全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (1) : 127～130
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 02 - 23; 修回日期 : 2004 - 05 - 10
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30370975) ; 浙江省重大科技项目 (021102536)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jshcao@ zju1edu1cn)
萝卜 RsCYP86M F基因 cDNA全序列克隆及结构特
征分析
王玲平　曹家树 3 　叶纨芝　向　 　余小林
(浙江大学蔬菜研究所 , 杭州 310029)
摘 　要 : 本研究通过设计保守的基因特异引物 , 运用 SMART RACE RT - PCR技术从 ‘圆白 ’萝卜中
获得一个细胞色素 P450基因 , 命名为 RsCYP86M F , 其 cDNA全长 1818 bp, 含有 1581 bp的完整开放阅读
框 , 编码 526个氨基酸 , 该基因编码的蛋白序列与白菜的细胞色素 P450基因编码的氨基酸序列同源性高达
90% , 且有很高的功能区段保守性 ; 对其可能编码的蛋白质二级结构进行预测发现 , 该蛋白质具有细胞色
素 P450典型的保守结构域 FNAGPRLC IG, 及 N -糖基化位点等结构域。
关键词 : 萝卜 ; RsCYP86M F基因 ; cDNA; 克隆 ; 分析
中图分类号 : S 63111　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0120127204
C lon ing and Character iza tion of Full2length cD NA of R sC YP86M F Gene
from R aphanus sa tivus L.
W ang L ingp ing, Cao J iashu3 , Ye W anzhi, Xiang Xun, and Yu Xiaolin
( Institu te of V egetable Science, Zhejiang U niversity, Hangzhou 310029, China)
Abstract: By SMART RACE RT2PCR strategy with gene specific p rimers, the full2length cDNA of a cy2
tochrome P450 gene named R sCYP86M F was cloned from R aphanus sa tivus L. The cDNA was 1818 bp, it en2
compassed a open reading frame (ORF) with 1581 bp encoding 526 am ino acid residues. the sequences of
deduced am ino acids encoded by cytochrome P450 genes showed the high identity of 90% between Raphanus
sa tivus L. and B rassica cam pestris subsp. ch inensis, and also highly conserved domains of function. It had a
conserved domain of cytochrome P450 cysteine heme2iron ligand signature ( FNAGPRLC IG) , which is typ ical
of cytochrome P450, and the structure domains such as N2glycosylation.
Key words: R aphanus sa tivus L. ; RsCYP86M F gene; cDNA; Cloning; Characterization
1　目的、材料与方法
Ye等〔1〕在白菜 (B rassica cam pestris subsp. ch inensis, syn. B. rapa L. subsp. ch inensis) 中分离到一
个细胞色素 P450基因 CYP86M F (AY029178) , 并通过反义基因技术在白菜、菜薹〔2〕等作物上获得了
不育株 , 证实其与植物的雄性不育相关。为了进一步研究 CYP450基因 CYP86M F与植物的雄性不育、
小孢子发育的关系和其在进化过程中的作用 , 我们以萝卜品种 ‘圆白 ’为材料 , 根据白菜 CYP450基
因 CYP86M F保守序列设计引物 , 利用 RT2PCR和 5pi/3piRACE相结合的方法克隆了一个 CYP450基因的
cDNA全长序列 , 并对它进行了序列分析 , 为 CYP450基因的分离克隆及其在植物发育代谢中的功能
研究提供一定的信息。
试验所用材料为萝卜品种 ‘圆白 ’ (R aphanus sa tivus L. ‘Yuanbai’) , 为浙江大学蔬菜研究所提
供。末端转移酶、Agrose Gel DNA Extraction Kit、H igh Pure PCR Product Purification Kit等均为V2gene
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公司产品 , AMV反转录酶、pGEM 2T easy vector、酶 ECOR I为美国 Promega公司产品。
参照 Invitrogen公司的 TR IzoL试剂○R盒说明书提取植物总 RNA , 3pi/5piRACE参照 CLONTECH公司
的 SMARTTM RACE cDNA Amp lification Kit试剂盒。根据 AY029178基因序列的保守区 , 设计的基因特
异引物分别为 : Primer 1: 5pi2GGTATCTTTAACGCTGATGAT23pi, Primer 2: 5pi2GATCCATCTCTCTGGTC2
CGAA23pi; 5piRACE的上游 ( Forward) 引物 5P1: 5pi2GTTGAAGGACCAATCTCGTTACC23pi; 3piRACE下游
(Reverse) 引物 2 条 : 3P1: 5pi2GCTGGGCGTGACACAAGTTCTG23pi; 3P2: 5pi 2CCCACCAATCCCAATG2
GAGATG23pi。参照 SMARTTM cDNA Amp ification Kit设计 5pi锚定引物 : 5pi 2AAGCAGTGGTATCAACG2
CAGAGT23pi, 3pi锚定引物 : 5pi2AGGCCGAGGCGGCCGACATGTTTT23pi。PCR扩增条件为 94 ℃变性 40 s,
53～ 62℃退火 40 s, 72 ℃延伸 90 s, 共 35个循环后 , 72 ℃延伸 10 m in。PCR产物用 Agrose Gel DNA
Extraction Kit回收 , 与 pGEM 2T easy vector连接 , 转化至 TGl感受态细胞 , 在平板上筛选白斑 , 提取
小量质粒 , 用 PCR扩增、ECOR I酶切电泳鉴定为阳性克隆后送去上海博亚生物技术公司测序。
测序结果用 DNASTAR软件进行分析排序。并通过 http: / /www1EMBL2Heidelberg1de对其所编码
的蛋白质二级结构进行预测。
2　结果与分析
211　R sC YP86M F特异片段和 5piRACE和 3pi RACE扩增
用保守的基因特异引物进行 PCR扩增 , 获得一条长约 900 bp的条带 (图 1, A ) , 测序后除去引
物核苷酸得到的片段长度为 912 bp。5piRACE采用基因特异性引物仅一轮扩增即得到一条约为 1 kb的
片段 (图 1, B) , 产量及特异性均很好 , 与预期片段大小相符。3piRACE首轮扩增中引物扩增有预期
条带出现 , 但特异性不好 , 用内侧引物对首轮扩增产物进行巢式 PCR, 得到一条约 600 bp的稍短的
特异条带 (图 1, C) , 比较两次扩增结果相差大约 100 bp, 与预期结果相符。产物回收克隆 , 重组质
粒经酶切后电泳结果与预期片段大小相符 (图 1, D )。
图 1　RsCYP86M F基因的 PCR扩增和重组质粒酶切鉴定结果
A: RsCYP86M F特异片段的电泳检测结果 ; B: 5piRACE扩增产物的电泳检测结果 ; C: 3piRACE扩增产物的电泳检测结果 ;
D: 5pi/3piRACE质粒酶切的电泳结果。M: 核酸的 100 bp ladder DNA标准分子量 ; 1 (A) : R sCYP86M F特异片段 PCR产物 ;
1 (B) : 5piRACE扩增产物 ; 1 (C) : 3piRACE第 1次循环扩增结果 ; 2 (C) : 3piRACE巢式 PCR扩增产物 ; 1和 2 (D) :
5piRACE质粒酶切结果 ; 3和 4 (D) : 3piRACE质粒酶切结果。
F ig. 1　The electrophoresis results of RsCYP86M F gene PCR products and d igested recom b inan t pla sm id
E lectrophoresis of R sCYP86M F gene fragment (A) , 5piRACE (B) , 3piRACE (C) and 5pi/3piRACE p lasm ids restriction (D). Lane M: 100 bp
ladder DNA marker; Lane 1 (A) : special fragment of RsCYP86M F; Lane 1 (B) : amp lification results of 5piRACE; Lane 1 (C) : the
p rimary amp lification result of 3piRACE; Lane 2 (C) : the nested PCR p roduct of 3piRACE; Lane 1 and 2 (D) : Restriction results of
5piRACE p lasm ids; Lane 3 and 4 (D) : Restriction results of 3piRACE p lasm ids.
212　cD NA全长序列分析
对克隆到的保守片段和 RACE产物进行测序 , 结果表明 : 该 cDNA全长为 1818 bp, 含有 1581 bp
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　1期 王玲平等 : 萝卜 R sCYP86M F基因 cDNA全序列克隆及结构特征分析 　
的完整开放阅读框 , 其全序列和推测的氨基酸序列如图 2, 拟将此基因命名为 RsCYP86M F。在启始密
码子 ATG的 - 3位为 A符合 Kozak规律 , 在该阅读框终止密码子 TAG下游同一框内含有多个终止密
码子 , 并有 AATAAA加尾信号 , 这些都符合有效翻译的基因全长 cDNA的特征〔3〕。此基因 5pi端非翻
译区 104个核苷酸 , 3pi端非翻译区 133核苷酸 , 开放阅读框编码 526个氨基酸 , 预计其分子量为 6019
kD, 推测的等电点 81686。通过 PROSITE数据库检索发现此基因在 455～ 464 ( FNAGPRLC IG) 处有
CYP450典型的高度保守的结构 FxxGxRxCxG, 这一基元常被用做鉴定 P450蛋白的主要特征。
图 2　RsCYP86M F的 cD NA核苷酸序列及其翻译的氨基酸序列
加方框的氨基酸表示细胞色素半胱氨酸亚铁血红素配体信号区 , 加单横线的氨基酸表示蛋白激酶 C磷酸化位点 , 加双横线的
氨基酸表示 N - 糖基化位点 , 加双框的氨基酸表示依赖于 cAMP和 cGMP的蛋白激酶磷酸化位点 , 加阴影的氨基酸表示酪蛋
白激酶 II磷酸化位点 , 加双虚线的氨基酸表示细胞附加序列 , 加单虚线的氨基酸表示 N端酰基化位点。
F ig. 2　The full2length of nucleotide and am ino ac id sequence of RsCYP86M F
The am ino acids boxed are cytochrome P450 cysteine heme2iron ligand signature; the am ino acids underlined by a single thin line are
p rotein kinase C phosphorylation site; the am ino acids underlined by a doubled thin line are N2glycosylation site; the am ino acids
boxed by double lines are cAMP2and cGMP2dependent p rotein kinase phosphorylation site; the am ino acids shaded are casein
kinase II phosphorylation site; the am ino acids underlined by a doubled discontinuous line are cell attachment sequence; the
am ino acids underlined by discontinuous lines are N2myristoylation site.
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213　推测的氨基酸序列同源性比较
将 R sCYP86M F基因所编码的蛋白序列与从 EMBL核酸序列库及 SW ISSPROT蛋白序列库中得到的
白菜 (AY029178)、拟南芥 (A t 1g 13150、A t 1g 13140、A t 3g 26125、A t 1g 24540)、水稻 (NM _
197082)、小麦 (AF123609 ) 等物种的 CYP450 基因相比对 , 发现它们在氨基酸上分别有 90%、
84%、41%、41%的同源性 , 而与拟南芥 CYP86家族所有成员在氨基酸上的同源性均大于 38%。根
据 Nelson〔4〕等对 CYP450酶的命名原则 , 判断所克隆的 R sCYP86M F基因属于 CYP86C亚家族 ; 运用
CLUASTAL W软件对这几个材料的氨基酸序列排序 , 发现它具有很高的功能区段保守性 (图 3)。
图 3　RsCYP86M F蛋白和其他蛋白保守区排序比较
F ig. 3　A lignm en ts of the con servesd doma in of the deduced am ino ac id encoded by RsCYP86M F w ith other prote in s
214　编码蛋白质的二级结构预测
将所翻译的氨基酸序列提交 EMBL进行蛋白质二级结构预测 , 发现此蛋白质的螺旋分布于整个蛋
白质 , 因此结构较为紧密 ; 通过 PROSITE数据库比较 , 发现它具有以下可能的基序 : 1个 N -糖基化
位点 (278NRSD) , 1个依赖于 cAMP和 cGMP的蛋白激酶磷酸化位点 (407 KKGS) , 12个蛋白激酶 C磷
酸化位点 (4 TER, 34 TKK, 65 SLK, 130 SW K, 144 STR, 155 TQR, 160 SKK, 247 SLR, 302 TIR, 363 TVR, 380 TLR, 484 SIK) ,
5个酪蛋白激酶 Ⅱ磷酸化位点 (2 SLTE, 12 SLFD , 130 SW KE, 172 SSQE, 363 TVRE) , 3个 N 端酰基化位点
(82 GSYGAV, 122 GIFNAD , 506 GLKVTI) , 1个细胞附加序列 (353 RGD ) , 1个细胞色素半胱氨酸亚铁血红
素配体信号区 (455 FNAGPRLC IG)。
本试验为今后细胞色素 P450基因全长的获得及相关功能的研究奠定了基础。
参考文献 :
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3　张庆华 , 茅　矛 , 陈　竺. 基因组研究中全长 cDNA克隆的策略. 生物工程进展 , 2000, 20 (4) : 3～5
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