全 文 ：学术园地　Academic Field
8　 PR ACTICAL FORES TRY TECHNOLOGY
二〇〇九年第六期　林业实用技术
华盖木组织培养过程中 PPO活性及
总酚含量与褐化的关系研究＊
马　均　马明东＊
(四川农业大学都江堰分校　四川　都江堰　611830)
＊基金项目:四川省科技厅应用基础研究
项目“红色警报级几乎绝迹种华盖木人工繁育
技术体系研究” 。四川农业大学都江堰分校科
技基金项目“华盖木生物学特性及繁育技术研
究” ,编号:N200702
作者简介:马　均(1975-), 女 , 硕士 , 讲
师。研究方向:林木生物技术。
＊通讯作者:马明东 ,男 , (1958-),教授 ,
硕士生导师 ,从事森林培育的教学和研究工作。
[ 摘要] 　以华盖木 4 年生嫁接苗当年生
枝为外植体 ,在初代培养过程中每周测定
外植体的多酚氧化酶(PPO)活性及总酚
含量 , 并统计外植体的褐化率 , 对华盖木
初代培养过程中外植体的褐化与 PPO 活
性及酚类物质含量的关系进行分析。结
果表明:华盖木外植体的总酚含量于接种
后第 2 周时达到最大值 2.444 5 mg/g 。
此后又快速下降。接种后 1 周内酶活性
快速增加 ,第 1 ～ 3 周 , 酶活性又大幅度下
降 ,第 3 ～ 4 周酶活性下降速度减缓。接
种后第 2、3 周是褐化的高发生期 , 第 3 周
后褐化率的增长较慢。 外植体的褐化受
着 PPO 活性和酚类物质含量的共同影
响。
[ 关键词] 　华盖木　初代培养　PPO 活
性　总酚含量　褐化
华盖木(Mangl ietiastrum sini-
cum Law)为木兰科单种属植物[ 1] ,
与木兰科木莲属近缘 ,被认为是最
原始的木兰科植物[ 2-3] ,为国家 Ⅰ级
保护的极度濒危物种[ 4] 。为保护和
扩大该物种种群 ,进行华盖木繁育
技术的研究就尤为迫切。目前华盖
木的人工繁育主要采用嫁接 , 但该
法繁殖率较低 ,不能满足扩大种群
和保存物种的需要。本实验发现 ,
华盖木扦插后约 2 周插条变褐死
亡;在组织培养快繁过程中 ,严重的
褐化现象是阻碍华盖木繁殖的一个
重要技术问题。而褐化主要是由多
酚氧 化酶 (Polyphenol Oxidase ,
PPO)引起的酶促褐变 。目前还未
见华盖木 PPO 酶活性及酚类物质
含量与褐化关系的报道 。因此 ,我
们对华盖木初代培养过程中 PPO
酶活性及酚类物质含量进行了研
究 ,分析了其与外植体褐化的关系 ,
旨在为控制华盖木繁育过程中褐化
现象的发生 、优化培养条件提供理
论依据。
1　材料与方法
1.1　试验材料
试验材料为四川农业大学都江
堰分校苗圃华盖木 4年生嫁接苗。
1.2　试验方法
1.2.1　材料的采集与接种　于晴
天的下午采集健壮无病虫害母株上
生长良好的当年生枝 ,清洗消毒后
切取带芽茎段为外植体接种到本实
验室筛选出的华盖木腋芽萌发诱导
适宜的 1/2MS +6-BA 1.0 mg/L +
KT 0.5 mg/ L培养基上[ 5] 。
1.2.2　测定指标及方法　分别于
培养至 1 、2 、3 、4周时测定多酚氧化
酶活性和总酚含量 。
PPO 活性测定:称取茎段 2.0 g ,
剪碎 ,加入少量石英砂和 10 mL 预冷
的磷酸缓冲溶液冰浴碾磨成匀浆 ,转
入 4 ℃离心管 , 10 000 r/min 离心
20 min ,上清液即为酶液。取酶液
0.2 mL 加入 3 mLpH 值 7.0的磷酸
缓冲溶液中 ,35 ℃水浴 10 min ,再加
入 0.14 mol/ L 的邻苯二酚溶液
0.5 mL。混合后立即转入比色皿在
波长 470 nm处测定光密度值 OD470 ,
每 30 s读数一次 ,读 3 min。以每分
钟光密度值增加 0.001为一个酶活
单位。
总酚含量测定:采用 Folin酚试
剂法 ,取新鲜嫩枝茎段 ,自然阴干 ,粉
碎过 2 mm 的筛子 ,称取样品 5 g ,置
于具 塞锥 形瓶中 , 加 70%丙酮
100 mL ,在 80 ℃水中水浴 3 h ,冷却
后过滤 ,在容量瓶中定容至 100 mL。
取 1 mL 滤液于 25 mL 容量瓶 ,用
70%丙酮定容。再从中取1 mL样液
于刻度试管中 ,加入 5 mL folin试剂 ,
混匀静置 3 min ,加入 5 mL 10%的
Na2CO3 溶液 ,混匀 ,避光静置 1 h ,蒸
馏水定容至 25 mL;另取一支试管 ,
加入 1 mL70%丙酮代替样液 ,加入
5 mL folin试剂 ,混匀静置 3 min ,加
入 5 mL 10%的 Na2CO3 溶液 ,混匀 ,
避光静置1 h ,蒸馏水定容至 25 mL ,
作为对照 ,在 760 nm 波长处测吸光
值。
以邻苯二酚含量为横坐标 ,吸
收值为纵坐标 ,绘制标准曲线。线
性回归方程为:Y =0.080 8X +
0.009 4 , R2 =0.999 2 ,邻苯二酚浓
度在 0.625 ～ 4.375μg/mL 范围内
与吸光值有良好的线性关系 ,以邻
苯二酚的含量表示样品中总酚物质
的含量。
1 g 样品中总酚含量(%)=
(a · v1 · v3)/(v2 ·w)×10-6 ×稀
释倍数×100
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二〇〇九年第六期　林业实用技术
式中:
a:样液中总酚的含量(μg/ mL)
v1 :样品粉末定容后的体积(mL)
v2 :测定时量取的滤液体积(mL)
v3 :将 v2 滤液定容后的体积(mL)
w:称样量(g)
2　结果与分析
2.1　初代培养过程中外植体总酚
含量变化
组织培养中外植体的褐化主要
是由于体内酚类物质被氧化为醌而
产生的 ,所以体内的酚类物质是褐
化产生的物质基础 。由图 1可以看
出 ,在初代培养过程中 ,华盖木外植
体的总酚含量呈一个单峰曲线 ,接
种后第 1周酚类物质含量没有明显
变化 ,但由第 1周到第 2周 ,酚类物
质含量大幅上升 ,达最大值2.444 5
mg/g 。此后又快速下降 ,这可能是
由于外植体在切割接种过程中 ,酶
与底物接触 ,发生氧化反应消耗大
量酚而使得酚类物质含量下降 。
图 1　初代培养外植体总酚含量变化
2.2　初代培养过程中 PPO 活性的
变化
PPO 是催化酚氧化为醌所必须
的酶 ,它的活性高低对外植体的褐
化有重要影响。由图 2 可以看出 ,
在初代培养过程中 ,接种后 1 周内 ,
酶活性快速增加 ,第 1 ～ 3 周时 ,酶
活性又大幅度下降 ,第 3 ～ 4周酶活
性下降速度减缓 。这可能是因为 ,
在刚接种后的第 1 周 ,由于外植体
受到切割 ,伤口暴露 ,且培养温度适
宜 ,酶活性大幅升高 ,而此后由于材
料的褐化 ,醌类物质的生成 ,又抑制
了酶的活性所致。
图 2　初代培养外植体酶活性变化
2.3　初代培养过程中外植体褐化
进程
在初代培养过程中 ,华盖木褐
化情况随培养时间呈上升趋势。由
图 3可以看出 ,华盖木在接种 1 周
后就有褐化出现 ,第 2 ～ 3周是褐化
的高发期 ,褐化率增长速率大 ,而第
3周后褐化率就达到较大值 , 由第
3 ～ 4周褐化率的增长较慢 。
图 3　初代培养中外植体褐化情况
2.4　外植体总酚含量 、PPO 活性与
褐化的关系
酚类物质是褐化发生的物质基
础 , PPO 是进行催化该反应的必须
酶 ,所以褐化的发生和 PPO 活性的
变化和酚类物质的含量有着紧密的
关系 。接种后第 1 周 PPO 活性和
酚含量都最高 ,但褐化出现相对较
少 ,这可能是由于此时虽酶活性和
酚含量都高 ,但反应产物醌在外植
体内的积累还较少 ,所以褐化没有
明显表现出来 。而第 2 ～ 3周虽然
PPO 活性和酚类物质含量都有所下
降 ,但反应产生的醌类物质在外植
体内大量积累 ,褐化就表现出来 ,所
以此时成为褐化出现的高峰。第 4
周新出现的褐化情况少 ,这是由于
此时 PPO 活性低 ,酚类物质含量减
少 ,反应速度减慢 ,同时醌类物质的
积累对反应也有抑制作用。
3　小结
(1)在初代培养过程中 ,华盖木
外植体的总酚含量呈一个单峰曲
线 ,接种后第 1周酚类物质含量没
有明显变化 ,但由第 1 ～ 2周 ,酚类
物质含量大幅上升 ,第 2周时达到
最大值 2.444 5 mg/g 。此后又快速
下降 。
(2)在初代培养过程中 ,接种后
1周内 ,酶活性快速增加 ,第 1 ～ 3周
时 ,酶活性又大幅度下降 ,第 3 ～ 4
周酶活性下降速度减缓 。
(3)华盖木在接种 1周后就有
褐化出现 ,第 2 ～ 3周是褐化的高发
期 ,褐化率增长速率大 ,而第 3周后
褐化率就达到较大值 ,第 3 ～ 4周褐
化率的增长较慢。
参考文献:
[ 1] 　Liu YH.A preliminary study on the
ta xonomy of the family Magno liace-
ae.Acta Phy to ta x sin , 1984.22(2):
89-109.
[ 2] 　吴征镒.中国种子植物属的分布区
类型.云南植物研究(增刊 IV)[ J] ,
1991 ,(1)139.
[ 3] 　吴征镒.中国种子植物属的分布区
类型的增订和勘误.云南植物研究
(增刊 IV)[ J] , 1993 , 14-178.
[ 4] 　傅立国.中国植物红皮书—稀有濒
危植物(第 1 册)[ M].北京:科学出
版社 , 1992:646-669.
[ 5] 　马　均 , 马明东.培养基激素组成
对华盖木腋芽萌发的影响[ J].林业
科技 , 2008 , 33(2):1-3.★