全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (3) : 621～624
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 10 - 18; 修回日期 : 2006 - 01 - 16
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30370988)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: ywteng@ zju1edu1cn)
部分中国砂梨和日本梨的 RAPD分析
沈玉英 1, 2 　滕元文 1 3 　田边贤二 3
( 1 浙江大学园艺系 , 农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室 , 浙江杭州 310029; 2 杭州万向职业技术学
院生物技术系 , 浙江杭州 310023; 3 鸟取大学农学部 , 鸟取 680 - 8553, 日本 )
摘 　要 : 采用 RAPD分子标记技术 , 对来自福建和浙江的 6份中国砂梨和 36份日本梨的亲缘关系进行
了分析。27个引物产生了可记录的多态性条带 261条。聚类分析将这些梨品种和类型分为 4个中国砂梨群
和 5个日本梨群。其中 4个日本梨群中都包含有日本高知县的品种或类型。尽管由于取样的偏差 , 中国砂
梨和日本梨在聚类分析中没有混合聚为大群 , 但中国砂梨品种与部分日本梨 , 特别是来自高知县的日本梨
的相似系数高于与中国梨之间的相似系数。
关键词 : 梨 ; RAPD标记 ; 聚类分析
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0320621204
RAPD Ana lysis for Genetic A ssessm en t of Som e Cultivars of Pyrus pyrifolia
D er ived from Ch ina and Japan
Shen Yuying1, 2 , Teng Yuanwen13 , and Tanabe Kenji3
(1D epartm ent of Horticu lture, Zhejiang U niversity, the S tate A gricu ltura lM inistry L aboratory of Horticultural P lant Grow th /D evel2
opm ent & B iotechnology, Hangzhou, Zhejiang 310029, China; 2D epartm ent of B iotechnology, Hangzhou W anxiang Poly technic,
Hangzhou, Zhejiang 310023, Ch ina; 3 Faculty of A gricu lture, Tottori U niversity, Tottori 680 - 8553, Japan)
Abstract: The p resent study, using RAPD analysis, was undertaken to characterize genetic variation in
Japanese pears and Chinese sand pears, as well as their genetic relationship s. The materials used consisted of
36 Japanese pears and 6 Chinese accessions from Zhejiang and Fujian p rovinces. A total of 27 p rimers genera2
ted 261 scorable polymorphic RAPD bands. Clustering analysis revealed 9 group s: 4 consisting of Chinese
sand pears and 5 from Japan, of which 4 Japanese pear group s contained cultivars or types from Kouchi Prefec2
ture, Japan. Chinese sand pears and Japanese pears were not m ingled together into group s due to samp ling bi2
as. However, Chinese sand pear cultivars showed higher affinities to some Japanese pears, especially those
from Kouchi p refecture than to Chinese ones.
Key words: Pear; RAPD marker; Cluster analysis
1　目的、材料与方法
日本梨品种的起源一直存有争议。菊池秋雄认为日本梨的栽培品种是从日本野生的 P. pyrifolia Na2
kai中演化而来〔1〕。但近年果实外观等特性的调查〔2〕及同工酶分析〔3〕表明 , 部分日本梨品种与中国和朝
鲜半岛的梨品种非常相近 ; 本文通讯作者曾利用 RAPD标记对原产于中国、日本和朝鲜半岛的梨属植物
种和品种做过比较 , 发现部分日本梨特别是来自日本高知县的地方品种和中国砂梨亲缘关系很近〔4, 5〕。
为此 , 作者在日本高知县的山区调查采集了还没有收集保存过的梨类型 , 也采集了一些在作者以前的试
验中没有包括的日本古老品种 , 利用 RAPD分析 , 进一步探讨日本梨和中国砂梨的亲缘关系。
中国砂梨品种全部采自中国农业科学院果树研究所国家梨种质资源圃 , 中国野生砂梨的一个类型
和部分日本梨采自日本鸟取大学附属农场品种资源圃 , 高知类型均实地采自高知县境内 (表 1)。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
表 1　供试砂梨材料
Table 1　Accession s of Pyrus pyrifo lia
编号 Code 品种 Cultivars 起源地 O rigin 编号 Code 品种 Cultivars 起源地 O rigin
1 饼子梨 B ingzili 福建 Fujian 22 高知 11 Kouchi 11 高知县 Kouchi Pref.
2 满顶雪梨 Mandingxueli 福建 Fujian 23 高知 12 Kouchi 12 高知县 Kouchi Pref.
3 秋白砂梨 Q iubaishali 福建 Fujian 24 高知 13 Kouchi 13 高知县 Kouchi Pref.
4 义乌梨子 Yiwulizi 浙江 Zhejiang 25 高知 24 Kouchi 24 高知县 Kouchi Pref.
5 棕包梨 Zongbaoli 福建 Fujian 26 高知 25 Kouchi 25 高知县 Kouchi Pref.
6 野生砂梨 P. pyrifolia 中国 China 27 高知 27 Kouchi 27 高知县 Kouchi Pref.
7 天之川 Amanokawa 高知县 Kouchi Pref. 28 高知 29 Kouchi 29 高知县 Kouchi Pref.
8 长十郎 Chojuro 神乃川县 Kanagawa Pref. 29 高知 31 Kouchi 31 高知县 Kouchi Pref.
9 朝鲜 Chousen 群马县 Gunma Pref. 30 高知 50 Kouchi 50 高知县 Kouchi Pref.
10 福岛 Fukushima 未知 Unknown 31 黑木 Kuroki 未知 Unkown
11 迎春 Geishun 未知 Unknown (Nagano?) 32 大古河 Ookoga 新　县 N iikata Pref.
12 市原早生 Ichiharawase 高知县 Kouchi Pref. 33 Onba 岛根县 Shimane Pref.
13 今村秋 Imamuraki 高知县 Kouchi Pref. 34 二十世纪 N ijisseiki 千叶县 Chiba Pref.
14 河内古木 Kawauchikoboku 广岛县 H iroshima Pref. 35 下市古木 Shimoichikoboku 奈良县 Nara Pref.
15 高知 1 Kouchi 1 高知县 Kouchi Pref. 36 霜被 Shimokaburi 九州地区 Kyushu region
16 高知 2 Kouchi 2 高知县 Kouchi Pref. 37 称名寺梨 Shoumyoujinashi 未知 Unknown
17 高知 4 Kouchi 4 高知县 Kouchi Pref. 38 Tsukushiinunashi 九州地区 Kyushu region
18 高知 5 Kouchi 5 高知县 Kouchi Pref. 39 Tsukutounashi 未知 Unknown
19 高知 6 Kouchi 6 高知县 Kouchi Pref. 40 津轻青 Tsugaruao 青森县 Aomori Pref.
20 高知 7 Kouchi 7 高知县 Kouchi Pref. 41 马次郎 Umajiro 高知县 Kochi Pref.
21 高知 8 Kouchi 8 高知县 Kouchi Pref. 42 吉野古木 Yoshinokoboku 奈良县 Nara Pref.
改良 SDS法提取总基因组 DNA〔3〕。RAPD的最佳反应条件参照文献 〔4〕。PCR反应在 Thermocy2
cler (Model 480; Perkin /Elmer, Norwalk, Conn. USA ) 上进行。反应程序为 : 95℃ 5 m in; 然后以
95℃ 1 m in, 37℃ 115 m in, 72℃ 2 m in, 45个循环 ; 72℃ 5 m in, 4℃保存备用。RAPD引物采用经过
筛选的对梨有效的 Kit A、C和 26中的部分引物 (Operon Technologies, A lameda, Calif. USA )〔4～6〕
(表 2)。10μL扩增产物在 85～90 V下 , 采用 2%的琼脂糖凝胶在含有溴化乙锭的 TAE buffer ( 40
mmol/L Tris2acetate, 1 mmol/L EDTA , pH 810) 中电泳 3 h, 于紫外检测仪上观察照相。DNA Marker
为经 EcoR I和 H ind III消化后的 Lambda DNA片段。将电泳谱带上清晰且重复性的条带计为 1, 相对
应位置没有条带者则计为 0, 形成原始矩阵。用 NTSYS - PC (2102 j) 软件计算相似性系数 , 得到相
似性系数矩阵 , UPGMA法进行聚类分析 , 生成聚类图。
2　结果分析与讨论
211　 RAPD标记的特征
利用优化的反应程序 , 得到了清晰的 RAPD多态性谱带 , 同一样品 (高知 50) 的 3次独立反应
图 1　用引物 O PC209产生的 20个梨品种或类型的 RAPD图谱
编号代表材料见表 1。
F ig. 1　RAPD prof iles for 22 pear cultivars using O PC209
See Table 1 for accessions code.
226
　3期 沈玉英等 : 部分中国砂梨和日本梨的 RAPD分析 　
表明了良好的重复性 (图 1)。所用 27个 RAPD引物共产生了 261条可以记录的多态性条带 , 大部分
在 200～2 000 bp之间 , 平均每个引物产生 917个 (表 2) , 表明供试材料具有丰富的遗传多样性。本
试验每对引物扩增的可记录的多态性条带数少于以前的报道〔4～6〕, 可能是本次试验中没有包括西洋梨
品种和其他东方梨种之故。
表 2　27个 RAPD引物的碱基序列和可记录的多态性谱带
Table 2　27 pr im ers used in RAPD ana lysis, the ir sequence, num ber of scorable polym orph ic bands
引物
Primer
序列
Sequence
(5’ - 3’)
多态性带
Scorable
polymorphic
bands
引物
Primer
序列
Sequence
(5’ - 3’)
多态性带
Scorable
polymorphic
bands
引物
Primer
序列
Sequence
(5’ - 3’)
多态性带
Scorable
polymorphic
bands
OPA207 GAAACGGGTG 14 OPC205 GATGACCGCC 8 OP226205 GGAACCAATC 6
OPA209 GGGTAACGCC 15 OPC206 GAACGGACTC 7 OP226208 TGGTAAAGGG 7
OPA210 GTGATCGCAG 6 OPC207 GTCCCGACGA 14 OP226215 GATCCAGTAC 13
OPA211 CAATCGCCGT 11 OPC208 TGGACCGGTG 7 OP226216 GATCACGTAC 4
OPA212 TCGGCGATAG 14 OPC209 CTCACCGTCC 10 OP226218 GATCTCAGAC 6
OPA216 AGCCAGCGAA 13 OPC211 AAAGCTGCGG 9 OP226220 GATCAATCGC 15
OPA218 AGGTGACCGT 8 OPC214 TGCGTGCTTG 9 OP226222 GATCGCATTG 7
OPA219 CAAACGTCGG 10 OPC219 GTTGCCAGCC 10 OP226224 GATCATAGCC 12
OPA220 GTTGCGATCC 9 OP226202 TGGATTGGTC 8 OP226225 GATCTAAGGC 9
212　聚类分析
品种间的 D ice 相似系数从 ‘津轻青 ’和
‘黑木 ’之间的 014813到 ‘高知 50’和 ‘今村
秋 ’之间的 019749, 系统关系树如图 2, 共形成
9个大群 ( Group)。中国砂梨没有形成一个单独
的群 , 而是分散地形成 4个大群 : 单独或者两两
成群。日本梨品种形成了 5个大群 , 高知县的品
种和类型分布在日本梨的 4个大群里。
第 Ⅰ群集中了大部分日本梨品种 , 由高知县
的品种和来自日本其他地方的品种组成。本群可
以进一步的分成几个小群 ( Subgroup )。几乎每个
小群中都包含高知县的品种。有些品种之间的最
末端的连接反映了其起源地 , 如 ‘二十世纪 ’和
‘长十郎 ’是日本关东地方起源的品种 , 属于末
端连接。但起源于高知县以外的大部分品种的末
端连接者都是高知县的品种 , 如新 　县的 ‘大古
河 ’与高知县的 ‘天之川 ’, 广岛县的 ‘河内古
木 ’与 ‘高知 8’, 群马县的 ‘朝鲜 ’与高知县
的 ‘今村秋 ’和 ‘高知 50’等。这虽然不能排
除由于本研究中高知县的品种数量较多可能形成
聚类偏差 , 但另一方面也可能说明高知县的品种
图 2　根据 D ice相似系数采用 UPGM A聚类方法生成的
36个日本梨和 6个中国砂梨的系统关系树
编号代表材料见表 1。
F ig. 2　D endrogram of 36 Japanese pears
and 6 Ch inese accession s
See Table 1 for accessions code.
具有丰富的遗传多样性 , 也同时暗示日本其他地方的梨品种的起源可能与高知县的品种有直接关系。
作者在只包括少量高知县品种的试验中也曾观察到类似的现象〔4〕。
第 Ⅱ群由日本高知县的 ‘马次郎 ’和奈良县的 ‘吉野古木 ’组成。第 Ⅲ群由中国浙江省的 ‘义
乌梨子 ’和福建省的 ‘秋白砂梨 ’构成。福建省的 ‘棕包梨 ’单独形成第 Ⅳ群。高知县的两个类型
326
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
‘高知 4’和 ‘高知 5’聚类形成第 Ⅴ群。中国原产的野生砂梨 ( P. pyrifolia) 和 ‘高知 31’分别独
自成为第 Ⅵ群和第 Ⅶ群。‘饼子梨 ’和 ‘满顶雪梨 ’均来自福建省 , 形成了第 Ⅷ群。‘津轻青 ’原产
日本青森县 , 独自成为第 Ⅸ群 , 和其他品种和类型的亲缘关系较远。该品种可能来自中国 , 不属于砂
梨系统〔7〕。
日本梨和中国砂梨同属 P. pyrifolia, 但对于两者之间的关系一直存在争议。分析本研究中所用中
国砂梨和日本梨的相似系数 , 除‘饼子梨 ’和‘满顶雪梨 ’显示了最近的亲缘关系外 , 其余中国砂梨
品种皆与日本梨具有最高的相似系数 , 而不是与同类的中国砂梨。如 ‘义乌梨子 ’和日本的
‘Tsukutounashi’的相似系数达 017014, 而与和它构成一群的中国品种 ‘秋白砂梨 ’的相似系数只有
0164789。虽然 ‘Tsukutounashi’和本试验中所有日本梨的平均相似系数只有 016322, 远远低于与
‘义乌梨子’的 017014, 但它和 ‘Kouchi 11’的相似系数达 0175, 所以它们聚在一起 , 而不是和中
国 ‘义乌梨子 ’聚在一起。这也是与日本梨具有较高相似系数的其它中国梨品种没有和日本梨聚在
一起的原因。我们推测和中国梨具有较高相似系数的这些日本梨的祖先可能来自中国 , 这些来自中国
的梨经过长期的演变 , 包括实生繁殖、相互杂交等形成独特的类型 , 其中一部分较原始的类型保留了
和中国梨较近的亲缘关系 , 但后来演化的品种则可能逐渐远离了它们的祖先。
‘下市古木 ( Shimoichikoboku) ’是日本奈良县的半栽培类型 , 在以前的研究中 , 和中国砂梨及白
梨组成了一个亚群〔4〕, 本研究中它和中国的 ‘义乌梨子 ’和 ‘饼子梨 ’显示了很近的亲缘关系。来
历不名的 ‘Tsukutounashi’分别和中国的 ‘义乌梨子 ’和 ‘棕包梨 ’表现出近缘关系。‘称名寺梨
( Shoumyoujinashi) ’分别与中国的 ‘义乌梨子 ’和 ‘饼子梨 ’有较高的相似系数。‘棕包梨 ’与 ‘高
知 11号 ’、‘秋白砂梨 ’与 ‘长十郎 ’分别显示了最高的相似系数。
历史上 , 中国宁波 —日本鹿儿岛 —高知县 —大阪的堺市是中国和日本进行贸易的一条非常重要的
海路。中国砂梨很可能通过这条路线传到日本九州的鹿儿岛和四国的高知 , 再由这些地方传到日本其
他地方繁殖选育 , 形成了现在的日本梨系统。为了全面了解日本梨品种的演化和与中国砂梨的关系 ,
尚需要收集鹿儿岛地区的地方品种 , 扩大中国梨的取样数量 , 用不同的 DNA标记进行研究。
参考文献 :
1　Kikuchi A. Horticulture of fruit trees, Vol. 1. Tokyo: Yokendo, 1948. 64～120
2　Kajiura I. Suzuki S. Variations in fruit shapes of Japanese pear cultivars ( Pyrus serotina Rehder var. culta Rehder) : Geographic differentiation
and changes. Jpn. J. B reeding, 1980, 30: 309～328
3　Jang J T, Tanabe K, Tamura F, Banno K. Identification of Pyrus species by leaf peroxidase isozyme phenotypes. Journal of the Japanese Socie2
ty for Horticultural Science, 1992, 61: 273～286
4　Teng Y, Tanabe K, Tamura F, Itai A. Genetic relationship s of Pyrus species and cultivars native to East A sia revealed by random ly amp lified
polymorphic DNA markers. Journal of the American Society for Horticultural Science, 2002, 127: 262～270
5　Teng Y, Tanabe K, Tamura F, Itai, A. Genetic relationship s of pear cultivars in Xinjiang, China as measured by RAPD markers. Journal of
Horticultural Science & B iotechnology, 2001, 76: 771～779
6　Monte2CorvoǎL, Cabrita L, O liveira C, LeitÃo J. A ssessment of genetic relationship s among Pyrus species and cultivars using AFLP and RAPD
markers. Genetic Resources and Crop Evolution, 2000, 47: 257～265
7　Kajiura I, Sato Y. Recent p rogress in Japanese pear ( Pyrus pyrifolia Nakai) breeding and descrip tions of cultivars based on literature review.
Bulletin of Fruit Trees Research Station Extra, 1990, 1: 1～329
426