全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 艺 学 报 2006, 33 (4) : 833～835
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 06 - 25; 修回日期 : 2005 - 09 - 01
基金项目 : 北京市重点实验室 “果树逆境生理与分子生物学实验室”资助项目 ; 教育部优秀教师教科奖励基金资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: rshan@ cau1edu1cn)
苹果属小金海棠转录因子 M xM YB 1基因的克隆及
其原核表达
曹冬梅 1, 2 许雪峰 1 韩振海 13
(1 中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 100094; 2 山西省农业科学院园艺研究所 , 山西太原 030031)
摘 要 : M xM YB 1是苹果属小金海棠 MYB类转录因子。MxMYB1含 1个重复序列及 MYB蛋白特有的
氨基酸组成。酶切、PCR扩增及测序分析表明构建的原核表达载体结构正确 , 未出现碱基突变及移码现
象。1 mmol/L IPTG诱导 2 h后 , 在预期的蛋白分子量 38 kD处出现 1条表达加强的蛋白条带 , 而未经诱导
的转化子没有此蛋白条带。为进一步目的蛋白的纯化和鉴定提供试验基础。
关键词 : 转录因子 M xM YB 1; 原核表达 ; pET30a2MxMYB1
中图分类号 : S 661 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0420833203
Iden tif ica tion and Prokaryotic Expression of Tran scr iption Factor M xM YB 1
Gene in M a lus xiao jinensis
Cao Dongmei1, 2 , Xu Xuefeng1 , Han Zhenhai13
(1 Institu te of Horticultural P lan ts, Ch ina A gricultural U niversity, B eijing 100094, Ch ina; 2 Institu te of Horticu lture, Shanxi A gri2
cu ltura l A cadem y, Ta iyuan, Shanxi 030031, Ch ina)
Abstract: M xM YB 1 is a MYB transcrip tion factor from M alus x iaojinensis. MxMYB1 contains a highly
conserved DNA binding domain and am ino acids existed in MYB p roteins particularly. Restriction endonucle2
ase analysis, PCR amp lifying and sequencing confirmed that construction was correct and had no base mutant
and drift. SDS2PAGE of pET2MxMYB1 p roteins induced by 1 mmol/L IPTG showed that there was a strength2
ened p rotein band in expectant 38 kD p rotein Marker, but SDS2PAGE of pET2MxMYB1 p roteins uninduced by
IPTG had not this band. These results will more p rovide the foundation for purifying and identifying objective
p rotein.
Key words: Transcrip tion factorM xM YB 1; Prokaryotic exp ression; pET30a2MxMYB1
1 目的、材料与方法
作者已经成功地克隆到了 1个缺铁诱导加强表达的苹果属小金海棠转录因子 M xM YB 1, 但目前对
该基因的结构和功能还不清楚 , 为此 , 本试验对其结构进行了分析 , 且在体外进行了融合蛋白的表
达 , 这就为进一步利用融合蛋白为抗原制备抗血清提供了条件 , 进而为研究转录因子 M xM YB 1的生
理功能及组织定位提供有用的蛋白探针。本试验是在 pTrip leEX2MxMYB1的阅读框两端设计了两个特
异引物 , 利用 PCR技术扩增了 906 bp片段 , 将其构入 pET230a ( + ) 原核表达载体 , 通过 IPTG诱导
了融合蛋白表达。所用的两个引物为 5’引物 : 5’2ATAGAATTCATGTCGTCCGGCAC23’; 3’引物 :
5’2CCGTCGACTCAAGCGACACTG23’。DNA序列由人工测序或自动测序仪测定 (华大中生和大连宝生
物 ) , ORF、MYB结构域等分析通过 DNAMAN、SMART和 PROSITE等软件完成。蛋白同源序列比较
在 NCB IBLAST和 Genedoc程序中进行。原核表达载体的构建见图 3, 获得的 pET30a - MxMYB1重组
质粒进行 PCR、酶切鉴定及 DNA测序分析。酶切、连接、转化、碱裂解法提纯质粒 DNA , 操作见参
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园 艺 学 报 33卷
考文献〔1〕。融合蛋白的诱导表达参考 Hames等的方法〔2〕。
2 结果分析与讨论
211 M xMY B1蛋白的结构分析及同源性比较
在以前的试验中利用探针杂交的方法 , 从小金海棠缺铁 cDNA文库中筛选到 1个 M xM YB 1基因
( GenBank登录号 : AY196776)。对其编码蛋白的结构和氨基酸组成特点进行了分析 , 结果如下 :
MxMYB1蛋白仅含有 1个 1R重复序列 , 并含有对维持 DNA结合域的疏水核起主要作用的色氨酸残基
(图 1)。MxMYB1的另一个特点是在其 C -端富含脯氨酸 , 这样的结构基序在其它的调控蛋白中也发
现〔3, 4〕, 可能具有转录激活功能〔5〕。此外 , 在其 C端还富含丝氨酸 , N端和 C端的丝氨酸区可能是磷
酸化位点 , 表明 MxMYB1的细胞内活性受到磷酸化调节。
图 1 各种不同来源 MY B蛋白的 1R重复序列的同源性分析3 为保守的色氨酸残基。
F ig. 1 Com par ison of the am ino ac id sequence w ith 1R repea t of D NA b ind ing doma in from d ifferen tMY B2rela ted prote in
The regularly spaced Trp residues are labeled with asterisks.
212 小金海棠转录因子 M xM YB 1表达载体的构建及鉴定
利用特异引物从 pTrip leEX2MxMYB1中扩增出约 900 bp左右的片段 , 与试验设计相符 (图 2)。
为 了方便质粒的构建 , PCR扩增时在引物两端引入了酶切位点 EcoR I和 Sa l I, 同时去掉了基因 3’和
图 2 PCR扩增产物的电泳鉴定
F ig. 2 Electrophoresis of PCR product
M: Marker; Lane 1, 2: PCR p roduct.
图 4 重组表达质粒 pET30a2M xMY B1的酶切鉴定图
F ig. 4 Iden tif ica tion of recom b inan t pla sm id
pET30a2M xMY B1 by restr iction d igestion 图 3 重组表达质粒 pET30a2M xMY B1构建流程图Fig. 3 Construction of recombinant expressionplasm id pET30a2MxMYB1
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4期 曹冬梅等 : 苹果属小金海棠转录因子 M xM YB 1基因的克隆及其原核表达
5’端的非翻译区。基因的 5’端直接与原核表达
载体进行融合表达 , 因此基因 5’端与启动子之间
的距离不会对表达造成直接影响。
PCR产物回收后 , 经 EcoR I和 Sa l I双酶切 ,
以粘连的方式构入 pET230a ( + ) 的 EcoR I和 Sa l
I位点 , 得到重组表达质粒 pET2MxMYB1 (图 3)。
对重组 pET2MxMYB1 质粒的酶切分析表明
(图 4) , 用 EcoR I和 S a l I双酶切 , 可切出 900 bp
左右片段 , 表明扩增的 M xM YB 1片段已插入载体
质粒中。在此基础上 , 又进一步以重组表达质粒
pET2MxMYB1为模板 , 采用 PCR方法扩增出 900
bp左右扩增片段 (图 5 ) , 进一步证明 pET2
MxMYB1重组质粒构建正确。
为了进一步证明重组质粒构建正确 , 在酶切
及 PCR鉴定的基础上 , 对重组表达质粒 pET30a2
MxMYB1进行了序列测定 , 序列测定结果表明 ,
构建质粒的序列完全正确 , 未出现碱基突变及移
码现象。
213 M xMY B1蛋白的原核表达
将重组质粒 pET30a2MxMYB1转化大肠杆菌
BL21, 经 IPTG诱导后提取大肠杆菌总蛋白进行
SDS - PAGE分析。结果 (图 6) 显示 , 插入有外
源片段的重组质粒 pET30a2MxMYB1经 IPTG诱导
后 , 在预计的蛋白分子量 38 kD左右有一条染色
较对照 (泳道 3～5) 深的蛋白条带。表明重组质
图 5 重组表达质粒 pET30a2M xMY B1的 PCR鉴定
F ig. 5 Iden tif ica tion of recom b inan t pla sm id
pET30a2M xMY B1 by PCR
图 6 重组表达质粒 pET30a2M xMYB1表达产物的 SDS2PAGE分析
F ig. 6 SD S2PAGE ana lysis for the expression
product of pET30a2M xMY B1
Lane 1: Total proteins of induced Ecoli. transformed with pET230a ( + ) ;
Lane 2: Total proteins of uninduced Ecoli. transformed with pET30a2MxMYB1;
Lane 3 - 5: Total proteins of induced Ecoli. transformed with pET30a2MxMYB1.
粒 pET2MxMYB1在大肠杆菌 BL21中诱导表达了 MxMYB1蛋白。
到目前为止 , 外源基因的原核表达仍然是大量获得目的蛋白的一条最有效途径〔6〕, 特别是对于
那些在组织或细胞中含量少且不易获得的蛋白 , 原核表达则是一条最佳途径。为了在体外对小金海棠
转录因子 M xM YB 1的性质和功能进行研究 , 首先必须获得一定数量的、纯度比较高的活性蛋白质 ,
因此本试验构建了原核表达载体。试验构建的 pET30a2MxMYB1结构正确 , 将构建好的重组质粒转化
到 BL21表达菌后得到了正确表达 (图 6)。在试验过程中 , 我们还发现细菌培养的条件对大肠杆菌中
H is62MxMYB1融合蛋白的表达有一定的影响 , 同样的培养和诱导条件 , 不同批的菌种 , 最后得到的
融合蛋白的纯度是不同的。
参考文献 :
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