2 　 15 14 11 4 3 2617 2010
O ryzalin 　 30 13 11 5 4 3313 2617
　 45 13 9 2 1 1313 617
4 　 15 13 11 3 1 2010 617
　 30 11 9 1 2 617 1313
　 45 10 6 0 - 0 -
6 　 15 8 2 1 0 617 0
　 30 9 2 - 0 - 0
　 45 8 1 - - - -
间接处理 2 　 15 9 2 1313
Indirect 　 30 8 3 2010
treatment 　 45 6 1 617
4 　 15 6 1 0
　 30 4 0 0
　 45 2 - -
6 　 15 1 - -
　 30 0 - -
　 45 0 - -
　　注 : 接种数均为 15; -表示玻璃化或褐化引起全部死亡 ; 四倍体诱导率 =四倍体植株数 /处理数 ×100%。
Note: The treated buds is 15; - means died p lants because of vitrification or browning; Tetrap loid exp lant percentage = Number of confirmed
tetrap loids / Number of treated buds ×100%.
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　11期 阎志红等 : 利用二硝基苯胺类除草剂离体诱导西瓜四倍体 　
表 2　西瓜二倍体和四倍体试管苗叶片保卫细胞中的叶绿体数
Table 2　Com par ison of num ber of chloropla st per guard cell pa ir of d iplo id and
tetraplo id leaves from in vitro cotyledon s of wa term elon
品种
B reeding lines
倍性
Ploidy
叶绿体数
Number of chlorop last
T测验
T2test P值P2value
Z2A 2x 8102 ±0115
- 29103 3 01007
4x 15145 ±0121
Z2R 2x 8113 ±0114
- 31153 01018
4x 15143 ±0118
依据 FDA鉴定结果分别取 20株四倍体和 20株二倍体进行根尖染色体鉴定。其中有 18株为四倍
体 (2n = 4x = 44) , 有 19株为二倍体 (2n = 2x = 22) , FDA荧光鉴定准确率为 90%和 95%。
3　讨论
311　诱导剂的选择
二硝基苯胺类除草剂作为染色体加倍的诱导剂 , 是通过干扰纺锤体而抑制细胞分裂中期的有丝分
裂 , 在离体染色体加倍情况下对微管蛋白的作用比秋水仙素更有效 (Morejohn et al1, 1987)。低浓度
胺磺灵使植株多倍体化是由于其和微管蛋白的高亲和性而形成胺磺灵 —微管蛋白复合体 , 更主要是胺
磺灵通过影响 Ca2 +在微管丝组装中的作用而干扰细胞器的 Ca2 +运输系统 , 这两种因素共同作用导致
更多微管解聚合 , 最终导致产生四倍体的频率比秋水仙素高 ( Ganga & Chezhiyan, 2002)。
在本试验中 , 采用 30μmol·L - 1胺磺灵处理两个西瓜材料的子叶仅 2 d, 获得 3313%和 2617%的
四倍体诱变率 , 都比秋水仙素的诱导率高 , 使用的浓度都比秋水仙素低。二硝基苯胺类除草剂与秋水
仙素相比 , 诱导的死亡率低 , 对人体毒性小且价格低廉 , 因此可作为秋水仙素的替代品。
从诱导率、不定芽的发生率以及死亡率等综合指标分析 , 3种除草剂诱导西瓜四倍体的效果依次
为二甲戊乐灵 >胺磺灵 >氟乐灵。
312　诱导浓度、时间和方式对西瓜四倍体诱导效果的影响
诱导剂对西瓜不定芽的分化有一定的抑制作用 , 且浓度越高抑制作用越明显。本研究表明 , 随着
除草剂处理浓度的提高及时间的延长 , 外植体再生能力下降 , 死亡率增加。胺磺灵除草剂以 30
μmol·L - 1浓度处理 2 d、二甲戊乐灵除草剂以 10μmol·L - 1处理 4 d的四倍体诱导率 (≥33% ) 最
高。
离体诱导四倍体的培养基大多采用液体培养基 , 这是由于液体培养基比固体培养基更有助于诱导
剂对试材的深入渗透 , 有利于发挥诱导剂对试材的诱导作用。但试材在液体培养基中处理的时间不宜
过长 , 否则易引起玻璃化。本试验中 , 试材在液体培养基中处理 6 d, 转入固体培养基后有部分子叶
或茎尖玻璃化严重。培养容器中湿度大是引起玻璃化的主要原因之一。
直接处理西瓜子叶 , 四倍体诱导率高于间接处理 , 可能是直接处理方式有利于发挥诱导剂对外植
体的诱导作用。
313　倍性的早期鉴定
染色体计数法是鉴定倍性最可靠的方法之一 , 但难度较大 , 不易得到典型制片。碘—碘化钾叶绿
体计数法虽然简单方便 , 但对于西瓜来说必须撕取叶片的表皮 , 而组培苗太幼嫩难以撕取 , 故无法应
用。有学者用扫描细胞光度仪早期检测倍性 ( Zhang et al. , 1994) , 但成本昂贵 , 不易普及。Sari等
(1999) 认为根据保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体数 , 可以有效区分倍
性。刘文革等 (2005) 用二乙酸盐荧光黄 ( FDA ) 涂抹田间西瓜成熟叶片的下表皮 , 在荧光显微镜
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UV光下观察保卫细胞叶绿体数 , 二倍体和四倍体每对保卫细胞的叶绿体数平均为 917和 1718。作者
将 FDA法用于四倍体离体诱导的早期倍性鉴定 , 在组培苗早期即可鉴定出倍性 , 其方法简单 , 容易
观察 , 成本低廉 , 结果可靠 , 是西瓜倍性鉴定的一种快速有效的方法。
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