全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (5) : 649 - 654
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 10 - 26; 修回日期 : 2008 - 04 - 14
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2006AA10Z434) ; 湖北省科技攻关项目 (2006AA203B05) ; 华中农业大学博士科研启动项目
(2006XRC057) ; 教育部新教师基金资助项目 (20070504079)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yiganjun@ vip11631com; gpwang@mail1hzau1edu1cn)
中国柑橘黄龙病病原 16S rDNA序列研究
丁　芳 1, 2, 3 , 洪　霓 1, 4 , 钟　云 2 , 易干军 23 , 王国平 1, 33
(1 华中农业大学植物科学技术学院 , 武汉 430070; 2 广东省农业科学院果树研究所 , 广州 510640; 3 华中农业大学国
家果树脱毒种质资源室内保存中心 , 武汉 430070; 4 华中农业大学湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室 , 武汉
430070)
摘 　要 : 运用 PCR技术对来自中国 7省区不同寄主上的黄龙病病原 16S rDNA基因区进行了 PCR -
RFLP - SSCP分析 , 采用 3种限制性内切酶进行单酶切、双酶切及三酶切反应 , 对酶切产物进行了单链构象
多态性 ( SSCP) 分析。结果表明 : 来自 7省区不同寄主上 9个黄龙病病原菌分离物的 16S rDNA无可见变
异 ; 同时对 9个有代表性的分离物 16S rDNA进行了克隆测序 , 序列多重比对结果与 PCR - RFLP - SSCP一
致 , 从而在分子水平上证明了中国柑橘黄龙病病原菌的 16S rDNA序列高度保守 , 在不同的地域、寄主内没
有发现分子变异 , 为进一步研究柑橘黄龙病病原菌系统进化奠定了基础。
关键词 : 柑橘 ; 黄龙病 ; 病原菌 ; 16S rDNA; PCR - RFLP - SSCP; 克隆 ; 序列分析
中图分类号 : S 666　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0520649206
Stud ies on 16S rD NA Sequence of C itrus Huanglongb ing Bacter ia in Ch ina
D ING Fang1, 2, 3 , HONG N i1, 4 , ZHONG Yun2 , YI Gan2jun23 , and WANG Guo2p ing1, 33
(1 College of P lan t Science and Technology, Huazhong A gricultural U niversity, W uhan 430070, China; 2 Institu te of F ruit Tree
R esearch, Guangdong A cadem y of A gricultural Sciences, Guangzhou 510640, Ch ina; 3N ational Indoor Conserva tion Center of
V irus2free Germ plasm of Fru it C rops, Huazhong A gricultura l U niversity, W uhan 430070, Ch ina; 4 The Key L aboratory of P lant
Pathology of Hubei Province, Huazhong A gricu ltura l U niversity, W uhan 430070, Ch ina)
Abstract: PCR - RFLP - SSCP analysis was carried out to study the 16S rDNA of the citrus Huanglong2
bing (HLB ) bacterial isolates collected from 7 p rovinces in China. Three restriction endonucleases were used
to digest the target DNA fragment of 16S rDNA. The digested p roducts were subjected to single2strand confor2
mation polymorphism ( SSCP) analysis. The results showed that there was no obvious difference among the 9
rep resentative isolates from 7 p rovinces in 16S rDNA. The 16S rDNA s of the 9 rep resentative isolates were
cloned and sequenced. The result of the multip le alignment analysis of the sequences was in agreement with
that of PCR - RFLP - SSCP analysis. It revealed that the citrus Huanglongbing bacteria isolated from different
areas of China were highly conservative in their 16S rDNA sequence, and no molecular change were found a2
mong isolates from different hosts and different geographic areas. The result laid a foundation for further re2
search on systematic evolution of HLB bacteria.
Key words: citrus; Huanglongbing; Candida tus; 16S rDNA; PCR - RFLP - SSCP; cloning; sequence
analysis
柑橘黄龙病 ( citrus Huanglongbing, HLB ) 是世界性柑橘生产上毁灭性病害。其病原为韧皮部杆
菌属类细菌 (Candida tus L iberobacters) , 根据病原的热敏性、传播媒介等又可将其分为亚洲型 (Ca.
L. asiaticus)、非洲型 ( Ca. L. africanus) ( Jagoueix et al. , 1997) 和美洲型 ( Ca. L. amercanus)
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(D iva et al. , 2005)。我国的柑橘黄龙病病原属于亚洲型 (田亚南 等 , 1996; 孔维文 等 , 2000)。
该病原类细菌属于难培养菌 , 迄今纯培养尚未获得成功 (Jagoueix et al. , 1997) , 只有部分基因组
DNA序列成功测序 (V illechanoux et al. , 1993; Planet et al. , 1995; Hocquellet et al. , 1999) , 因而在
一定程度上限制了对该病原属性及病害相关研究的进一步深入。该病原自发现以来 , 分类地位就一直
存在争议 , 法国学者 Jagoueix等 (1994) 最终将其确立为韧皮部杆菌属类细菌。随后国内外学者对该
病害的部分基因组 DNA序列进行了一系列的研究 (孔维文 等 , 2000; Subandiyah et al. , 2000; 丁芳
等 , 2004, 2006; D ing et al. , 2005)。但迄今未见对于来自不同地域、分布在不同寄主、导致寄主表
现不同症状的病原分子进化相关的研究报道。作者运用 PCR - RFLP - SSCP技术对上述材料的 16S
rDNA进行研究 , 以期为柑橘黄龙病病原的分子进化研究提供证据。
1　材料与方法
111　植物材料
分别以来自广东、广西、海南、福建、重庆、湖南、江西 7省区 , 分布在不同寄主上、田间表现
不同症状的 9个代表性样品 (表 1) 为研究材料。
表 1　用于黄龙病病原菌 16S rD NA分析的来自不同地区、表现不同症状的黄龙病材料
Table 1　Plan t ma ter ia ls w ith d ifferen t sym ptom s collected from d ifferen t area s for 16S rD NA ana lysis of c itrus HL B bacter ia
黄龙病寄主
Hosts of HLB
代号
Name
来源
Source
症状
Symp tom s
　柑 Citrus reticula ta B lanco guangdong2pg 广东 Guangdong 黄化型 Yellowing
黄皮 Clausena lansium Skeels guangdong2hp 广东 Guangdong 黄化型 Yellowing
沙田柚 Citrus grandis var. shatinyu Hort. guangxi2sty 广西 Guangxi 斑驳型 B lotchy mottling
红江橙 Citrus sinensis (L. ) O sbeck guangxi2hjc 广西 Guangxi 缺素型 Nutrition deficiency
北京柠檬 Citrus lim on (L. ) Burm. hn2bjnm 海南 Hainan 缺素型 Nutrition deficiency
纽荷尔脐橙 Newhall Navel fujian2nhe 福建 Fujian 黄化型 Yellowing
津之香 (杂柑 ) Tsunokaori chongqing2zg1 重庆 Chongqing 斑驳型 B lotchy mottling
南柑 (温州蜜柑 ) Citrus unshiu Marc. hunan2ng 湖南 Hunan 黄化型 Yellowing
宫川 (温州蜜柑 ) Citrus unshiu Marc. jiangxi2gc 江西 J iangxi 斑驳型 B lotchy mottling
112　柑橘 HL B总核酸的提取及 PCR扩增
采用 CTAB法参照易干军等 (1999) 的报道 , 略做修改。称取 013 g左右的叶片中脉 , 加液氮迅
速研磨成粉末状 ; 分装于 Eppendorf管中 , 加入 800μL左右的提取缓冲液 (65 ℃预热 ) ; 置于 65 ℃
水浴中温浴 30～45 m in, 每 10 m in轻摇 1次 , 使溶液混匀 ; 12 000 r·m in - 1瞬时离心 , 取上清液加入
等体积的氯仿 ∶异戊醇 (24 ∶1) , 轻轻颠倒混匀 5 m in, 12 000 r·m in - 1离心 10 m in; 取上清液置于新
的 Eppendorf管中 , 加入 1 /10体积的 3 mol·L - 1 NaAc和 2倍体积的无水乙醇 (预冷 ) , - 20 ℃冰箱
中沉淀 30 m in, 12 000 r·m in - 1离心 10 m in。沉淀用 95%和 75%的乙醇各清洗两次 , 视 DNA量的多
少加入适量的 ddH2 O溶解 , 备用。
PCR 扩增同源引物序列为 5′2GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA23′; 互补引物序列为 5′2GC2
CTCGCGACTTCGCAACCCAT23′, 参照 Subandiyah等 (2000) 的设计 , 由上海生工生物工程技术有限
公司合成。扩增片段为黄龙病病原菌 16S rDNA序列 , 长度为 1 160 bp。
PCR扩增体系 : 10 ×Buffer 215μL, dNTPs 200μmol·L - 1 , 同源引物与互补引物各 014μ mol·
L - 1 , Taq DNA聚合酶 110 U , 模板 DNA 110μL, 灭菌双蒸水补足总体积 25μL。扩增程序为 : 95 ℃
3 m in, 95 ℃ 1 m in, 65 ℃ 1 m in, 72 ℃ 2 m in, 35个循环后 72 ℃延伸 10 m in。
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　5期 丁 　芳等 : 中国柑橘黄龙病病原 16S rDNA序列研究 　
113　HL B 16S rD NA扩增产物 RFL P分析
将 PCR扩增获得的 16S rDNA目的产物分别进行 EcoRⅤ单酶切 , EcoRⅤ和 XbaⅠ双酶切 , 以及
EcoRⅤ、X baⅠ和 SspⅠ三酶切分析 , 酶切反应均按照说明书进行。
114　HL B 16S rD NA SSCP分析
16S rDNA PCR扩增产物经 RFLP酶切之后 , 取 2μL酶切产物加 8μL甲酰胺变性缓冲液 , 95 ℃
变性 10 m in, 立即置于冰上 ; 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 , 电泳条件为 150 V 2 h, 银染 , 观
察结果。8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶配制如下 (10 mL体系 ) : 30% A rc2B is 2166 mL, 5 ×TBE 210
mL, 10% APS 70μL, TEMED 10μL, 去离子水补足总体积 10 mL。
银染具体操作方法 : 将凝胶从玻璃板上划下 , 先在固定液 (10%乙醇 + 015%乙酸 ) 中固定 3～
5 m in, 去离子水漂洗两次 ; 加入 10%的硝酸银至终浓度为 012% , 染色 3 m in, 弃染色液 , 去离子水
漂洗 2次 , 每次 1 m in; 加入显色液 (3%NaOH + 015%甲醛 ) , 至显出清晰的条带 , 去离子水漂洗 2
次 , 观测结果 , 封胶保存。
115　HL B 16S rD NA序列克隆及分析
序列克隆采用常规 T/A克隆法。经鉴定为阳性的单克隆菌液 ( 3个单克隆 /分离物 ) , 由上海生
工生物工程技术有限公司进行双向测序。序列同源性比较及多重比对分析分别采用 NCB I B last和
Clustalx软件。用于序列同源性分析的在 GenBank中登录的 HLB菌分离物分别为 : 亚洲菌系印度 Poo2
na L22532、非洲菌系 Nelsp ruit L22533、Capensis AF137368、美洲菌系 SPS2HLB AY742824。
2　结果与分析
211　不同来源的黄龙病病原菌分离物 16S rD NA片段扩增及 XbaⅠ酶切分析
分别对来自不同地区、分布在不同寄主上、田间表现不同症状的 9个代表性样品 (表 1) 进行了
16S rDNA片段扩增。结果 (图 1) 显示 , 9个样品均成功获得了与预期目标片段 1 160 bp相近的条
带 , 1%琼脂糖凝胶电泳显示各条带相互之间无明显差异。
图 1　不同来源的黄龙病病原菌样品 16S rD NA PCR扩增产物 1%琼脂糖凝胶电泳
M. DNA ladder marker DL 2000; 1. 　柑 ; 2. 黄皮 ; 3. 沙田柚 ; 4. 红江橙 ; 5. 北京柠檬 ;
6. 纽荷尔脐橙 ; 7. 津之香 ; 8. 南柑 ; 9. 宫川。
F ig. 1　Electrophoresis pa ttern s of PCR products of 16S rD NA from d ifferen t sam ples on 1% agarose gel
M. DNA ladder marker DL 2000; 1. guangdong2pg; 2. guangdong2hp; 3. guangxi2sty; 4. guangxi2hjc;
5. hn2bjnm; 6. fujian2nhe; 7. chongqing2zg1; 8. hunan2ng; 9. jiangxi2gc.
为了便于下一步的 SSCP分析 , 首先对 9个不同来源的黄龙病病原菌分离物的 16S rDNA片段进
行了 X baⅠ酶切分析。酶切结果在 1%的琼脂糖凝胶电泳图上显示 , 各分离物的 16S rDNA片段被
X baⅠ酶切后均获得了 640 bp和 520 bp的片段 (图 2) , 相互之间无明显差异。
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图 2　不同来源的 HL B样品 16S rD NA XbaⅠ酶切分析
M. 100 bp DNA ladder marker ( ToYoBo) ; 1. 　柑 ; 2. 黄皮 ; 3. 沙田柚 ; 4. 红江橙 ; 5. 北京柠檬 ;
6. 纽荷尔脐橙 ; 7. 津之香 ; 8. 南柑 ; 9. 宫川。
F ig. 2　XbaⅠ d igested products of 16S rD NA from d ifferen t HL B isola tes
M. 100 bp DNA ladder marker ( ToYoBo) ; 1. guangdong2pg; 2. guangdong2hp; 3. guangxi2sty;
4. guangxi2hjc; 5. hn2bjnm; 6. fujian2nhe; 7. chongqing2zg1; 8. hunan2ng; 9. jiangxi2gc.
212　不同来源的黄龙病病原菌分离物 16S rD NA片段扩增产物 RFL P - SSCP分析
为了进一步验证柑橘黄龙病病原菌各分离物的 16S rDNA片段是否存在差异 , 将 16S rDNA经 X ba
Ⅰ酶切的产物进行了 SSCP分析 (图 3, A) , 并与 EcoRⅤ、SspⅠ进行了双酶切和三酶切分析。X baⅠ
单酶切后获得的大小为 640 bp和 520 bp的片段经 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后均被变性为两
条迁移率不同的单核苷酸链 , 但相互之间仍无明显的带型差异。EcoRⅤ和 X baⅠ对 16S rDNA片段双
酶切后获得 280、360和 520 bp左右的片段 (图 3, B ) , X baⅠ、EcoRⅤ和 SspⅠ三酶切后获得大小介
于 230～280 bp左右的片段 (图 3, C) , 经 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后各条带均被变性为迁
移率不同的两条单核苷酸链 , 从带型看各样品之间无明显差异。从而初步证明了来自中国不同地区、
分布在不同寄主上、田间表现不同症状的柑橘黄龙病病原菌 16S rDNA序列相对较保守。
图 3　不同来源的黄龙病病原菌分离物 16S rD NA PCR酶切产物 8%非变性 PAGE电泳
A. XbaⅠ酶切产物 ; B. XbaⅠ、EcoRⅤ酶切产物 ; C. XbaⅠ、EcoR V、SspⅠ酶切产物。
1. 　柑 ; 2. 黄皮 ; 3. 沙田柚 ; 4. 红江橙 ; 5. 北京柠檬 ; 6. 纽荷尔脐橙 ; 7. 津之香 ; 8. 南柑 ; 9. 宫川。
F ig. 3　Electrophoresis pa ttern s of restr iction endonuclea se d igested PCR products of 16S rD NA from d ifferen t
HL B isola tes on 8% non2dena tured polyacrylam ide gels
A: X baⅠ digestion; B: X baⅠ and EcoR V double digestion; C: XbaⅠ, EcoR V and SspⅠ trip le digestion.
1. guangdong2pg; 2. guangdong2hp; 3. guangxi2sty; 4. guangxi2hjc; 5. hn2bjnm;
6. fujian2nhe; 7. chongqing2zg1; 8. hunan2ng; 9. jiangxi2gc.
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　5期 丁 　芳等 : 中国柑橘黄龙病病原 16S rDNA序列研究 　
213　不同来源的黄龙病病原菌分离物 16S rD NA克隆及序列分析
为了在分子水平上明确柑橘黄龙病病原菌 16S rDNA序列的保守性 , 将上述 9个代表性样品进行
了克隆及测序分析。测序结果显示 : 9个代表样片段大小均为 1 167～1 168 bp, 经 NCB I B last搜索 ,
与 GenBank已发表序列亚洲菌系 L22532的同源性高达 9815% ～100% ; 与非洲菌系的同源性分别为
94% (AF137368)、95% (AY919312)、97% (L22533) ; 与美洲菌系 SPS2HLB AY742824同源性为
9419% ～9610%。9个代表性样品 16S rDNA序列 Clustalx多重比对分析碱基差异见图 4, 从比对结果
可以看出不同来源的黄龙病病原菌分离物相互之间序列同源性介于 9815% ～100% , 部分序列位点存
在变异 , 特别是海南分离物 hn2bjnm与其他分离物的序列同源性均为 9815% ～9816% , 有关该分离物
的特性尚需进一步研究。
图 4　不同来源的 HL B分离物 16S rD NA序列多重比对分析
仅示部分含酶切位点的序列。
F ig. 4　M ultiple sequence a lignm en t of 16S rD NA from HL B sam ples of d ifferen t area s
Showing part of the sequences including the site of restriction analysis.
3　讨论
rRNA基因一般由保守区和可变区组成 , 在细菌中高度保守是细菌系统分类学研究中最有用和最
常用的标准。本研究选取 HLB较为保守的 16S rDNA序列 , 对国内 7省区的 9个代表性样品进行了克
隆、测序及序列分析 , 获得长度为 1 167～1 168 bp的核苷酸片段 , G + C含量为 5314% ～5419%。同
源性比较分析发现与亚洲菌系印度 Poona L22532的同源性最高 ( 9815% ～100% ) , 而与非洲菌系
Nelsp ruit L22533、Capensis AF137368的同源性介于 9410% ～9710% , 与美洲菌系 SPS2HLB AF742824
同源性介于 9419% ～9610%。其中所获得的 9个分离物的长度 1 167～1 168 bp的核苷酸序列与印度
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Poona L22532相比共有 44个位点的差异 ; 与 Capensis AF137368相比共有 95个位点的碱基差异 , 与
SPS2HLB相比共有 96个位点的碱基差异。比较而言 , 区域保守性较强的位点 , 如 258～286 bp、
315～349 bp、352～389 bp、440～468 bp、470～508 bp、703～750 bp、752～796 bp和 1 102～1 147
bp等区段在亚洲菌系、非洲菌系和美洲菌系中的碱基完全相同 , 这些保守性强的区域可能参与了 16S
rDNA的重要功能。而另外一些区段 , 如 57～240 bp、287～314 bp、390～437 bp、508～703 bp、797
～980 bp、1 056～1 100 bp和 1 162～1 129 bp等碱基在 3种菌系中差异较大 , 可能这些区段参与了某
些特定的功能。本研究首次对来自我国不同地区、分布在不同寄主上、田间表现不同症状的 HLB样
品 16S rDNA序列进行了分析 , 确立了中国 7省区的 9个柑橘黄龙病病原菌分离物均属于亚洲菌系
Candida tus L iberobacter asiaticus。
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