全 文 ：苜蓿褐斑病抗性与几种同工酶的关系
袁庆华1 ,桂枝2
(1.中国农业科学院畜牧研究所 ,北京 100094;2.天津农学院 ,天津 300384)
摘要:以苜蓿 5 个品种在褐斑病抗性上存在差异的抗 、感单株为材料 ,研究了接种病菌后苜蓿褐斑病抗性与多酚氧
化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)及其酶活性的关系。研究结果表明 ,褐斑病侵染后 , 苜蓿
抗病株系和感病株系叶片中 PPO、POD和 SOD 同工酶谱带多少和强弱存在明显的差异 ,即大部分抗病株系 PPO 、
POD 和 SOD酶活性高于感病株系 , 并有新的同工酶带出现。PPO、POD和 SOD 在苜蓿抗褐斑病上可能起到重要作
用 , 其同工酶谱带和酶活性的差异有可能做为鉴定苜蓿抗褐斑病的一种同工酶标记。
关键词:苜蓿;褐斑病;PPO;POD;SOD
中图分类号:S551.903.4　　文献标识码:A　　文章编号:1004-5759(2003)06-0058-06
　由苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)引起的苜蓿褐斑病是苜蓿(Medicago sativa)最重要的病害之一 ,
可引起产量下降和品质劣化 ,造成严重损失[ 1 ,2] 。近年来 ,国内外一些学者致力于苜蓿抗病性的田间鉴定和筛
选[ 3 ,4] ,试图通过苜蓿抗病品种的选择来降低病害损失;而找到适宜作苜蓿抗褐斑病种质材料鉴定的同工酶标
记 ,减少表型选择可能导致的误差 ,则是缩短抗病品种选育周期 、加快育种进程的重要途径。
PPO(多酚氧化酶)、POD(过氧化物酶)和 SOD(超氧化物歧化酶)在植物抗病和抗逆过程中起着重要的作用 ,
已受到许多科学家的关注[ 4 ,5] 。以往利用同工酶标记技术主要进行种间或品种间抗病性研究 ,较少用于同一品
种内不同个体间的抗性差异研究 ,特别是在苜蓿褐斑病的研究上还未见文献报道。笔者选用苜蓿同一品种内抗
病性不同的株系进行抗病性鉴定 ,研究抗病株系与感病株系受病原菌侵染后 4个不同时期叶片中 PPO 、POD和
SOD同工酶谱的变化 ,分析这 3种酶的活性及酶谱变化 ,作为苜蓿褐斑病抗 、感株系生化标记鉴定的可行性 ,为
苜蓿抗褐斑病育种及抗病机制研究提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　供试品种
选用具不同病情指数的 5 个苜蓿品种 , 即伊鲁瑰斯(Iroquois)、沙湾(Shawan)、萨兰斯(Saranac)、泾阳
(Jingyang)和沙河(Shahe),用离体叶接种方法[ 6]从每个品种 600株中筛选出最抗和最感的单株 ,进行无性扦插
扩繁 ,取扩繁后的抗 、感单株作为供试材料[ 7] 。
1.2　菌种培养 、接种和取样
苜蓿假盘菌的分离培养及病原菌的接种 ,参照袁庆华 2001年报道的方法[ 6 , 8] ,分别于接种后 2 ,7 ,12 , 17 d对
抗感单株逐株取相同部位的 1个叶片 ,将同一抗病或感病单株的叶片放在一起 ,并用去离子水冲洗干净 ,用于制
备酶液[ 8] 。
1.3　酶液制备
参照袁庆华 2002年的方法[ 8] 。3种酶的活性在苜蓿中差异较大 , POD酶活性最大 ,电泳时在原母液的基础
上再稀释 4倍 , PPO需稀释 2倍 ,SOD稀释 3倍。
1.4　PPO同工酶电泳分析
利用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析 PPO同工酶 。电极缓冲液为 Tris-甘氨酸 , pH8.3。分离
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草　业　学　报
ACTA PRATACULTURAE SIN ICA
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Vol.12 , No.6
收稿日期:2003-02-12基金项目:国家自然科学基金项目(39870559)和国家科技部基础性工作专项基金项目(2001-2003)。作者简介:袁庆华 ,(1959-),女 ,天津人 ,副教授。
胶浓度 10%(pH8.9),浓缩胶浓度 2.5%(pH6.7),加样量为每孔 40μl(酶液与上样缓冲液比例为 9∶1;上样缓冲
液是由 0.25%溴酚蓝 , 0.25%二甲苯青和 40%蔗糖水溶液制备而成),在 4℃下电泳 ,电泳开始稳压到 150 V ,当
样品进入到分离胶后 ,再将电压控制到 120 V ,稳压 11 ～ 12 h。
用 1%邻苯二酚 60 ml 、0.05 mol/L 磷酸缓冲液 20 ml(pH6.8)和 0.06%对苯二胺 20 ml混合后染色约 10
min ,显带后再用 0.000 1 mol/L 抗坏血酸(Vc)停止反应 ,5 min后用流水冲洗 ,描图并摄影记录。
1.5　POD同工酶电泳分析
POD同工酶电泳采用的分析方法与上述 PPO同工酶电泳分析方法基本相同 ,主要区别是 POD分离胶浓度
为 7.1%。
染液为联苯胺溶液(2 g 联苯胺+18 ml冰醋酸+72 ml蒸馏水)4 ml ,3%过氧化氢溶液 0.8 ml和水 15.2 ml
混合后染色约 3 ～ 5 min ,显带后将染液倒掉 ,并用蒸馏水冲洗 。
1.6　SOD同工酶电泳分析
SOD同工酶电泳分析方法与 PPO同工酶电泳分析方法相同 ,所不同的是样品进入分离胶后 ,稳压 10 h。将
电泳后的凝胶浸泡在 2.45×10-3 mol/L 氮蓝四唑(NBT)溶液中 20 min ,然后再把凝胶放入含有 0.028 mol/L 四
甲基乙二胺(TEmol/LED)、2.8×10-5 mol/L 核黄素和 0.030 mol/ L磷酸缓冲液(pH7.8)中浸泡 15 min ,最后将
凝胶浸在含有0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液和 10-4 mol/L EDTA溶液中 ,并在 4 000 lx 下光照 3040 min ,待
出负带后终止反应。
2　结果与分析
2.1　PPO同工酶
从 PPO同工酶电泳扫描图可以看出 ,苜蓿各品种抗 、感株系间谱带的多少和强弱有明显的差异(图 1)。伊
鲁瑰斯接种后 7 , 12和17 d ,抗病株比感病株峰值略高些 ,活性相对较大 。沙湾抗病株在接种后的 2和 7 d出现4
条谱带 ,而感病株只有 3条谱带。萨兰斯接种病菌后的任何时期抗病株均比感病株多 1条谱带。泾阳和沙河抗 、
感株间谱带的多少和酶活性也存在差异 ,泾阳抗病株接种后 7和 17 d 比感病株多了 1条弱谱带 ,沙河抗感株间
谱带的数量差异不大 ,但峰值的高矮不太一致 。
2.2　POD同工酶
苜蓿的 5个品种抗 、感株系间 POD同工酶电泳扫描谱带的强弱和多少也存在着明显差异(图 2)。伊鲁瑰斯
接种后 17 d的 POD同工酶谱中 ,抗病株酶活性显著高于感病株 ,在接种后 12 d的 POD谱带中抗病株和感病株
都是 4条谱带 ,但谱带位置不同 。沙湾在接种后 12 d的 POD谱带中抗病株比感病株多了 1条弱谱带 ,接种后的
其他 3个不同时期抗病株与感病株都出现 3条强谱带和 1条弱谱带 。萨兰斯抗病株与感病株在 POD谱带上差
异明显 ,在接种后 2和 17 d抗病株比感病株分别增加了 1条强谱带 ,酶活性也明显高于感病株。泾阳接种后 7 d
的 POD同工酶谱中 ,感病株的酶活性显著低于抗病株 ,接种后 2 、12和 17 d的 POD谱带中 ,抗病株比感病株多 1
条弱谱带 。沙河抗感株间 POD谱带也存在差异 ,接种后 12和 17 d抗病株酶活性高于感病株 ,接种后 2 d的抗病
株比感病株多了 2条弱带 ,接种后 7 d抗病株有 3条强带和 2条弱带 ,感病株只有 2条强带和 2条弱带 。
2.3　SOD同工酶
从SOD同工酶电泳扫描谱带结果显然可以看出 ,5个苜蓿品种抗病与感病株间大多数谱带有明显差异(图
3)。从 5个苜蓿品种接种后的 4个不同时期来看 ,抗病株酶活性明显高于感病株。伊鲁瑰斯接种后 12 d的 SOD
谱带上 ,抗病株倒数第 2条是强谱带 ,而感病株是 1 条弱带 。沙湾接种后 2 d抗病株比感病株多了 1 条弱谱带。
萨兰斯抗病株 SOD的酶活性在接种后的各个时期比感病株都高 ,而且接种后的 7 ,12和 17d同工酶谱带都比感
病株多 1条 。泾阳抗病株接种后2 d的 SOD谱带比感病株增加了1条 。沙河抗感病株接种后 2 d ,抗病株有2条
强谱带而感病株只有 1条 ,接种后 7 d抗病株又比感病株多了 1条弱谱带 ,并且各时期的酶活性都比感病株高。
3　讨论
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图 1　5 个苜蓿品种抗 、感株系间 PPO同工酶谱带
Fig.1　PPO isozyme zymograms of resistant and susceptible plants of five alfalfa cultivars
—抗病株 Resistant plants ,---感病株 Susceptible plants
3.1　应用 PPO 、POD和 SOD同工酶技术 ,在一定程度上可以从酶带的数量和酶活性的强弱等方面检测品种内
的差异 ,但是做为一种特殊蛋白质 ,同工酶的产生和表达不仅受基因调控 ,而且还受细胞内外环境 、植物的组织器
官 、植物发育时期和生理状态以及蛋白质自身特性等因素的影响 ,所以很难在同一品种内表达。另外 ,病菌的接
种 、取样 、酶液的提取及分析等操作技术也对同工酶谱带具有较大影响。
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3.2　本研究是利用离体叶接种技术 ,从各品种中分别筛选出 5株抗病单株和 5株感病单株 ,抗 、感株分别混合后
接种取样 ,进行同工酶分析 ,虽然各抗 、感株间酶带的多少和活性存在着一定的差异 ,但大部分抗 、感株间同工酶
谱带的位置 、数量和酶活性差异并不十分明显 ,这可能是由于同一品种内遗传基础 、生理生化过程和对环境的适
应方式比较接近的缘故。本试验所用的是亲本材料 ,亲代中抗 、感株系间所表现出的差异是否能够稳定遗传给子
代还有待于对子代做进一步的分析 。
图 2　5 个苜蓿品种抗 、感株系间 POD 同工酶谱带
Fig.2　POD isozyme zymograms of resistant and susceptible plants of f ive alfalfa cultivars
—抗病株 Resistant plants ,---感病株 Susceptible plants
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3.3　本研究结果表明 ,苜蓿抗 、感株系叶片受苜蓿假盘菌侵染后 PPO 、POD和 SOD同工酶谱带的多少和强弱发
生相应变化 ,部分抗病株系 PPO 、POD和 SOD酶活性高于感病株系。抗 、感株系间酶带也存在差异 ,萨兰斯 、沙
湾 、泾阳和沙河抗病株在接种病菌后的不同时期比感病株多1或 2条 PPO 、SOD和POD酶带。从苜蓿抗 、感株间
PPO 、POD和SOD同工酶谱带的多少和强弱可以标记苜蓿抗褐斑病株系 ,除伊鲁瑰斯外 ,其余各品种抗病株系在接种
图 3　5个苜蓿品种抗 、感株系间 SOD同工酶谱带
Fig.3　SOD isozyme zymograms of resistant and susceptible plants of five alfalfa cultivars
—抗病株 Resistant plants ,---感病株 Susceptible plants
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病菌后的一定时间内均具有与感病株系不同的特异酶带 ,可通过特异酶带对抗病株系和感病株系加以区分。
3.4　同工酶可做为一种生化标记工具来研究植物的抗病性 。许多研究者指出[ 9] ,植物同工酶与植物抗病性关
系极为密切。本研究结果也进一步证实 ,应用 PPO 、POD和 SOD可以进行苜蓿品种内抗 、感株系的鉴定 ,这对苜
蓿抗褐斑病育种具有重要的实用价值。
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Relationships between Pseudopeziza medicaginis resistance and several isozymes in alfalfa
YUAN Qing-hua1 , GUI Zhi2
(1.Institute of Animal Science , CAAS , Beijing 100094 , China;2.Agronomic Department ,
Tianjin Ag ricultural College , Tianjin 300384 , China)
Abstract:The relat ionships between resistance to Pseudopez iza medicaginis and PPO , POD , and SOD were studied
in plants of 5 varieties of alfalfa(Medicago sat iva).Plants w ithin each variety w ith known difference in resistance to
P .medicaginis were used.The results showed that , af ter inoculat ion w ith P.medicaginis , there w ere evident dif-
ferences in the leaves between resistant and susceptible plants in zymog rams and activities of PPO , POD , and SOD.
Higher isozyme activities and more zymog ram lines w ere detected in the resistant plants than in the susceptible
plants , which suggest that the three isozymes studied may be very important in resistance of alfalfa to P.medicagi-
nis.PPO , POD and SOD may be used as isozyme markers for identification of resistance to P.medicaginis in alfalfa.
Key words:alfalfa;Pseudopez iza medicaginis;PPO;POD;SOD
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