全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (5) : 1007～1010
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 12 - 22; 修回日期 : 2006 - 04 - 07
基金项目 : 教育部博士点基金资助项目 (2002061088)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: cfang@2631net)
苦瓜 BAG基因组织特异性表达研究
彭书明　唐　琳　叶　杨　樊哲仁　刘彦君　陈　放 3
(四川大学生命科学学院 , 四川成都 610064)
摘 　要 : 实时荧光定量 RT2PCR分析表明 : 苦瓜 BAG基因仅在心皮、雄蕊、花萼和幼果中表达 , 花瓣
中没有表达。心皮中表达水平远远高于其它组织 , 为雄蕊的 77倍之多 ; 在幼果、雄蕊和花萼中有低水平的
表达。因此 BAG基因直接参与苦瓜花和果实发育 , 尤其对心皮的发育起着关键的作用。
关键词 : 苦瓜 ; 基因表达 ; 实时荧光定量 RT2PCR; MADS2box基因 ; BAG
中图分类号 : S 64215　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0521007204
Stud ies on T issue2spec if ic Expression of B itter Gourd BAG Gene
Peng Shum ing, Tang L in, Ye Yang, Fan Zheren, L iu Yanjun, and Chen Fang3
(College of L ife Science, S ichuan U niversity, Chengdu, S ichuan 610064, China)
Abstract: In this study, we adop ted a sensitive and reliable quantitative real2time RT2PCR assay for
measuring the BAG mRNA exp ression levels ofM om ord ica cha ran tia L. The results showed that the exp ression
of BAG was only p resent in carpel, stamen, calyx, and young fruit but none in petal. H igh mRNA levels were
detected in carpel and low mRNA levels in stamen, calyx and young fruit. A ll these data demonstrated BAG
gene participates in development of flower and fruit, especially having a key role in carpel development.
Key words: M om ord ica charan tia L. ; Gene exp ression; Quantitative real2time RT2PCR; MADS2box
gene; BAG
BAG基因是从苦瓜中克隆得到的第 1个 MADS盒基因〔1〕。MADS盒基因存在于整个真核生物界 ,
在生物发育全过程中起着重要的调节作用。MADS盒基因的命名由 M CM 1 (酵母 )〔2〕、AGAMOUS (拟
南芥 )〔3〕、D EF IC IEN S (金鱼草 )〔4, 5〕和 SR F (人类 )〔6〕的首写字母组成 , 它们具有共同的约 56个氨
基酸的高度保守序列 , 为蛋白质结合和蛋白质相互作用的一个保守结构域〔7〕。Becker等〔8〕依据进化
关系 , 将植物 MADS盒基因分成 12个族 , BAG基因属于其中 AG族 , 它们的功能主要限制在雄性或
雌性生殖器官 (包括胚珠和果实 )。苦瓜是雌雄同株植物 , 花发育过程首先要经过一个两性期 , 然后
再分化成雌花或雄花〔9〕。苦瓜是研究性别分化的典型材料 , 在克隆得到 BAG基因后 , 作者又从苦瓜
中克隆得到 2 个 MADS2box 基因 (M CAG2 和 M CAG6, GenBank 登录号分别为 DQ299943 和
DQ431247) , 并采用了实时定量 RT2PCR方法 , 比较分析这 3个 MADS2box基因的表达模式 , 目前实
时荧光定量 RT2PCR方法多用于临床病理检测 , 作者尝试利用其研究 MADS盒 BAG基因在各组织的
表达情况 , 探索苦瓜花发育的分子机制。
1　材料与方法
111　材料及 RNA的提取
苦瓜 (M om ord ica charan tia L. ) 品种为 ‘蓝山长白 ’, 种植于四川大学生命科学学院试验田。
E coli. Top 10由本实验室保存。按照植物叶 RNA (小量 ) 抽提试剂盒 (华舜 , 上海 ) 的方法 , 分别
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从苦瓜根、茎、叶、花蕾、花萼、心皮、花瓣、雄蕊、茎尖和幼果中提取 RNA , 采用 RNase2free
DNase试剂盒除去 DNA污染 , 所得 RNA立即反转录或 - 80℃储存备用。
112　RT2PCR分析
取 11μL总 RNA , 加入 4μL 5 ×AMV缓冲液、2μL 10 mmol·L - 1 dNTPs、015μL 50 mmol·L - 1
O ligod ( T) 18引物、015μL RNase抑制剂和 2μL AMV反转录酶 , 轻轻混匀 , 冰上放置 10 m in, 然后
42℃水浴 30 m in, 冰上放置 2 m in, - 20℃储存备用。
反转录所得 cDNA分别进行 5倍梯度稀释 ( 1、1 /5、1 /25、1 /125、1 /625) 用于对照基因 18S
rRNA ( GenBank序列号 AY900000) 扩增。总体积 25μL, 包括 215μL 10 ×PCR 缓冲液 , 115μL
MgCl2 (25 mmol·L - 1 ) , 2μL dNTPs (215 mmol·L - 1 ) , 2μL cDNA , 1μL M C18S1 (20μmol·L - 1 ,
5pi2CTG AGA AAC GGC TAC CAC AT23pi) , 1μL M C18S2 (20μ mol·L - 1 , 5pi2GAG CGT AGG CTT GCT
TTG AG23pi) , 012μL rTaq。反应条件为 : 95℃预变性 4 m in; 94℃变性 30 s、55℃退火 30 s、72℃延
伸 60 s, 共 35个循环 ; 72℃延伸 7 m in。BAG基因扩增所需模板分别进行 4倍梯度稀释 ( 1、1 /4、
1 /16、1 /64、1 /256)。PCR扩增体系为 25μL, 包括 215μL 10 ×PCR 缓冲液 , 115μL MgCl2 ( 25
mmol·L - 1 ) , 2μL dNTPs (215 mmol·L - 1 ) , 2μL cDNA , 1μL BAGF (20μmol·L - 1 , 5pi2CCG TGG
TCG CCT CTA TGA23pi) , 1μL BAGR (20μmol·L - 1 , 5pi2CGA GAA GCC AAT GCC TGA23pi) , 012μL
rTaq。PCR反应条件同 18S rRNA。PCR产物胶回收、克隆并测序。
113　实时荧光定量 RT2PCR分析
cDNA第 1链按 ExScrip tTM RTase说明合成。将所得 cDNA分别稀释 20倍 , - 20℃储存备用。
目的基因和内参基因标准品的制备 : 将雌花蕾总 RNA反转录成 cDNA, 利用苦瓜 18S rRNA 和
BAG特异引物对 (MC18 sA: 5pi2GTT TGA TGG TAT TTG CTA CTC GG23pi, MC18 sB: 5pi2CTG GTC GGC
ATC GTT TAT GGT TG23pi; BAGORF1: 5pi2TAA GGA TCC AGA GGG TGG AAG ATG GGG A23pi, BA2
GORF2: 5pi2GAC GAG CTC CTC CAA AAG TAG CTG CCA ACA23pi) PCR扩增苦瓜 18S rRNA (932 bp )
和 BAG基因 (741 bp) 片段 , 胶回收 , 利用紫外分光光度计 ( Puxi tu21800, 北京 ) 测定回收 DNA片
段 OD260值 , 并换算成浓度 , 10倍梯度稀释即得标准品。
实时荧光定量 RT2PCR: 定量 RT2PCR采用 iCycler iQTM荧光实时多波长 PCR检测系统 (B io2RAD,
US) 对样品 cDNA和标准 DNA片段模板进行扩增、检测和相对定量分析。相对定量选用 18S rRNA作为
内参基因 , 反应总体系为 25μL, 冰上配制以下组分 : 1215μL 2 ×SYBR Prem ix Ex TaqTM、015μL 10
μmol·L - 1 M C18s R tim e1 (5pi2TGC CCG TTG CTC TGA TGA TTC23pi)、015μL 10μmol·L - 1 M C18s R tim e2
(5pi2CTG CTG CCT TCC TTG GAT GTG23pi)、2μL cDNA, 反应采用热启动模式 : 95℃变性 3 m in, 然后 40
个循环 : 95℃变性 10 s、59℃退火 15 s、72℃延伸 15 s, 荧光采集设在每次循环的第 3步 , 最后 95℃变
性 1 m in, 退火至 55℃保温 1 m in, 每隔 10 s上升 015℃, 并检测荧光值 , 绘制熔点曲线。待测基因反应
体系同 18S rRNA , 反应所用的引物为 : BAG R tim e1: 5’2AGA ATA GGC TTG AAA GAG GCA TC23’和
BAG R tim e2: 5pi2GTG ACA GCT CCA CCT TCC ATC23pi, 也采用热启动模式 : 95℃变性 3 m in, 然后 40个
循环 : 95℃变性 10 s、58℃退火 15 s、72℃延伸 16 s, 每次循环第 3步进行荧光采集 , 最后 95℃变性 1
m in, 退火至 55℃保温 1 m in, 每隔 10 s上升 015℃, 检测荧光值 , 绘制熔点曲线。标准曲线分别选取拷
贝数在 1 ×102 ～1 ×108 个的 18S rRNA和 BAG标准品为模板 , 反应条件同上。标准品 DNA设置 2个重
复 , 待测样品 3个重复。标准曲线和基因表达水平由系统自动分析 , 基线由软件自动设置。
2　结果与分析
211　RNA质量检测和 RT2PCR分析结果
采用分光光度法检测提取的 RNA样品 , 所提取的 RNA OD260 /280均在 118～210之间 , OD260 /230均
大于 213, 表明所得 RNA质量高 , 可用于进一步 RT2PCR分析。图 1为 RT2PCR分析 BAG基因在苦瓜
8001
　5期 彭书明等 : 苦瓜 BAG基因组织特异性表达研究 　
根、茎、茎尖、叶、雌花蕾、雄花蕾和幼果间的表达模式 , 以苦瓜 18S rRNA 为对照。结果表明 ,
BAG基因在雌花蕾中高表达 , 在雄花蕾和幼果中可见较低的表达 , 在根、茎、叶和茎尖中没有检测到
其表达 , 说明 BAG基因主要参与生殖器官发育。将 RT2PCR反应所得片段电泳检测 , 分别得到长为
392 bp和 453 bp的特异产物 , 片段胶回收测序证实为预期苦瓜 18S rRNA基因和 BAG基因片段。
图 1　RT2PCR分析 BAG基因表达模式
18S rRNA基因扩增片段长为 392 bp; I～V. cDNA模板浓度从高到低 5倍梯度稀释。
BAG基因扩增片段长度为 453 bp; 1～5. cDNA模板浓度从高到低 4倍梯度稀释。
F ig. 1　RT2PCR ana lysis of BAG expression pa ttern
The amp lification length of 18S rRNA is 392 bp; I - V. Five2fold serially diluent cDNA from high to low.
The amp lification length of BAG is 453 bp; 1 - 5. Four2fold serially diluent cDNA from high to low.
212　标准模板的获得
根据 GenBank登录的苦瓜 18S rRNA 和 BAG
基因序列设计特异引物 , PCR扩增得到约 930 bp
和 750 bp 片段 (图 2 ) , 将所得片段克隆到
pMD182T载体中 , 测序得到长为 924 bp 的苦瓜
18S rRNA和 743 bp的 MADS2box基因 BAG片段。
213　标准曲线分析结果
18S rRNA的回归曲线方程、PCR扩增效率和
相关系数分别为 : Y = - 31409X + 351857、
9615 %和 01997; BAG分别为 : Y = - 31325X + 图 2　苦瓜 18S rRNA和 BAG片段扩增Fig. 2　Amplif ica tion fragments of b itter gourd 18S rRNA and BAGM. DNA marker; Ⅰ. BAG (743 bp) ; Ⅱ. 18S rRNA (924 bp) .
391073、9919%和 01996。苦瓜 18S rRNA和 BAG标准曲线由 iCycleriQTM自动测出。结果表明 : 苦瓜 18S
rRNA和 BAG标准曲线具有好的相关性 , 相关系数均大于 0199, PCR扩增效率高 , 均大于 95% , 说明该
试验重复性好和扩增效率高。经熔点曲线分析 , M C18S rRNA和 BAG均只有 1个 Tm值 , 分别为 88℃和
85℃, 表明 18S rRNA和 BAG所用引物具有很高特异性 , PCR扩增产物均为目的片段 , 不含引物二聚体。
214　BAG基因的相对定量
采用相对定量引入内参基因苦瓜 18S rRNA来
矫正试验过程中各种影响因素归一化反应起始模板
量。定量 PCR结果显示 , 茎尖和花瓣中没有检测
到 BAG基因的表达。将表达量相对最低的花萼表
达水平定为 “1”, 按照相对定量公式 2 -ΔΔCt分析得
到表 1。表 1表明 : BAG基因在心皮中表达水平远
远高于其它组织部位 , 其表达量是雄蕊的 77倍之
多 (表 1) ; 其次是幼果、雄蕊和花萼 , 表达水平
较低 , 且差异不大 , 三者之比为 312∶2104∶1。说明
了 BAG在花四轮发育中主要参与了心皮的形成。
表 1　BAG基因在苦瓜茎尖、幼果和花各部
组织中表达相对拷贝数
Table 1　Rela tive copy num bers of BAG
expression levels in b itter gourd
被检组织
Query tissues 18S rRNA BAG
相对拷贝数 Relative
copy number (2 -ΔΔCt )
花萼 Calyx 15102 28186 　1
心皮 Carpel 15121 21175 157159
花瓣 Petal 16111 - -
雄蕊 Stamen 14159 2714 　2104
幼果 Young fruit 16113 28129 　312
茎尖 Stem apex 15186 - -
9001
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3　讨论
实时荧光定量 RT2PCR技术常常用于对基因 mRNA的表达水平进行分析 , 可以绝对定量或相对定
量 , 结果非常可靠〔10, 11〕, 具有可比性和重复性。可以对低丰度基因表达情况进行研究 , 将试验结果作
图 , 直观地分析基因表达情况。而常规的 RT2PCR和 Northern杂交试验往往难以检测到低丰度表达的基
因。本研究首先对苦瓜 BAG基因在苦瓜的根、茎、叶、茎尖、雌花蕾、雄花蕾和幼果等 7个组织部位进
行了 RT2PCR检测 , 结果说明 BAG基因主要参与生殖器官的发育过程。进一步研究表达情况 , 采用更为
有效和准确的实时荧光定量 RT2PCR方法。该方法所用的 SYBR Green I荧光染料 , 能够在 PCR反应过
程中结合到 DNA双链上。大大降低了定量分析的成本 , 促进了定量 PCR的应用。但是该染料不但能够
与目的 DNA结合 , 还与非特异的 DNA结合 , 因此对其使用 SYBR Green I染料的实时定量 RT2PCR法进
行 PCR反应条件优化非常重要。通过引物设计、退火温度优化、产物的熔点曲线分析 , 避免 PCR反应
过程中产生非特异产物。对于 BAG基因表达分析 , 采用相对定量的方法以 18S rRNA基因作为内参基因 ,
矫正由于样品处理、RT2PCR过程中不同的逆转录效率和 QPCR反应体系中 cDNA加入量的差异 , 归一
化加入反应体系中 cDNA模板的初始浓度 , 使得所有样品目的基因表达水平的比较在相同的水平上进
行 , 从而准确分析 BAG基因在苦瓜中的表达模式。
在花发育的 “ABC”〔12〕模型中 , “C”功能基因决定花的第 3、4轮结构 , 即雄蕊和心皮。定量
PCR分析 BAG基因在心皮和雄蕊中均有表达 , 心皮远远高于雄蕊 , 这与早期对 BAG基因分析的结
果〔1〕一致 , 说明 BAG基因属于 “C”功能基因 , 与苦瓜雄蕊和心皮发育相关 , 尤其对心皮发育起着
关键的作用。定量分析结果还显示 BAG基因在幼果和花萼中也有表达 , 在幼果中的表达是雄蕊的
1157倍 , 花萼的为雄蕊的 0149倍 , 因此 BAG基因还可能参与了花萼的发育和后期幼果的发育 , 也可
能在花萼和幼果发育中是一类冗余的基因 , 表达但并不起作用。
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