全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 53 - 58
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 09 - 11; 修回日期 : 2006 - 11 - 27
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30060053, 30360066) ; 教育部科学技术研究重点项目 ( 02180) ; 国家科技攻关计划引
导项目 (2003BA546C)3 E2mail: njx105@1631com
梨组织中苹果褪绿叶斑病毒的原位 RT2PCR检测
牛建新 1, 23 , 周民生 1 , 马兵钢 1, 2 , 赵　英 1 , 刘　宏 1
(1 石河子大学农学院园艺系 , 新疆石河子 832003; 2 新疆兵团绿洲生态农业重点实验室 , 新疆石河子 832003)
摘 　要 : 为了建立梨树苹果褪绿叶斑病毒原位 RT2PCR检测技术 , 用已知带有苹果褪绿叶斑病毒的库
尔勒香梨和无病毒实生苗叶片为材料 , 利用 D IG标记 , 研究了香梨病毒的叶片石蜡切片 IS2RT2PCR检测技
术。包括 AMV逆转录酶、dNTPs、RNasin及互补引物浓度对 cDNA合成的影响 , 退火温度、Taq DNA聚合
酶、Mg2 + 、引物浓度及循环次数对原位 PCR效果的影响。结果表明 : RNasin的用量大于 012 U·μL - 1时 ,
信号强度随着 RNasin量的加大而增强 ; 只有当 dNTPs浓度达 110 mmol·L - 1时才能生成一定量的 cDNA;
AMV浓度在 013～015 U·μL - 1均可进行正常的逆转录 , 而且在该范围内产物的量随 AMV浓度提高而增
多 ; 引物浓度达到 019μmol·L - 1以上时才能进行有效的逆转录 , 并且生成的 cDNA的量随引物浓度增大而
增加。原位扩增 ACLSV的 cDNA适合退火温度为 56℃。循环 20～30次可出现较强的蓝色信号 , 引物浓度
在 018～112μmol·L - 1时显色较好 ; Taq酶浓度为 20 U·mL - 1以上 , 均显示较深的蓝色 ; Mg2 +浓度为 115
mmol·L - 1就可满足原位 PCR所需。获得了苹果褪绿叶斑病毒的原位 PCR优化检测体系 , 利用建立的优化
程序对香梨样品进行了检测验证 , 取得了很好效果。
关键词 : 梨 ; 库尔勒香梨 ; 苹果褪绿叶斑病毒 ; 原位 PCR
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120053206
D etection of A pple ch loro tic leaf spot virus in Pear by in situ RT2PCR
N IU J ian2xin1, 23 , ZHOU M in2sheng1 , MA B ing2gang1, 2 , ZHAO Ying1 , and L IU Hong1
(1D epartm ent of Horticu lture, A gricu ltura l College of Sh ihezi U niversity, Shihezi, X in jiang 832003, Ch ina; 2 Key Laboratory of
O asis Ecology A griculture of X injiang B ing tuan, Shihezi, X in jiang 832003, Ch ina)
Abstract: The detection technique of A pple ch lorotic leaf spot virus (ACLSV ) in pear p lant by IS2RT2
PCR w ith D igoxigenin labels for leaf paraffin slice samp les and shoot tip s frost slice samp les was established
in this paper. Korla pear leaves infected by ACLSV and virus2free seedling leaves of Py rus betu laefolia Bge
as control were used as leaves materials in the tests. The IS2PCR parameters including concentration of
dNTPs, RNasin, Taq DNA polymerase, M g2 + and p rimers, effect of AMV reverse transcrip tase and comp le2
ment p rimer on cDNA synthesis, annealing temperature and cycle number were studied systematically. The
results showed that the stain signal strength increased accompanied w ith an increase of RNasin amount when
its concentration reached over 012 U·μL - 1. Certain amount of cDNA would not be generated until the con2
centration of dNTPs reached 110 mmol·L - 1 in reaction solution. Reverse transcrip tion could be carried out
when the concentration of AMV reverse transcrip tase was between 013 U·μL - 1 and 015 U·μL - 1 , and the
quantity of cDNA p roduction imp roved w ith the increase of the concentration of AMV. The reverse transcrip2
tion could not be carried out until the concentration of antisense p rimer reached 019μmol·L - 1 , and the a2
mount of cDNA would increase along w ith the increase of p rimers concentration. The suitable annealing tem2
perature for in situ amp lification of cDNA was 56℃. The m inimum amp lification cycle number was 20
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times. The stain signal was weak when p rimer concentration was less than 018μmol·L - 1 and the signal
color was heavy blue as the concentration of Taq DNA polymerase was over 20 U·mL - 1 ; In situ PCR could
be performed when M g2 + concentration was at 115 mmol·L - 1. An op tim ized detection system of ACLSV
by IS2RT2PCR has been established and used to detect virus in Korla pear orchard, and the stable detection
results have been obtained.
Key words: Pear; Korla pear; A pple ch lorotic leaf spot virus; In situ PCR
RT2PCR已在库尔勒香梨病毒检测中得到应用 (牛建新 等 , 2003)。但是该技术需从组织细胞提
取核酸 , 因而无法将扩增的核酸片段进行细胞定位分析。
1990年 Haase等首次报道了原位 PCR技术 , 该技术结合了 PCR和原位杂交的优点 , 既可在组织
切片、细胞等样品中检测出低拷贝的核酸 , 又可进行细胞形态学的准确定位 , 并在人类和动物的各种
疾病和基因研究中获得了广泛应用 (Nuovo et al. , 1991; Staskus et al. , 1991; Bagasra et al. , 1992;
Gressens & Martin, 1994; HÊfler et al. , 1995)。
近年来 , 该技术在植物方面也有所进展 ( Greer et al. , 1991; Johansen, 1997; Matsuda et al. ,
1997) , 但在梨树病毒检测方面尚未见报道。
为了搞清病毒在梨组织中的分布 , 我们研究了石蜡切片 IS2RT2PCR检测技术 , 获得了苹果褪绿叶
斑病毒的原位 RT2PCR优化检测体系。
1　材料与方法
111　试验材料
试验材料选用农二师 28团、29团和库尔勒沙依东园艺场的库尔勒香梨叶片。其植株已通过 RT2
PCR和 cDNA探针检测带有苹果褪绿叶斑病毒 (A pple ch lorotic leaf spot virus, ASLSV )。对照为经 RT2
PCR检测的无病毒实生苗。
112　试剂
RNasin、Taq DNA聚合酶、AMV逆转录酶、 dNTP、蛋白酶 K购自大连宝生物工程公司 , 果胶
酶、地高辛 2112dUTP、碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体、DNA酶 Ⅰ购于 ROCHE公司 ; 4%多聚甲醛、
DEPC水、PBS (pH 712～714)、1 mol·L - 1 Tris2HCl缓冲液 (pH 810)、015 mol·L - 1 EDTA、20 ×
SSC缓冲液、封闭液 (1% BSA溶于 PBS, 现用现配 )、洗液 (1 mol·L - 1 Tris2HCl, 0115 mol·L - 1
NaCl, pH 915) 等溶液中的试剂均为国产分析纯 , GeneFRAME购于中山生物工程公司 , 玻片用多聚
赖氨酸处理。
引物设计与合成根据已发表的序列 ( Sato, 1993) 设计合成引物 , ACLSV互补引物 P1: 5′2GGC
AAC CCT GGA ACA GA23′, ACLSV引物 P2: 5′2CAG ACC CTT ATT GAA GTC GAA23′; 由大连宝生物
工程公司合成。
113　试验方法
11311　石蜡切片制作 　供试材料用 4%多聚甲醛固定 1～3 h后 , 用 PBS冲洗组织 2次 , 每次 5 m in。
其它步骤同常规石蜡切片。切片制好后装入切片盒保存于 - 20℃冰箱中备用。
从冰箱中取出切片 , 放到烘箱中 60℃孵育 1 h, 熔化石蜡。然后将切片浸泡于二甲苯溶液中 5
m in 3次 , 完全去除组织中的石蜡。再浸泡于 100%、90%、80%、70%乙醇中各 5 m in, 然后在室温
下干燥。
11312　预处理 　将切片放入湿盒 , 在切片上滴加果胶酶溶液 , 37℃处理 10～25 m in, 然后用 DEPC
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水冲洗 5 m in。在切片上滴加蛋白酶 , 37℃处理 10～40 m in。用重蒸水清洗 5 m in。乙醇脱水 , 室温干
燥 ; 将切片浸没在三乙醇胺溶液中 , 摇床振荡。几分钟后 , 在切片上滴加 1 mL乙酸酐 , 继续振荡 10
m in。在 PBS中清洗切片 5 m in, 用 100% 乙醇清洗 5 m in, 室温干燥。
11313　cDNA合成 　在 015 mL Eppendorf管中加入 DNA se Ⅰ ( 10 U·μL - 1 ) 4μL, RNA酶抑制剂
(40 U·μL - 1 ) 1μL, 10 ×DNA se Ⅰ缓冲液 4μL, 其余用 DEPC处理的水补足 , 混匀 , 加在切片上 ,
放入湿盒 , 密封 37℃过夜 ; 用重蒸水冲洗切片 2次 , 每次 10 m in, 用 100%乙醇清洗 5 m in。室温干
燥。
11314　原位扩增 　在 015 mL Eppendorf管中加入重蒸水 ( ddH2 O ) 415μL, 互补引物 P1 (20 pmol·
μL - 1 ) 1μL, 5 ×Buffer (Mg2 + 40 mmol·L - 1 ) 4μL, 215 mmol·L - 1 dNTPs 8μL, RNase抑制剂
(RNasin, 40 U·μL - 1 ) 015μL, AMV逆转录酶 (5 U·μL - 1 ) 2μL, 总体积 20μL。混匀后滴加到切
片上 , 放入湿盒 , 密封 42℃温育 1 h; 用重蒸水冲洗切片 2次共 10 m in, 用 100% 乙醇脱水 5 m in, 室
温干燥。
在 015 mL Eppendorf管中依次加入 : ddH2O 1μL、10 ×Buffer (Mg2 + free) 215μL、MgCl2 415
μL、10 mmol·L - 1 dATP 215μL、10 mmol·L - 1 dCTP 215μL、10 mmol·L - 1 dGTP 215μL、10 mmol
·μL - 1 dTTP 214μL、引物 P1 (20 pmol·μL - 1 ) 1125μL、P2 (20 pmol·μL - 1 ) 1125μL、D ig2dUTP
(1 mmol·L - 1 ) 0125μL、Taq DNA聚合酶 (5 U·μL - 1 ) 1125μL, 总体积 25μL。混匀 , 加到贴有
基因框的切片上 , 用配套盖膜封好 , 放入 PCR仪扩增。
ACLSV扩增程序 : 94℃预变性 3 m in; 10～35循环 : 94℃ 2 m in, 55℃ 1 m in, 72℃ 2 m in, 最后
一个循环延伸 7 m in; 扩增后去掉基因框用洗液振洗载片 20 m in 2次。
切片上加 100μL封闭液 , 放于湿盒 37℃ 30 m in。
11315　原位 PCR产物的免疫检测 　切片上加 100μL碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体 (在封闭液中以
1∶100稀释 ) , 室温下在湿盒中放置 1 h。将玻片浸泡于 PBS中清洗 , 室温振洗 2次 , 每次 15 m in。在
切片加 100μL NBT/BC IP液 , 将切片放于湿盒中 60 m in。用蒸馏水清洗切片 10 m in终止显色。用常
规技术脱水并用中性树胶封片。显微镜下观察照相。
11316　对照的设置 　试验中除了无病毒实生苗作为阴性对照外 , 还以 PCR中省去引物、省去 DNA
聚合 Taq酶及省略 RT步骤作为阴性对照。
114　PBS和 D EPC处理水冲洗试验
分别试验了用 PBS冲洗 10 m in和用水浴锅 95℃加热 5 m in对消除蛋白酶 K的效果 , 以及用 DEPC
处理的水冲洗 20 m in和 PCR仪 95℃加热 5 m in对消除 DNA酶的效果。
115　有效 RT反应体系的建立
RT组分中对 AMV逆转录酶、dNTP、RNasin及引物浓度分别设置了 5、5、5、6个梯度 , 以确定
各组分对试验结果的影响。
116　扩增中各因素试验
PCR扩增中对 Taq DNA聚合酶、Mg2 + 、引物浓度及循环次数分别设置了 5、5、5、6个梯度。对
退火温度设 5个不同处理 , 依次分别为 54℃、56℃、58℃、60℃、62℃。
阴性对照采用建立起来的有效体系中的相应浓度。
2　结果与分析
211　预处理对原位切片效果的影响
结果表明果胶酶处理时间长短对试验结果影响不大。蛋白酶处理 10和 15 m in的组织显色后 , 表
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现一片蓝 , 说明消化不足 ; 处理 25、30和 40 m in的组织形态模糊 , 说明蛋白酶消化过度 ; 处理 20
m in的则较为适度。
212　碱性磷酸酶显色系统可靠性试验结果
1%果胶酶 37℃消化 15 m in、1μg·mL - 1蛋白酶 K 37℃消化 15 m in、215%乙酸酐处理 10 m in、
DNA酶 37℃过夜消化、未加地高辛标记的核苷酸的扩增组织载片用 PBS振洗 10 m in 3次 , 加上 BSA
液 , 37℃孵育 30 m in, 再加上碱性磷酸酶标记的抗体室温孵育 60 m in, PBS振洗 10 m in 3次 , 加上
BC IP与 NBT, 37℃孵育 60 m in。然后用蒸馏水冲洗终止显色。结果切片组织未出现蓝紫色 , 说明该
系统是可靠的 , 内源性碱性磷酸酶不会对试验产生影响。
213　PBS和 D EPC处理水冲洗对消除蛋白酶 K和 D NA酶效果
结果表明 , PBS冲洗 10 m in与加热 5 m in的效果一样 , 均可达到灭活目的。DEPC处理的水冲洗
20 m in和用 95℃加热 5 m in均可以消除 DNA酶。
214　苹果褪绿叶斑病毒在组织中的分布
4种对照在经充分洗涤后 , 切片亦未出现蓝紫色。而阳性材料在叶肉 , 特别是栅栏组织中一些细
胞出现了蓝紫色 , 表明苹果褪绿叶斑病毒主要位于叶肉细胞。
215　RT组分浓度对原位 PCR效果的影响
结果表明 , RNasin的用量小于 012 U·μL - 1时几乎看不到信号 , 当用量大于 012 U·μL - 1时信号
强度随 RNasin量的加大而增强。
当 dNTPs浓度大于 11000 mmol·L - 1时 , 切片才出现信号。
AMV浓度为从 013～015 U·μL - 1之间均可进行正常的逆转录 , 其产物在该范围内随着 AMV浓
度的增高而增加。
当引物浓度达 019μmol·L - 1以上时可有效进行逆转录 , 并且生成的 cDNA的量随引物浓度增加
而增加 , 而在 018μmol·L - 1以下则不能合成足量的 cDNA。
216　原位扩增中各因素对 PCR效果的影响
试验表明 , 只有当退火温度为 56℃时 , 切片才显示出阳性信号 , 说明 56℃是其适宜的退火温度。
循环 10次的未出现蓝色信号 , 循环 15次的出现较弱的蓝色信号 , 循环 20、25和 30次的均出现
较强的蓝色信号 (图 1)。
Taq酶浓度从 20～100 U·mL - 1之间各处理差异不大 , 均显示出较深的蓝色信号 (图 2) , 说明
Taq酶浓度为 20 U·mL - 1时就能满足其反应条件。
当引物浓度低于 016μmol·L - 1时 , 有病毒的部位只显示出很弱的浅蓝色信号 , 当引物浓度在
018μmol·L - 1以上时 , 有病毒部位则显示出较强的蓝色信号。
Mg2 +浓度从 115～515 mmol·L - 1之间的 5个处理均显示出较强的蓝紫色信号 , 说明 Mg2 +浓度
115 mmol·L - 1就可满足梨树叶片原位 PCR所需。
217　利用优化程序对香梨样品的检测
随机选取 10株经 RT2PCR检测确认带苹果褪绿叶斑病毒的香梨样品和不带苹果褪绿叶斑病毒的
实生苗 , 以不带病毒的实生苗为阴性对照 , 分别制作成石蜡切片 (叶片、茎尖纵切和横切 ) , 利用优
化的试验程序进行原位 RT2PCR检测 , 结果获得很好的检测效果 , 10株香梨的样品切片在有病毒的
位置均显示出蓝紫色 , 而阴性对照切片则无蓝紫色出现。
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图 1　循环次数对原位 PCR效果的影响
A: 10次 ; B: 15次 ; C: 20次 ; D: 25次 ; E: 30次。
F ig. 1　Effect of cycle num ber on in situ PCR
A: 10 cycles; B: 15 cycles; C: 20 cycles; D: 25 cycles; E: 30 cycles.
图 2　Taq酶浓度对原位 PCR效果的影响
F ig. 2　Effect of d ifferen t Taq D NA polym era se concen tra tion s on the detection of in situ PCR
A: 20 U·mL - 1 ; B: 40 U·mL - 1 ; C: 60 U·mL - 1 ;
D: 80 U·mL - 1 ; E: 100 U·mL - 1.
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3　讨论
本试验是以病毒 RNA为模板通过逆转录 cDNA, 然后进行原位扩增。扩增前切片均用无 RNA酶
的外切 DNA酶进行过夜处理 , 消除了组织中的原有基因组 DNA, 从而避免了典型的因核内聚合酶对
内源性 DNA片段的修复、内源性 DNA 或 cDNA 片段造成的内源性引物扩增的假象 (Long et al. ,
1993)。
Hofler等认为由于标记核苷酸掺入到内源性 DNA片段 , 被内源性 cDNA或 DNA错误引导生成非
特异性信号是造成直接原位 PCR假阳性率高的原因 ( Komm inoth & Long, 1994)。原位 PCR产物的弥
散和细胞外扩增产物的形成 , 以及检测步骤的差异 , 可造成定量结果的不可靠。由于本试验是在切片
上进行 , 不能采用热启动法 , 因而 , 可能出现因形成引物二聚体而造成的非特异性 ( Chou et al. ,
1992)。此外 , 由于该法是通过显色而间接进行的 , 因而 , 不能同时进行多种病毒的检测。为了确定
该法的敏感性 , 本试验采用已知阴性材料杜梨作对照 , 对其进行同样处理。结果表明 , 杜梨材料未显
现阳性材料中的特异蓝紫色。同时 , 对所用香梨材料的部分切片设置省去 RT步骤、省去 PCR引物、
省去 Taq酶等阴性对照。结果与阴性杜梨材料一样未出现特有的蓝紫色。省去 RT步骤未显示蓝紫色
信号 , 说明扩增的是 cDNA , 而并非组织中残留的基因组 DNA。PCR中省去引物未显示蓝紫色信号 ,
排除了扩增中存在的 “内源性 DNA修补 ”、“内源性引物 ”。PCR中省去 Taq酶未显示蓝紫色信号 ,
说明检测中不会发生抗体与组织的非特异性结合。
References
Bagasra O, Haup tman S P, L ischner H W , SachsM, Pomerantz R J. 1992. Detection of human immunodeficiency virus type 1 p rovirus in mono2
nuclear cells by in situ polymerase chain reaction. England Jouranl of Medicine, 326 (21) : 1385 - 1391.
Chou Q, RussellM, B irch D E, Raymond J, B loch W. 1992. Prevention of p re2PCR m is2p rim ing and p rimer dimerization imp roves low2copy2
　　number amp lifications. Nucleic Acids Research, 20: 1717 - 1723.
Greer C E, Peterson S L, Kiviat N B, ManosM M. 1991. PCR amp lifications from paraffin embedded tissues: effects of fixative and fixation
　　time. American Journal of Clinical Pathology, 95: 117 - 124.
Gressens P, Martin J R. 1994. In situ polymerase chain reaction: Localization of HSV2 DNA sequence in infections of the nervous system. Journal
of V irologicalMethods, 46 (1) : 61
Haase A T, Retzl E F, Staskus K. 1990. Amp lification and detection of lentiviral DNA inside cells. Proceeding of the National Academy of
　　Sciences, USA, 87: 4971 - 4975.
HÊfler H, Putz B , Mueller J D, NeubertW , Sutter G, Gais P. 1995. In situ amp lification of measles virus RNA by the self2sustained sequence
rep lication reaction. Laboratory Investigation, 73 (4) : 577 - 585.
Johansen B. 1997. In situ PCR on p lant material with sub2cellular resolution. Annals of Botany, 80: 697 - 700.
Komm inoth P, Long A A. 1994. Questioning in2situ PCR. Detection of ep idermal growth factor recep tor mRNA in tissue sections from biop sy
　　specimens using in2situ polymerase chain reaction ( letter) . American Journal of Pathology, 145: 742 - 748.
Long A A, Komm inoth P, Lee E, Wolfe H. 1993. Comparison of indirect and direct in situ polymerase chain reaction in cell p reparations and
　　tissue sections. H istochem istry, 99 (2) : 151 - 162.
Matsuda Y, Toyoda H, Kurita, Ouchi S. 1997. In situ PCR technique based on p ircking m icroinjection for cDNA cloning in single cells of
　　barley coleop tile and powdery m ildew pathogen. Plant Cell Reports, 16: 612 - 618.
N iu J ian2xin, L iu L ian2ke, Zhu Jun, Q in Wei2m ing, Wu Zhong2hua, Wang Xiao2bing. 2003. RT2PCR detection of pear ACLSV in Korla pear.
Journal of Fruit Science, 20 (4) : 243 - 246. ( in Chinese)
　　牛建新 , 刘连科 , 朱　军 , 覃伟铭 , 吴忠华 , 王小兵. 2003. 库尔勒香梨上 ACLSV的 RT2PCR检测. 果树学报 , 20 (4) : 243 - 246.
Nuovo G J, MacConnell P, Forde B, Delvenne P. 1991. Detection of human pap illomavirusDNA in formalin2fixed tissues by in situ hybridization
after amp lification by polymerase chain reaction. American Journal of Pathology, 139 (4) : 847 - 854.
Sato K. 1993. Comp lete nucleotide sequece of the app le isolate of app le chlorotic leaf spot virus. Journal of General V irology, 74: 1927 - 1931.
Staskus K A, Couch L, B itterman P, Retzel E F, Zupancic M J, Haase A T. 1991. In situ amp lification of visna virus DNA in tissue sections
reveals a reservoir of latently infected cell. M icrobial Pathogenesis, 11: 67 - 76.
85