全 文 ：[ 文章编号] 　1007-3949(2003)11-02-0107-04 ·实验研究·
苦瓜蛋白对柯萨奇 B3病毒性心肌炎小鼠
半胱天冬酶 3活性及凋亡的抑制作用
王　佐1 , 　李双杰2 , 　杨永宗3
(1.中南大学湘雅医学院病理生理学系 , 湖南省长沙市 410078;
2.南华大学附属第一医院儿科;3.南华大学医学院心血管病研究所 , 湖南省衡阳市 421001)
[ 关键词] 　病理生理学;　苦瓜蛋白对柯萨奇 3 型病毒性心肌炎的治疗作用机制;　DNA 片断原位末端标记法;　
半胱天冬酶 3;　心肌细胞凋亡;　柯萨奇 3型病毒;　病毒性心肌炎小鼠模型;　苦瓜蛋白
[ 摘　要] 　为研究苦瓜蛋白对凋亡的关键酶半胱天冬酶 3及凋亡的调节作用 ,用已经建立起来的方法从苦瓜果肉
中提取苦瓜蛋白。将 BALB/ C 小鼠分为 4组:病毒对照组 、正常对照组 、药物对照组和药物治疗组 , 分别在第 0 天 、
第 3天 、第 7 天和第 14 天各处死 5 只小鼠 , 第 21 天全部处死动物 , 心肌组织半胱天冬酶 3 活性测定按照 CAL-
BIOCHEM 公司的试剂说明书进行 ,并稍加改正 ,凋亡鉴定按照 Oncogene 公司的 TdT-DNA 裂解片断末端原位标记试
剂说明书进行。结果发现 , ①病毒对照组第 7 天开始出现半胱天冬酶 3活性(0.63±0.21 pmol/min , n =5),第 14天
的活性(10.9±1.5 pmol/min , n=5)显著高于第 7天 , 第 21天的活性(12.6±1.3 pmol/min , n=5)又高于第 14天。 ②
药物治疗组 , 只有一个第 21天的标本有半胱天冬酶 3 活性(0.41 pmol/min), 其它两组均未检测到此酶的活性。 ③
DNA裂解片断末端原位标记法发现 ,病毒对照组在第 7 天心肌中有少数细胞凋亡 , 第 14 天 、第 21 天凋亡细胞明显
增多 ,在非病变区域可发现单个凋亡的心肌细胞。治疗组未发现凋亡细胞 , 其它两组也未发现凋亡细胞。结果提
示 , CVB3 病毒性心肌炎中发现有明显的凋亡现象 , 凋亡和半胱天冬酶 3发现于第 7 天 ,且随着时间增加而逐渐加重
(增强);苦瓜蛋白可显著抑制半胱天冬酶 3和凋亡。
[ 中图分类号] 　R363 [文献标识码] 　A
Inhibitory Effects of Momordicin on the Activity of Caspase 3 and Apoptosis of Myocardi-
um in BALB/CMice with Coxsackievirus B3 Myocarditis
WANG Zuo1 , LI Shuang-Jie2 , and YANG Yong-Zong3
(1.Department of Pathophysiology , Xiangya Medical College of Central South University , Changsha 410078;2.The First Affiliated Hospital of
Nanhua University;3.Institute of Cardivascular Desease , Medical College of Nanhua University , Hengyang 421001, China)
[ KEY WORDS] 　　Coxsackievirus B3;　Myocarditis , Viral;　Caspase-3;　Cardic Muscle Cell Apoptosis;　Momordicin;　
BALB/ CMice
[ ABSTRACT] 　　Aim　To measurement the inhibitory effect of Momordicin on the activity of caspase- 3 and apoptosis of my-
ocardium in BALB/ C mice with coxsackievirus B3 myocarditis.　　Method　Momordicin was purificated from Momordica cha-
rantia L by our previous reported methods.　Four group animals were used in this experiment , such as disease group(DG), nor-
mal group(NG), Momordicin group (MG), and Momordicin therapy group (MTG).　Five animals were killed at the 3rd , the
7th , and the 14th days in each group , and all were killed at the 21st day.　According to the method of Calbiochem Company , the
activity of caspase-3 from the heart of BALB/C mice was measured , and apoptosis was measured by terminal transferase mediated
DNA nick end labeling assay(TUNEL , the method provided by Oncogene Company).　　Results　①The activity of caspase-3
were measurable at the 7th day in the DG(0.63±0.21 pmol/min , n=5).　The activity of caspase-3 at the 14th day(10.9±
1.5 pmol/min , n=5)and the 21st day(12.6±1.3 pmol/ min , n=5)are higer than the 7th day , and the activity of the 21st
was higher than 14th day(P<0.05).　②Only a animal has the activity of caspase-3 at the 21st day(0.41 pmol/ min)in the
HTG , no caspase-3 activity were detected in the animals of MG and NG.　③Only a few apoptotic cells were found at the 7th day
in the DG , and more apoptotic cells were found among cardiac muscles at 14th and 21th days.　Single apoptotic cardiomyocytes
were also found at the outside of the pathological change areas , and no apoptotic cells were found in the animals of NG , MG , and
MTG.　　Conclusions　Distinct apoptosis were found in CVB3 viral myocarditis;the activitys of caspase-3 and apoptosis were
found at the 7th day , and higher after the 7th day , single apoptotic cardiomyocytes were also found.　The high dose Momordicin
has distinct inhibitory effect on the activity of caspase-3 and apoptosis.
[收稿日期] 　2003-01-06　　　　[ 修回日期] 　2003-03-19
[基金项目] 　国家自然科学基金(30070934)资助
[作者简介] 　王佐 ,男 , 1964年出生 ,湖南省衡阳县人 ,生物化学副教授 ,博士研究生。 李双杰 ,男 , 1962年出生 ,湖南省邵阳市人 ,博士后 ,儿科
学副教授。杨永宗 ,男 , 1937年出生 ,福建省仙游县人 ,病理生理学教授 ,博士研究生导师 ,本文通讯作者。
107CN 43-1262/R中国动脉硬化杂志 2003年第 11卷第 2期
　　柯萨奇病毒(coxsackievirus , CV)是引起病毒性
心肌炎的主要病毒 ,其致病机制主要在于病毒和宿
主之间的相互作用[ 1] 。然而 ,至今为止 ,对 CVB3病
毒致急 、慢性心肌炎的机制仍不是很清楚[ 2] 。文献
[ 3]报道 ,苦瓜蛋白对 CVB3病毒性心肌炎有很好的
治疗作用 ,高剂量苦瓜蛋白[ 25 mg/(kg·d)]可以维持
感染 CVB3病毒的 BALB/C 小鼠保持 100%的生存
率。病理切片结果发现 ,经苦瓜蛋白治疗后 ,心肌大
部分没有病变 ,即使少数有病变 ,但相对于疾病对照
组而言 ,程度也很轻。凋亡是不同于坏死的一种重
要的病理现象 ,随着研究的深入 ,越来越多的证据支
持CVB3病毒性心肌炎中存在凋亡现象[ 4-6] ,故研究
苦瓜蛋白对凋亡途径中的关键酶和对凋亡本身的调
节作用 ,有助于弄清苦瓜蛋白治疗病毒性心肌炎的
机制 。
1　材料与方法
1.1　材料
BALB/C小鼠由复旦大学实验动物部 SPF 级实
验室提供 ,苦瓜蛋白由南华大学心血管病研究所研
制 ,色谱纯 ,经 SDS-PAGE电泳为一条带 ,分子质量为
28 kD , 半胱天冬酶 3 ELASA 测定试剂盒系 CAL-
BIOCHEM公司产品 ,DNA 片断末端标记凋亡检测试
剂盒为 Oncogene 公司产品 ,其余试剂均为国产分析
纯。
1.2　动物分组及处理
动物分为 4组:①正常对照组注射 0.1 mL 病毒
稀释液;②病毒对照组注射 0.1 mL 10-5 CVB3病毒
+0.1 mL生理盐水;③药物对照组注射0.1 mL 、剂量
为25 mg/(kg·d)苦瓜蛋白;④药物治疗组注射 0.1
mL 10-5 CVB3病毒+0.1 mL 、剂量为 25 mg/(kg·d)
苦瓜蛋白 。所有试剂均从腹腔注射 ,病毒只注射一
次 ,其余试剂从第 0天开始注射到第 6天 ,所有动物
在第 21天处死 ,取出心脏 ,立即放入液氮中 ,再转移
到-70℃冰箱中保存备用 。病毒活性定量和苦瓜蛋
白浓度定量方法参照文献[ 3]进行。
1.3　半胱天冬酶 3活性测定
按照 CALBIOCHEM公司的试剂说明书测定半胱
天冬酶 3活性。分为 5组:①阳性对照组为半胱天
冬酶 3标准液15 μL ,分析缓冲液 75 μL ,底物 10μL ,
反应总体积100 μL ;②阴性对照组为半胱天冬酶 3
标准液 15 μL ,分析缓冲液 55μL ,底物 10μL ,半胱天
冬酶 3抑制剂 20 μL;③样品对照组为分析缓冲液 80
μL ,疾病组织样品 20 μL;④空白对照组为分析缓冲
液 90 μL ,底物10 μL;⑤待测样品组为分析缓冲液 70
μL ,底物10μL ,疾病组织样品 20μL。分别于第 3 、7 、
14和第 21天进行测定 ,每次测 5个动物心肌组织 。
首先测得转换因子(转换因子=50 μmol/L 波长 405
nm吸光度的平均值),然后依据转换因子计算活性 ,
活性(pmol/min)=斜率(■A/min)×转换因子×分析
体积(μL)。
1.4　DNA裂解片断原位末端标记
根据 Oncogene 公司试剂盒的说明书进行操作 。
其大致过程如下 ,心肌切片先在柠檬酸盐溶液中加
热活化 ,然后用蛋白酶K消化以暴露 DNA ,在末端转
移酶介导下 ,用连接碱性磷酸盐的 dUTP 对 DNA裂
解部分进行标记 ,然后再用免疫组织化学方法显色 ,
并以 DNA酶1(1 kU/L ,37℃下 30 min)处理正常心肌
组织作为阳性对照 。
2　结 果
2.1　半胱天冬酶 3活性测定结果
测得转换因子为 490.20 μmol/L ,测得半胱天冬
酶 3活性如表1所示(Table 1)。可见正常对照组 、药
物对照组和药物治疗组均未检测到半胱天冬酶 3的
活性 ,病毒对照组从第 7天开始检测到半胱天冬酶 3
活性 ,在第 7天后半胱天冬酶 3活性急剧增加 ,第 14
天和第 21天的半胱天冬酶 3活性明显高于第 7天
(P<0.01),第 14天后半胱天冬酶 3 的活性增加幅
度明显减慢 , 但两者之间仍然有显著差别(P <0.
05)。
表 1.各组动物半胱天冬酶 3活性(pmol/min)测定结果
Table 1.The activity of caspase-3 in each group animal
分　组 第 3天 第 7天 第 14天 第 21天
正常对照 0 0 0 0
药物对照 0 0 0 0
病毒对照 0 0.63±0.21 10.9±1.5b 12.6±1.3ab
药物治疗 0 0 0 0
a:P<0.05,与第 14天比较;b:P<0.01 ,与第 7天比较。
2.2　DNA裂解片断原位末端标记法结果
原位末端标记免疫组织化学检测发现 ,通过与
HE染色病理切片比较 ,病毒对照组心肌病变严重者
的动物在第 7天开始出现轻微的凋亡(图 1 , Figure
1),第 14天和第 21天逐渐加重(图 2 ,Figure 2),正常
对照组 、药物对照组和药物治疗组未见任何凋亡细
胞出现 ,早期凋亡细胞主要集中在心肌靠近外膜的
108 ISSN 1007-3949 Chin J Arterioscler , Vol 11 , No 2
部分(图2),后期凋亡细胞主要集中在坏死区域 ,非
坏死区域也发现单个心肌细胞凋亡 。药物治疗组未
见凋亡细胞(图 3 ,Figure 3)。
图 1.病毒对照组第 7 天心肌横切面(100×)　　DNA裂解片
断原位末端标记法显色 ,可见在心肌外膜部分有少量细胞凋亡。
Figure 1.The result of TUNEL analysis at the 7th day of the
disease group
图2.病毒对照组第 14 天心肌横切面(100×)　　DNA裂解片
断原位末端标记法显色 ,在心肌细胞坏死区域和靠近坏死区域可见
大量的凋亡细胞 ,非病变区域 ,可见散在的单个细胞凋亡。
Figure 2.The result of TUNEL analysis at the 14th day of the
disease group
图3.药物治疗组第 14 天心肌横切面(100×)　　DNA裂解片
断原位末端标记法显色 ,心肌细胞形态正常 ,未见凋亡细胞。
Figure 3.The result of TUNEL analysis at the 14th day of the
Momordicin therapy group
3　讨 论
自从发现线虫(Caenorhabditis elegan)的 CED蛋
白与哺乳动物的白细胞介素 1β转换酶(ICE)有相似
作用以来[ 7] ,已经有 13种半胱天冬酶家族成员先后
被发现或克隆[ 8] 。半胱天冬酶(caspase)受到了越来
越多的学者的重视 ,其主要分为启动型和执行型 ,前
者接受死亡信号 、启动凋亡或激活下游的分子 ,后者
则降解细胞骨架 、蛋白质 、核酸等。半胱天冬酶 3位
于天冬氨酰酶传导通路的下游 ,属于执行型半胱天
冬酶 , 其可以直接剪切 PARP , 引起 DNA 的降解 。
Enari等[ 9]在小鼠淋巴细胞中发现了半胱天冬酶激活
型脱氧核苷酶(caspase activated deoxyribonuclease ,
CAD)及其抑制物 ICAD。CAD含 343个氨基酸 ,平时
以休眠状态稳定结合 ICAD。半胱天冬酶 3剪切 I-
CAD后 ,释放出 CAD ,后者进入细胞核内降解 DNA 。
因此半胱天冬酶3的活性是反映凋亡与否的一个较
为准确的分子指标 。
病毒性心肌炎与细胞凋亡之间的关系现在已经
引起越来越多学者的关注 ,病毒与凋亡之间的关系
较为复杂 ,一些病毒可以诱使细胞凋亡 ,而一些病毒
(如腺病毒)可以抑制凋亡[ 10] 。病毒诱使凋亡主要
通过两种方式 ,一种方式是当细胞受病毒感染后 ,病
毒自身通过感染诱发细胞和体液免疫反应产生细胞
因子 ,通过细胞因子再诱导凋亡 ,另外一种方式是机
体本身为防御病毒 ,通过 T 淋巴细胞识别及诱发病
毒感染细胞凋亡。
由于所使用病毒的种类 、体内或体外实验 、所用
动物材料的种类以及组织的类型 ,关于病毒性心肌
炎心肌细胞是否凋亡的争论长达 6 ～ 7年[ 11] , Henke
等[ 12] 、Huber等[ 13]和 Gebhard等[ 14]最先在实验性小
鼠CVB3病毒性心肌炎模型上发现心肌组织中有凋
亡的细胞 ,且凋亡细胞可在炎性区域内外发现 ,但未
说明是哪种细胞凋亡 ,Yamada等[ 15]发现凋亡的细胞
主要是浸润的单核细胞 ,Kyto 等[ 6]最近对 4到 8周
的雄性A/ J鼠腹腔注射 CVB3病毒后 ,第 7天就发现
单个凋亡的心肌细胞 ,使用肌球蛋白抗体和荧光免
疫组织化学技术 ,证实凋亡的心肌细胞核位于肌原
纤维的包围之中。Ollivetti等[ 16] 在扩张性心肌病病
人心肌组织发现凋亡的细胞 ,Seki等[ 17] 在扩张性心
肌病的病人中发现凋亡的心肌细胞 ,9个扩张性心肌
病人中有 3个病人发现了凋亡 ,4个心肌炎病人中全
都发现了凋亡 。在扩张性心肌病病人中 ,DNA裂解
片断末端原位标记阳性核广泛分布于心肌细胞中 ,
而在心肌炎病人中 ,这些阳性核主要见于间质细胞 ,
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少数见于心肌细胞中。Peng等[ 18]对小鼠 CVB3病毒
性心肌炎模型的基因表达谱进行了研究 ,发现感染
后的第4天和第7天 ,有42个基因表达上调和下调 ,
其中抑制凋亡的 Bag-1基因下调。
对病毒性心肌炎小鼠模型研究得较为深入的是
Gebhard等[ 14] 和 Henke 等[ 20] ,Gebhard 使用酵母双杂
交系统证明 ,CVB3外膜蛋白 VP2与前凋亡蛋白 Siva
之间的相互作用 ,在 CD27/CD70-转导凋亡途径中起
重要作用。CD27 是肿瘤坏死因子超家族成员 。
CD27与 CD70结合后 ,通过与 TRAF2和 TRAF5 之间
的相互作用而触发核因子 kB信号通路[ 18] 。CD27也
参与凋亡[ 19] 。CD27蛋白没有死亡结构域 ,而 Siva有
一个死亡结构域样的结构域 ,Siva 在体外就可以与
CD27结合。研究发现 , CVB3 病毒性心肌炎小鼠的
心肌和胰腺组织都有类似 Siva 的成分(muSiva)表
达[ 20] ,通过这种新的机制 ,凋亡参与到柯萨奇病毒
的致病过程。进一步的研究表明 ,VP2的第165位的
天冬氨酸为CVB3的致病性所必不可少 ,如果把它换
成天冬酰氨 ,则失去体内致凋亡能力。既降低受感
染 BALB/C 鼠Siva蛋白的表达 ,又降低病毒在感染
动物体内的传播能力 。而在最先受感染的胰腺组
织 ,病毒结合到胰腺上去并不受影响。Siva 蛋白与
VP2结合的核心位于第 118位至第 136位氨基酸之
间。
本文发现 ,在CVB3病毒性心肌炎 BALB/C 小鼠
模型上 ,凋亡的关键酶半胱天冬酶 3和凋亡本身均
在第 7 天被检测到 ,且均随时间的延长而增加(加
强),两者变化呈正相关关系 ,并证实 25 mg/(kg·d)
的苦瓜蛋白能显著抑制半胱天冬酶 3的活性及凋亡
的发生。
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110 ISSN 1007-3949 Chin J Arterioscler , Vol 11 , No 2