全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (1) : 128～129
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 04 - 11; 修回日期 : 2005 - 07 - 293 通讯作者 Author for correspondence
草莓中贝壳杉烯氧化酶基因 ( STGA3)中两个不同
编码序列的克隆
石琰 1 　孙仲序 2 　束怀瑞 23
(1 青岛科技大学化工学院 , 青岛 266042; 2 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 泰安 271018)
摘 　要 : 以保守氨基酸序列设计了简并性引物的方法 , 克隆 ‘丰香 ’草莓 ( Fragaria gradif lora
‘Fengxiang’) 贝壳杉烯氧化酶基因部分序列 , 发现叶片和花蕾中合成赤霉素的贝壳杉烯氧化酶的序列不
同 , Southern杂交方法检测在草莓基因组中存在 3个拷贝的目标基因 , 表明在草莓中至少有两个不同基因共
同编码贝壳杉烯氧化酶 , 以响应不同发育信号的调控。
关键词 : 草莓 ; 赤霉素 ; GA3基因 ; 贝壳杉烯氧化酶 ; 生物合成
中图分类号 : S 66814; Q 785　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0120128202
Clon ing of Two D ifferent en t2kau rene oxidase (STGA3) Sequence in Strawberry
Shi Yanjing1 , Sun Zhongxu2 , and Shu Huairui23
(1 Chem istry Eng ineering College, Q ingdao U niversity of Science and Technology, Q ingdao 266042, Ch ina; 2 Institu te of Horti2
cu lture Science and Engineering, Shandong A gricu lture U niversity, Ta ipian 271018, Ch ina )
Abstract: A pair of degenerate p rimers were designed according to the conservative am ino acid se2
quences to clone the ent2kaurene oxidase from strawberry, and obtained two different RT2PCR p roducts from
the strawberry leaves and flowers respectively. These two segments have different nucleotide sequences, and
Southern blot detected 3 cop ies of target gene in the strawberry genome. So there are at least two different
genes coding ent2kaurene oxidase to respond different development signals.
Key words: Strawberry; Gibberellins; GA3 gene; Ent2kaurene oxidase; B iosynthesis
1　目的、材料与方法
贝壳杉烯氧化酶是赤霉素生物合成途径中的关键酶 , 位于早期未分支的合成步骤上 , 催化 3步氧
化反应 , 即由贝壳杉烯氧化成贝壳杉烯醇 , 继而形成贝壳杉烯醛 , 再被氧化成贝壳杉烯酸 , 这是一系
列的单加氧过程 , 此酶属于细胞色素 P450酶的单加氧酶系〔1〕。本试验克隆了草莓贝壳杉烯氧化酶的
同源基因 STGA3 ( strawberry GA3) , 以期探讨赤霉素在合成的上游部分调控草莓生长发育的机制。
采集 ‘丰香’草莓 ( F ragaria grad if lora‘Fengxiang’) 刚刚展开叶片和花蕾 , 提取 RNA并反转
录 〔2, 3〕。在 NCB I查询 GA3基因已在拟南芥〔4〕、南瓜〔5〕、烟草〔6〕3种植物中得到 , 经过同源性比较 ,
找出保守氨基酸序列合成简并引物 GA3A 〔5pi2GA ( T/C) TGG (A /C) G(A /T/C /G) A ( T/C) TT( T/C) TT
( T/C) CC23pi〕和 GA3B 〔5pi2C ( G/T) (A /T) AG (A /G/C /T) GT (C /T) TC ( G/C) TG (A /G) AA (A /G/T/
C) AC23pi〕, 以此对简并引物分别扩增草莓幼叶和花蕾的 RNA的反转录产物 , RT2PCR的产物用 2%琼
脂糖电泳分离 , 片段经凝胶回收纯化后分别连入 pGEM 2T easy载体中 , 转化大肠杆菌 DH5α, 分别挑
取阳性克隆 , 并测序。测序重复 3次。
GA3A和 GA3B扩增基因组 DNA, 并分析序列 , 发现内部没有 EcoRⅠ、PstⅠ的酶切位点 , 采用
随机引物法制备探针 , 探针为叶片与花蕾的简并引物的 RT2PCR混合产物。分别以 EcoRⅠ、PstⅠ完
　1期 石琰 等 : 草莓中贝壳杉烯氧化酶 (STGA3) 基因中两个不同编码序列的克隆 　
全酶解 15μg总 DNA , 并于 018%琼脂糖凝胶上电泳充分分离。电泳后的转膜、预杂交和杂交依照
Sambrook等的方法〔7〕, - 70℃进行放射自显影 3 d。
2　结果与分析
　　分别以叶片和花蕾反转录产物为模板的 RT2
PCR的产物用 2%琼脂糖电泳分析 , 紫外光透射
分析观察分别获得 1条大约 410 bp的带 , 经克隆
测序后 , 发现叶片和花蕾中获得了两个不同的序
列 , 分别命名为 pSTGA3L (叶片 ) 和 pSTGA3F
(花蕾 )。比较二者的碱基序列发现同源性
84183% , 氨基酸同源性 8812%。 pSTGA3L 在
NCB I注册号码为 AY462247, pSTGA3F的注册号
码为 AF495729。
在 Southern blot检测发现 , 在基因组中有 3
个拷贝 (图 1)。分析其原因 , 一是因为草莓是天
然的多倍体 , 因此基因组中存在多个拷贝 , 另一
个原因就是赤霉素在植物体内有多种功能 , 而且
还影响相互矛盾的两个方面 ———营养生长和生殖
生长。在本试验中 , 我们获得了两个编码 STGA3
的片段 , 分别负责叶片和花中的目标基因的编码 ,
以响应营养生长和生殖生长的不同发育信号。
图 1　草莓基因组 D NA杂交
草莓 DNA的 EcoRⅠ , PstⅠ完全酶切产物与 32 P标记的
探针各得到 3条杂交带。
F ig. 1　D NA blot ana lysis of strawberry genom e
EcoRⅠ and PstⅠ digested strawberry DNA were hybridized
with 32 P labeled p robe, each got 3 bands.
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