全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (3) : 671～674
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 05 - 18; 修回日期 : 2005 - 09 - 07
基金项目 : 广东省自然科学基金资助项目 (05300272) ; 广东省科技计划项目 (2005B20901019)3 通讯作者 Author for correspondence
蝴蝶兰外植体褐变发生与总酚含量、 PPO、 POD
和 PAL的关系
许传俊 1, 2 　李　玲 13
(1 华南师范大学生命科学学院 , 广东省植物发育生物工程重点实验室 , 广东广州 510631; 2 福建省亚热带植物研究
所 , 福建厦门 361006)
摘 　要 : 蝴蝶兰外植体在褐变发生前期 PPO和 POD活力皆升高 , 褐变发生后酶活力下降。同工酶谱分
析发现 , 培养 0 d的蝴蝶兰外植体 PPO没有酶带出现 , 而 POD有 1条弱带。离体培养 2 d POD出现 3条酶
带 , 第 4天有新酶带 Ⅰ发生 , 随后消失 , 其余 3条带 , 随培养天数的延长 , 酶带活性渐弱。PPO同工酶谱
在培养 2 d出现 3条酶带 , 迁移率为 0128的酶带 Ⅲ在培养 4 d活性较强 , 随后 3条酶带减弱。总酚含量和
PAL活力随外植体褐变增强而逐渐增加 , 两者呈现极显著正相关。
关键词 : 蝴蝶兰 ; PPO; POD; PAL; 外植体褐变 ; 总酚
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0320671204
Changes of Tota l Phenol Con ten t and the Activ ities of PPO, POD and PAL
dur ing the Brown ing in Pha laenopsis Explan t in V itro
Xu Chuanjun1, 2 and L i L ing13
(1 College of L ife Science, Sou th China N orm al U niversity, Guangdong Key L abora tory of B iotechnology for Plan t D evelopm ent,
Guangzhou, Guangdong 510631, China; 2 Fujian Institu te of Subtropica l B otany, X iam en, Fu jian 361006, China)
Abstract: In the early stage of Pha laenopsis exp lant browning, the activities of PPO and POD increased,
while in the later stage, their activities declined. The PPO and POD isoenzyme showed that no PPO band ap2
peared in 0 day culture, while a weak band of POD appeared. After 2 days culture, there were three bands of
POD appeared, and the band Ⅰappeared after cultured for 4 days and dispersed in another day; and three
bands of PPO isoenzyme in browning cell appeared and the band Ⅲ had a higher activity when cultured for 4
days, the activitives of PPO and POD declined whit the culture extension. A s exp lant turned black, the con2
tent of total phenol compounds and the activity of PAL increased and there was a extremely positive correlation
between them.
Key words: Pha laenopsis; PPO; POD; PAL; Exp lant browning; Total phenol content
1　目的、材料与方法
外植体褐变是植物组织培养中遇到的重要问题 , 一般认为酚类物质是外植体酶促褐变的反应中的
底物 , 其含量与外植体褐变密切相关〔1〕, 多酚氧化酶 (polyphenol oxidase, PPO ) 是催化褐变反应的
关键酶〔2〕, 过氧化物酶 (peroxidase, POD) 是植物防御中的第一道防线 , 有报道说 POD和 PPO共同
氧化酚成醌 , 醌转变成缩合型鞣质 , 最后形成褐色的聚合体〔3〕。关于酚和 PPO在植物组织 (如果实
等 ) 褐变中的关系报道较多 , 对在离体培养组织发生褐变时酚与 PAL之间的关系 , 以及外植体褐变
发生过程中 PPO和 POD同工酶谱变化与褐变之间的关系尚未有研究。作者研究蝴蝶兰外植体褐变发
生过程中 PPO和 POD活力及其同工酶谱的变化 , 探讨总酚含量和 PAL活力与褐变发生的相关性 , 为
全面了解离体培养组织发生褐变的机理提供基础。
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
蝴蝶兰 ( Phalaenopsis) , 取自华南师范大学生物园 , 取其第 2和第 3片叶的上半部接种。在 MS
+ 3 mg/L 62BA培养基上、 (24 ±2) ℃、光照 16 h /d、2 000 lx条件下培养。培养 5 d外植体开始出现
褐变 , 14 d外植体已经全部褐变。随机取蝴蝶兰离体培养 0～14 d外植体 , 测定 PPO活性〔1〕、总酚含
量〔1〕、POD活性〔4〕和 PAL活性〔5〕, 重复 3次。以培养 0 d的外植体为对照。PPO和 POD同工酶谱分
析参照薛俊杰等〔6〕的方法。
数据采用 SPSS“One - W ay ANOVA”过程进行统计分析 , 多重比较采用 LSD法。
2　结果分析和讨论
211　蝴蝶兰叶片外植体褐变过程中 PPO 和 POD
活力的变化
蝴蝶兰叶片外植体在 MS培养基中培养 5 d开
始发生褐变 , 分析 PPO活力可见 (表 1) , 离体
培养 2 d酶活力极显著升高 , 为接种前的 710倍 ,
4 d与 2 d酶活力无显著差别 , 6 d后酶活力显著
下降。离体培养 2 d外植体 POD的活力约为对照
的 7倍 , 4 d酶活力极显著提高 , 第 6天 POD酶
活力又极显著下降 , 第 8天酶活力再次上升 , 随
后活力显著下降。
212　蝴蝶兰叶片外植体褐变过程中 PPO 同工酶
谱的变化
蝴蝶兰叶片在离体培养前 PPO活性极低 , 经
聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 不出现酶带 (图 1) , 经离
体培养 2 d的外植体出现 1条酶带 , 迁移率 ( Rf
值 ) 为 0128 (谱带 Ⅲ) , 另有两条弱带隐约可见 ,
迁移率分别为 0121和 0124 (谱带 Ⅰ和 Ⅱ) , 在离
体培养第 4天谱带 Ⅲ增强 , 谱带 Ⅰ、Ⅱ较弱。培
养 6 d后的外植体都出现 3条酶带。
213　蝴蝶兰叶片外植体褐变过程中 POD 同工酶
的变化
对照样品 POD活性较低 , 经聚丙烯酰胺电泳
图谱中只出现 1条弱带 , 培养 2 d的外植体出现
两条活性较强谱带即 Ⅱ带和 Ⅲ带 (图 2) , 迁移率
分别为 013和 0137, 有 1条弱带 Ⅳ (迁移率为
0143) ; 培养第 4 天的外植体 POD 有 4 条酶带
(谱带 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ) , 且活性增强 , 其中谱带
Ⅱ和 Ⅲ活性较强 , 酶带 Ⅰ (迁移率 0126) 新出
现。培养 6 d的同工酶谱有活性较强谱带 Ⅱ、Ⅲ
和 Ⅳ, 谱带 Ⅰ消失。第 8天到第 10天也只出现
Ⅱ、Ⅲ和 Ⅳ带 , 活性较强 , 以后这 3条带活性减
弱。
214　蝴蝶兰叶片外植体褐变过程中 PAL 活力和
总酚含量变化
表 1　蝴蝶兰外植体发生褐变过程中 PPO和 POD活力的动态测定
Table 1　Changes in PPO and POD activ ities dur ing
Pha laenopsis explan t brown ing
培养天数 Culture days( d) POD (U /mg) PPO (U /mg)
0 (对照 , Control) 0154Ee 1111Dd
2 3173CDd 7179ABab
4 9139Aa 7193ABab
6 4141Ccd 6182BCb
8 7128Bb 515BCbc
10 4179Cc 2141Dd
12 3164Dd 2164CDcd
14 4123CDcd 1192Dd
　　注 : 大写字母表示差异达极显著 ( P < 0101) , 小写字母表示
差异显著 ( P < 0105) , 下表同。
Note: D ifferent cap ital and small letters mean significance at 0101
and 0105 level, respctively. The same below.
图 1　蝴蝶兰外植体褐变过程中 PPO同工酶谱的变化
1: 对照 ; 2～8: 培养了 2、4、6、8、10、12、
14 d的蝴蝶兰外植体 PPO同工酶。
F ig. 1　PPO isoenzym e dur ing Pha laenopsis explan t brown ing
1: Control; 2 - 8: PPO isoenzyme of Phalaenopsis exp lants
cultured for 2, 4, 6, 8, 10, 12 and 14 days.
图 2　蝴蝶兰外植体褐变过程中 POD同工酶谱的变化
1: 对照 ; 2～8; 培养了 2、4、6、8、10、12、
14 d的蝴蝶兰外植体 POD的同工酶。
F ig. 2　POD isoenzym e dur ing Pha laenopsis explan t brown ing
1: Control; 2 - 8: POD isoenzyme of Phalaenopsis exp lants
cultured for 2, 4, 6, 8, 10, 12 and 14 days.
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　3期 许传俊等 : 蝴蝶兰外植体褐变发生与总酚含量、PPO、POD和 PAL的关系 　
　　对照样品 PAL 酶活力很低 , 检测不到 (表
2) , 培养 2 d后能检测到该酶的活力 , 随着外植
体开始褐变 , 酶活力逐渐增强 , 培养 8 d的外植
体 PAL活力比培养 2 d的显著增加 , 12 d和 14 d
比 2 d和 4 d的又为极显著或显著增强。酚含量的
变化与 PAL变化有相似的趋势 , 初期总酚含量略
增加 , 第 6天总酚含量比前几天显著增加 , 并一
直维持在较高的水平 , 到第 14天又比第 6天极显
著增加 (表 2)。
PPO和 POD 都是植物体内参与防御反应的
酶 , 接种后可以发现 , 蝴蝶兰外植体内 PPO和
表 2　蝴蝶兰外植体褐变过程中 PAL活力和总酚含量变化
Table 2　Changes in PAL activ ity and tota l phenolic con ten t
dur ing Pha laenopsis explan t brown ing
培养天数
Culture days( d) PAL (U /mg)
总酚
Total phenolic (μg/mg)
0 - 11137Dc
2 0159Cc 15180CDc
4 1105BCc 15145CDc
6 1141ABCbc 24105BCDb
8 2119ABCab 36196ABb
10 1195ABCabc 33154ABCb
12 3125Aa 35184ABb
14 2164ABab 52199Aa
POD活力都显著增加 (表 1) , 褐变发生后活力开始降低 ; 同工酶分析也表明 , 离体培养前 PPO和
POD几乎没有酶带出现 , 活力很低 ; 离体培养后 , PPO和 POD都出现新的酶带 , 且活力增强 ; 说明
接种后外植体内可能有新的 PPO和 POD合成。褐变发生后 , PPO和 POD活力降低 , 说明它们参与褐
变的开始。而随着褐变的加重 , 总酚的含量增加 , 与 PAL活力呈极显著正相关 ( r = 018673, P <
0101) , PAL应该与随后的褐变加重有密切的关系。
一直认为褐变与外植体材料的总酚含量关系密切〔1〕, 总酚含量低的材料容易成功〔7〕。试验表明 ,
在褐变发生过程中酚类物质并没有随褐变的加重而氧化减少 , 而是逐渐的增加 , 与其合成酶 PAL活
性增强呈现显著的正相关 , 褐变的发生可能并不只是由于酚的氧化 , 而主要在于在此过程中酚类合成
的增加。有试验证实 , 抑制酚类的合成可以抑制褐变的发生〔8〕。抑制 PAL活性 , 褐变发生也会被抑
制〔8, 9〕。作者证实在外植体褐变中 , 酚类产生鞣质〔10〕, 鞣质对细胞有毒害作用 , 同时细胞结构被破坏
(另文发表 ) , 代谢发生紊乱 , 导致培养失败。这些结果解释了在组织培养过程中 , 使用 PPO氧化的
抑制剂柠檬酸或抗坏血酸以及酚类的吸附剂如 PVP、活性炭等物质虽然在有些材料上可以成功 , 但有
一定局限 , 不能有效的抑制褐变的原因。
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收稿日期 : 2005 - 12 - 08; 修回日期 : 2006 - 04 - 30
基金项目 : 科研院所社会公益研究专项 (2005D IB4J045)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xllzy@2631net)
海南钻喙兰离体繁殖及植株再生
李志英 　徐 　立 3 　 (中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 , 海南儋州 571737)
In Vitro Propaga ion and Plant Regeneration of Rhynchostylis gigan tiea (L indl. )
Ridl.
L i Zhiying and Xu L i3 　 ( Institu te of Tropical C rops Genetic R esources, Ch inese A cadem y of Tropica l A gricu ltura l Sciences,
D anzhou, Hainan 571737, China)
关键词 : 海南钻喙兰 ; 类原球茎体 ; 植株再生
中图分类号 : S 68 　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0320674201
海南钻喙兰 〔Rhynchosty lis gigan tiea (L indl. ) R idl. 〕是兰科钻喙兰属植物 , 为我国云南、海南特有的野生兰花
品种。近年来由于无限制采挖 , 海南的野生海南钻喙兰数量锐减 , 严重影响了海南钻喙兰生态群的构成 , 几近濒危。
由于其种子在自然条件下不易萌发 , 分株法繁殖速度太慢 , 因此 , 作者以海南钻喙兰未成熟种子为外植体 , 通过类原
球茎体途径 , 对海南钻喙兰进行了离体快速繁殖。
分期取海南热带植物园中海南钻喙兰授粉后 90 d的蒴果 , 先用自来水冲洗表面 , 然后在超净工作台用 70%乙醇
进行表面消毒 2次 , 每次 2 m in, 吹干后 , 小心剖开蒴果 , 用镊子取出细小的种子接种在添加不同植物生长调节剂的
MS固体培养基上。培养温度 (25 ±2) ℃, 光照 12 h /d, 光照强度 1 000～1 500 lx。
结果表明 : 未成熟种子接种到 1 /2MS +BA 015 mg/L +NAA 0～012 mg/L的培养基上 40 d开始膨大 , 60 d左右开
始分化出白色愈伤组织 (图版 , 1)。诱导 60 d的愈伤组织转入添加 BA 210 mg/L和 NAA 012～210 mg/L的 1 /2MS培
养基上 , 60 d左右可形成指状胚状体 (图版 , 2) , 类似种子萌发形成的早期原球茎 , 称类原球茎 ( p rotocorm2like
bodies, PLB s)。其中以 BA 210 mg/L +NAA 110 mg/L对 PLB s的诱导率最高 , 为 7517%。降低 NAA的浓度 , 胚性愈伤
组织容易转绿 , 形成少量类原球茎并萌发成苗 ; 提高 NAA浓度 , 外植体容易玻璃化。PBL s每 50 d转入相同的新鲜培
养基可保持不断增殖的状态。PLB s在不添加任何外源生长调节剂的培养基上培养 20 d后 , 顶部膨大并分化出子叶 ,
同时在膨大部位的基部分化出假根 (图版 , 3) , 类似种子萌发形成的原球茎 ; 继续培养 , 可逐渐分化出真叶 , 培养
60 d, 可形成具有 2～3片真叶的不定芽 , 并带有已经发育的根 (图版 , 4)。分离具有 2～3片真叶的小苗 , 接种到添
加 100 g/L香蕉的 MS培养基上培养 80 d, 即可获得叶片长 1～2 cm, 根长 015～1 cm的健壮植株。离体培养的海南钻
喙兰植株洗净培养基 , 沥干水分 , 移栽到粗椰糠 ∶河沙 (1∶1) 的基质中 , 湿度保持 85%左右 , 适度遮荫 , 成活率可
达 95%以上。该体系能够使 PLB s在相同的培养基中不断增殖 , 而多种兰花的 PLB s均可用于基因的遗传转化 , 因此 ,
该体系的建立不仅为海南钻喙兰的快速繁殖提供了技术参考 , 也为海南钻喙兰的深入研究奠定了基础。
图版说明 : 1. 胚性愈伤组织 ; 2. 类原球茎体 ; 3. 类原球茎体萌发 ; 4. 芽丛。
Explana tion of pla tes: 1. Embryonic callus; 2. Protocorm2like bodies; 3. Germ inated p rotocorm s with rhizoid; 4. Shoots.
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