全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (6) : 811 - 818
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 01 - 02; 修回日期 : 2008 - 05 - 12
基金项目 : 湖南省重大科技专项 (05NK1002)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: dengzn@hunau1net)
柑橘溃疡病致病基因 pthA核定位信号肽抗血清的
制备及其抑菌研究
胡春华 , 徐　磊 , 马先锋 , 龙桂友 , 刘昆玉 , 邓子牛 3
(湖南农业大学园艺园林学院 , 国家柑橘改良中心长沙分中心 , 长沙 410128)
摘 　要 : 用 PCR法扩增位于柑橘溃疡病菌致病基因 pthA C -末端的 3个核定位信号序列 , 并将其克隆
到原核表达载体 PET32a ( + ) 上 , 经双酶切及核酸序列测定重组质粒 (p thA2NLS) , 其序列与 GenBank中
pthA的相关序列有 9919%的同一性。重组质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3) 后诱导了重组多肽的表达 , 并用
N i2 + 2NTA纯化柱得到了 48 kD的纯化重组多肽。把重组多肽注入免疫 Balb /c小白鼠 , 制备了相应的抗血
清 , W estern blotting和 EL ISA分析结果表明 , 抗血清可特异地结合重组多肽 , 亦可识别溃疡病菌 PthA天然
蛋白 , 获得的抗血清可以用于柑橘溃疡病的检测。利用抗血清与溃疡病菌混合接种离体冰糖橙叶片 , 发现
抗血清能推迟溃疡病菌的致病过程 , 且病斑比对照小 , 但未能达到抗病程度。pthA基因末端核定位信号序
列的克隆、原核表达及抗血清的制备为进一步研究 pthA的致病机理和研发溃疡病快速分子检测技术奠定了
基础。
关键词 : 柑橘 ; 溃疡病 ; pthA ; 抗血清 ; 病害抑制
中图分类号 : S 666　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0620811208
Prepara tion of An tiserum of the Recom b inan t pthA 2NL S and Its Inh ib ition
Effect on C itrus Canker D isea se
HU Chun2hua, XU Lei, MA Xian2feng, LONG Gui2you, L IU Kun2yu, and DENG Zi2niu3
( Horticu lture and Landscape College, Hunan A gricu ltura l U niversity, N a tional Cen ter of C itrus Im provem ent, Changsha Subcenter,
Changsha 410128, China)
Abstract: The sequence encoding three nuclear localizing signals (NLSs) at the C2term inal of pthA , was
amp lified by PCR from the p lasm id of X anthom onas axonopod is pv. citri. and cloned into PET32a ( + ) vec2
tor. The recombinant p lasm id named p thA2NLS was identified by restriction digestion and sequence analysis.
The sequence of the cloned NLSs had 9919% of sim ilarity with that of pthA in GenBank. The recombinant fu2
sion p rotein was exp ressed in E1coli BL21 (DE3) and analyzed by 12% SDS2PAGE. A 48 kD of recombinant
fusion p rotein was purified with N i2 + 2NTA resin. The antiserum was obtained by immunizing Balb / c mouse
with the purified recombinant p rotein and then identified by W estern blotting and EL ISA analysis. The result
demonstrated that the antiserum could specifically bind to the recombinant p rotein and the PthA from X. axo2
nopod is pv. citri, as well as to partially inhibit the disease development. The successful cloning, exp ression
and the p reparation of p thA2NLS specific mouse antiserum offered the ways for better understanding the patho2
genesis of pthA and the development of a rap id method for molecular detection of citrus canker.
Key words: C itrus; bacterial canker disease; pthA ; antiserum; disease inhibition
柑橘溃疡病 ( citrus bacterial canker disease) 是国内外检疫性病害 , 严重影响了柑橘产业的发展。
病原基因 pthA是柑橘溃疡病亚洲型 (A型 ) 致病所必需的因子 ( Yang & Gabriel, 1995) , 位于柑橘
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溃疡病病原菌 (X anthom onas axonopod is pv. citri) 大质粒上 , Swarup等 (1992) 克隆到该基因。 pthA
基因全长 4 275 bp, 编码 1 163个氨基酸 , DNA全长 97%与 avr6和 avrB s3同源 ( Yang et al. , 1994) ,
具有 1715个 102 bp单元的重复序列 , 每个单元编码 34个氨基酸 , 它们富含亮基酸 , 可能意味着蛋
白质与蛋白质或蛋白质与 DNA 的相互作用 , 研究表明重复区与致病功能密切相关 ( Zhu et al. ,
1999)。重复区后有一个亮氨酸拉链结构、3个核定位信号 ( nuclear location sigals, NLSs) 序列和碳
末端酸性转录激活保守区 , 其中 3个核定位信号区是 pthA 的重要功能区 , 位于 pthA 基因的 1 020～
1 024 ( K2R2A2K2P, NLSA )、1 065～1 069 ( R2K2R2S2R, NLSB ) 和 1 101～1 106 ( R2V2K2R2P2R,
NLSC) 3个位点上 , 在寄主细胞内起识别定位的作用 ( Yang et al. , 1995)。定点突变核定位信号区
序列降低了 pthA在洋葱细胞核内的定位功能 , 并减轻了柑橘溃疡病的症状 , 突变所有的 3个核定位
信号区序列 , 则不能诱发柑橘溃疡病 , 但对非寄主植物马铃薯能诱发病症 ( Gabriel, 1996)。
本研究将 pthA基因的 NLSs序列克隆到原核表达载体并诱导表达重组多肽 , 以重组多肽为抗原免
疫小鼠制备该多肽的抗血清 , 分析了抗血清对柑橘溃疡病发病的抑制作用 , 从而为进一步研究柑橘溃
疡病的分子病理学和 pthA的致病机理 , 以及研发柑橘溃疡病快速分子检测技术奠定基础。
1　材料与方法
111　植物材料及病原菌的分离、培养和鉴定
从湖南省南岳产区的哈姆林甜橙上采集具有典型柑橘溃疡病症状的病叶 , 采用培养皿稀释分离法
从柑橘溃疡病病叶上分离病原菌。
将病叶用自来水冲洗 , 病健交界处用灭菌刀片切取约 4 mm见方的叶块 , 70%乙醇消毒 7～10 s,
用灭菌水清洗 3次。取灭菌培养皿 3个 , 每个皿中加无菌水 015 mL, 将消毒后的叶块放入 1号培养
皿的水滴中 , 用灭菌的玻璃棒将叶块研碎 , 静置 10～15 m in, 使组织中的细菌充分流入水中 , 配成悬
浮液 , 然后用灭菌的移植环从第 1个培养皿中移植 3环悬浮液到第 2个培养皿中 , 将悬浮液与无菌水
充分混合后 , 再移植 3环到第 3个培养皿中。将分离培养基冷却至 45 ℃左右 , 倒入 3个培养皿中 ,
混匀。冷却凝固后 , 将培养皿翻转 , 放置 28 ℃的恒温箱中培养 3～4 d。
挑单个菌落进行 PCR和接种鉴定 , 鉴定方法参照王中康等 (2004) 及李云锋和李祥 (2000) 的
方法进行。
鉴定后将纯化病菌保存于 - 70 ℃。
112　核定位信号 ( NL Ss) 序列的扩增、克隆和测序
根据 pthA基因 (U28802) 和溃疡病病菌大质粒 (AE008925) 序列设计了 pthA核定位信号序列
的特异性引物 : p1: 5′2cggaattcatggttgcccagttatctcgccctga23′和 p2: 5′2gcctcgagcaaccatgcgagctcctcttcgttga23′。
上游引物引入起始密码子和 EcoRⅠ酶切位点 , 下游引物引入 X hoⅠ酶切位点并加保护性碱基 , 引物
由上海生工生物工程技术公司合成。
采用微量质粒提取试剂盒 ( Promega公司 ) 提取溃疡病病菌质粒 , 以此质粒 DNA作模板 , 用上
述特异引物进行 PCR扩增。PCR反应条件为 : 94 ℃ 4 m in, 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 115 m in,
35个循环 , 最后 72 ℃延伸 10 m in。PCR产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳 , 将特异性 PCR扩增产物用
Q iaquick Gel Extraction Ket DNA凝胶回收试剂盒 (Q iagen公司 ) 回收纯化。将回收片段亚克隆到中间
载体 PGEM 2T easy载体 ( Promega公司产品 ) , 挑取阳性克隆 , 提取质粒交上海生工生物工程技术公
司测序。鉴定为正确序列后 , 用 EcoR Ⅰ和 X hoⅠ双酶切克隆质粒 , 回收酶切目的片段 , 再克隆到
PET32a ( + ) 的 EcoRⅠ和 X hoⅠ位点之间 , 将重组质粒转入大肠杆菌 BL21 (DE3) 感受态细胞。
113　重组多肽的诱导表达
挑取含有重组质粒的单克隆细菌 , 接种于 LB培养基放置 37 ℃摇床过夜培养 , 将 5 %的菌液转
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　6期 胡春华等 : 柑橘溃疡病致病基因 pthA核定位信号肽抗血清的制备及其抑菌研究 　
接到新鲜 LB培养基继续培养 , 当菌液 OD值达 016～018时 , 加入 1 mmol·L - 1 (最终浓度 ) IPTG继
续培养 , 每小时取样 1次 , 共 5次 ; 诱导细菌经超声破壁后离心 , 收集上清液 , 在 12 %的 SDS2PAGE
上电泳分离重组多肽。
114　重组多肽的纯化
用 N i2 + 2NTA纯化系统试剂盒 (Novagen公司 ) 纯化重组多肽。将上样缓冲液收集细胞后反复冻
融裂解 , 3 000 ×g离心 15 m in, 保存上清液。用 6 mL的上样缓冲液平衡 N i2 + 2NTA柱后 , 取 8 mL细
胞裂解液上柱 , 结合 60 m in后 , 用 8 mL洗涤缓冲液洗柱 4次 , 最后每次用 1 mL洗脱缓冲液洗脱重
组多肽共 8次 , 分别保留上样液、流出液和洗脱液。通过超滤浓缩洗脱液并将缓冲液更换为 PBS, 经
无菌滤器过滤除菌后 , 液氮保存。测定总蛋白量 , 并用 SDS2PAGE检测纯化的效果。
115　鼠抗 PthA2NL S血清的制备
取 8周龄 Balb / c小白鼠 10只 , 以 115 mg·mL - 1的纯化重组多肽加等量的弗氏完全佐剂乳化 , 分
多点小鼠皮下注射 , 总量为 015 mL。3周后进行第 2次免疫 , 剂量相同 , 抗原改为弗氏不完全佐剂加
融合多肽。3周后再进行第 3次免疫 , 抗原剂量、免疫方法均同第 2次。10 d后 , 断尾取血一滴 , 测
抗体效价。
116　抗血清的效价测定
间接 EL ISA法检测 : 用 410μg·mL - 1的 PthA2NLS重组多肽包被酶标板 , 一抗为鼠血清 , 按
1∶100、1∶1 000、1∶10 000和 1∶100 000稀释浓度 , 以同样稀释浓度的正常小鼠血清为阴性对照。用
PBS稀释的 50 g·L - 1的脱脂奶粉 4 ℃封闭过夜 , 依次加入系列稀释的鼠抗血清 (37 ℃温育 1 h、洗
涤 ) 及 1∶10 000 HRP标记的羊抗兔 IgG (温育及洗涤同上 )。TMB (四甲基联苯胺 ) 显色后于波长
450 nm处用 EL ISA读数仪测各孔 OD值。
抗血清特异性 W estern blotting检测 : 取诱导表达后的重组菌液和溃疡病菌液 , 加入等体积的 2 ×
蛋白上样缓冲液 , 沸水煮 10 m in后 , 进行 SDS2PAGE电泳 , 半干法将蛋白转移至硝酸纤维素膜 , 将
膜置 4 ℃封闭过夜 , 洗膜后 , 将 1∶1 000倍稀释的鼠特异性血清作为一抗 , 以同样稀释的正常小鼠血
清为阴性对照 , 37 ℃杂交 1 h, 再次洗膜 , 与 1∶1 000倍稀释的二抗 (碱性磷酸酶标记的羊抗鼠 IgG)
于 37 ℃杂交 1 h, 再次洗膜 , 用 BC IP /NBT显色试剂盒显色。
117　抗血清对病原菌生长和柑橘溃疡病发病的抑制作用的测试
取纯化的柑橘溃疡病病菌进行培养 , 固体培养基为 GY2agar培养基 (酵母浸膏 5 g, 蛋白胨 10 g,
蔗糖 10 g, 琼脂 15 g, K2 HPO4 5 g, 加水定容到 1 000 mL, pH 710) , 液体培养基为 LB培养基。先用
LB液体培养基于 28 ℃摇床上以 200 r·m in - 1振荡培养至菌液 OD值为 016左右 , 将菌液浓度调到 110
×107 cfu·mL - 1备用。
每一平皿取 50μL菌液涂布 , 将获得的抗血清按 1∶50、1∶100、1∶200稀释 , 以同样稀释浓度的
正常小鼠血清和清水为阴性对照 , 用 1 cm2的灭菌滤纸充分吸取经以上处理的抗血清 , 贴在涂布平皿
表面 , 置于 28 ℃培养 , 观察细菌生长情况。
取已达到正常大小叶面积的感病品种冰糖橙嫩叶 , 用 75 %酒精表面消毒 , 无菌水冲洗干净后用
灭菌滤纸吸干表面水分 , 在主脉两边平行各刺 10个针孔。取浓度为 110 ×107 cfu·mL - 1菌液 , 与稀
释浓度为 1∶50、1∶100、1∶200的抗血清分别等体积混合 , 以同样稀释浓度的等体积正常小鼠血清与
菌液混合为对照 , 在叶的主脉一边接种混有抗血清的菌液 , 另一边只接种相应对照菌液。
每孔接种 115μL, 每一处理接种 2片叶 , 接种后的叶片放置在用两层吸水纸保湿的培养皿内 , 于
28 ℃下培养。接种后第 3天起 , 每天检查一次发病情况 , 以是否产生可见小病斑为依据统计发病率。
接种试验重复 3次。
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2　结果与分析
211　致病基因 p thA核定位信号序列的 PCR扩增
以柑橘溃疡病菌的质粒 DNA为模板 , 通过优
化 PCR反应条件 , 用 NLSs的特异性引物 p1和 p2
扩增出一条约 820 bp的特异性条带 , 与引物设计
的片段大小基本吻合 (图 1)。
212　p thA 2NL S片段的克隆与测序
PCR扩增产物从胶上切割纯化后 , 克隆到
PGEM 2T easy质粒 , PCR检测为阳性克隆的重组
质粒 , 经 EcoRⅠ和 XhoⅠ双酶切证明所连接的片
段与目的基因片段大小接近 (图 3)。测序结果表
图 1　 pthA 2NL S的 PCR产物电泳图
M: 100 bp DNA分子量标记 ; 1 - 5: pthA 2NLS的 PCR结果。
F ig. 1　Am plif ica tion of the pthA 2NL S w ith the spec if ic pr im ers
M: 100 bp DNA marker;
1 - 5: PCR p roducts of pthA 2NLS from 5 repeats.
明 , 扩增片段为 819 bp, 与引物设计的片段长度完全一致 , 序列比对发现其与 GenBank中的 pthA基
因序列 (U28802) 仅在第 3个核定位信号区 (1 101～1 106) 前面的第 1个氨基酸存在差异 , pthA 2
NLS为 cgg, 编码氨基酸 R, GenBank中的 pthA为 tgg, 编码氨基酸 W。试验结果表明扩增得到的片段
是柑橘溃疡病菌致病基因 pthA的 C端序列。包含 3个核定位信号区 (图 2) : 1 020～1 024 ( K2R2A2K2
P, NLSA )、1 065～1 069 (R2K2R2S2R, NLSB ) 和 1 101～1 106 (R2V2K2R2P2R, NLSC)。
图 2　pthA 2NL S的 D NA测序结果及其对应的氨基酸序列
下划线核苷酸和氨基酸序列为 pthA 2NLS的特征序列。
F ig. 2　The nucleotide sequences and puta tive am ino ac id sequences of pthA 2NL S
The underlined nucleotides and am ino acids were the sequences specific to pthA 2NLS.
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随后 , 将此基因片段克隆到原核表达载体 PET32a ( + ) 的多克隆位点 EcoRⅠ和 X hoⅠ限制性酶
切位点之间 , 得到了重组质粒。经 EcoRⅠ和 XhoⅠ双酶切和 PCR鉴定 , 目的基因片段已插入原核表
达载体中 (图 4) , 重组质粒定名为 p thA2NLS。测序结果表明 , 目的基因片段插入方向和位点完全正
确 (结果未列出 )。
图 3　重组质粒 PGEM 2pthA2NL S酶切鉴定
M: DNA分子量标记 ; 1: 重组质粒 PGEM2p thA2NLS/EcoRⅠ
+ X hoⅠ酶切 ; 2: PGEM2T easy质粒。
F ig. 3　Restr iction ana lysis of recom b inan t pla sm id
M: Molecular marker; 1: PGEM2p thA2NLS/EcoRⅠ
+ XhoⅠ; 2: PGEM2T easy p lasm id. 图 4　重组质粒 pthA2NL S酶切鉴定M: DNA分子量标记 ; 1: 质粒 p thA2NLS/EcoRⅠ + XhoⅠ酶切 ;2: 质粒 p thA2NLS/EcoRⅠ酶切 ; 3: 质粒 p thA2NLS PCR鉴定。F ig. 4　Restr iction ana lysis of recom b inan t pla sm idM: Molecular marker; 1: p thA2NLS/EcoRⅠ + XhoⅠ;2: p thA2NLS/EcoRⅠ; 3: PCR amp lification recombinant p lasm id.
213　重组 PthA2NL S多肽的原核表达及其纯化
将重组质粒 p thA2NLS转入大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞 , 经 IPTG诱导表达 , 表达产物经 SDS2
PAGE电泳 (积层胶浓度为 5% , 分离胶浓度为 12% ) , 考马斯亮蓝染色结果显示 , 在 48 kD处出现一
条特异性条带 , 与预期分子量相同 , 证明表达产物正确 (图 5)。1 mmol·L - 1的 IPTG诱导 1 h即可
获得最佳表达量 , 且为可溶性重组多肽 , 占总蛋白的 17%。经 N i2 + 2NTA 亲和层析柱纯化后 , 获得了
纯度较高的重组多肽 (图 5)。
图 5　 PthA2NL S表达及其纯化后多肽的 SD S2PAGE电泳图
M: 蛋白质分子量标记 ; 1: pET32a ( + ) ; 2～6: PthA2NLS的诱导表达 ; 7: 纯化后的融合多肽。
F ig. 5　Expression of PthA2NL S fused polypeptide in BL21 and the pur if ied product of the fused polypeptide
M: Protein marker; 1: PET32a ( + ) ; 2 - 6: PthA2NLS fused p roduct in BL21; 7: Purified polypep tide.
214　鼠抗 PthA2NL S血清的制备与特异性鉴定
以纯化的重组多肽免疫小鼠 , 获得了 10只小鼠的抗血清。用 EL ISA测定血清中的滴度 , 抗体在
血清稀释 104 ～105倍时均可测出 ; 初步筛选出 5只滴度较高的小鼠抗血清用于进一步的单克隆抗体制
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备 ; 将其中滴度最高的 3号小鼠抗血清对从湖南省各地区分离得到的 20个柑橘溃疡病菌样品进行
EL ISA检测 , 均表现为阳性 (图 6)。表明获得的抗血清可以用于柑橘溃疡病的快速检测。
图 6　用抗血清对柑橘溃疡病菌进行 EL ISA法检测
A, C: 样品 1～20用抗血清检测 ; B , D: 样品 1～20用对照血清作对照。
F ig. 6　D etection of X. axonopodis pv. citri by EL ISA w ith the pur if ied an tiserum
A, C: Antiserum of mouse reacted with X. axonopodis pv. citri; B , D: Pre2immune
of mouse reacted with X. axonopodis pv. citri.
W estern blotting分析表明 , 免疫后得到的滴度较高的 5只小鼠抗血清与经过 IPTG诱导的重组菌
裂解蛋白在 48 kD处出现一条特异性杂交条带 , 而正常血清与重组菌裂解蛋白无结合信号 , 证实所获
得的抗体是 PthA2NLS特异性抗体。同时抗血清能与溃疡病菌裂解蛋白中的 PthA蛋白良好地结合 (图
7) , 说明用纯化的融合多肽制备的抗血清对 PthA蛋白具有较高的特异性。
图 7　W estern blotting检测抗血清的特异性
1～5: 重组蛋白检测 5只免疫小鼠抗血清 ; 6: 重组蛋白与免疫前小鼠血清反应 ;
7～11: 天然蛋白检测 5只免疫小鼠抗血清 ; 12: 天然蛋白与免疫前小鼠血清反应。
F ig. 7　Spec if ic ity of the an tiserum tested by W estern blotting
1 - 5: Antiserum of mouse (1 - 5 dilution 1∶1 000) reacted with recombinant p rotein; 6: Before immune of mouse
reacted with recombinant p rotein lane; 7 - 11: Antiserum of mouse (7 - 11 dilution ∶1 000)
reacted with natural antibody; 12: Before immune of mouse reacted with natural antibody.
215　抗血清对柑橘溃疡病病菌生长和病害发生的抑制效果
以不同浓度的抗血清进行平皿抑菌试验 , 病菌在 3 d左右均长满了平板 , 没有抑菌圈产生 , 表明
抗血清对 GY2agar平板上培养的溃疡病病原菌没有抑菌作用。
用易感病品种冰糖橙叶片进行离体接种试验 , 针刺接种每个处理各 60个针刺孔。对照接种点
(图 8中叶片标有 “ - ”一侧 ) 在 3 d后即在针刺孔周围出现典型的油浸状病斑 , 到 10 d后叶背面逐
渐形成凸起的火山口状的病斑 , 表现出溃疡病的典型病状 , 感病率 100 %。用含有抗血清的病原菌接
种有针刺孔的叶片 (图 8中叶片标有 “ + ”一侧 ) , 7 d后才出现不太清晰的小病斑 , 15 d后表现出
溃疡病的典型病状 , 但病斑明显小于对照 , 发病率也达到 100 %。3次重复结果一致。可以看出 , 抗
血清可延迟接种溃疡病病原菌的冰糖橙离体叶片的发病进程 , 但不能完全抑制溃疡病的发生。
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图 8　抗血清针刺离体接种抑制发病效应的试验
A: 含 1∶100稀释浓度抗体的病菌接种 ; B: 含 1∶200稀释浓度抗体的病菌接种 ;
“ + ”: 含有抗血清的病菌接种 ; “ - ”: 含对照血清病菌接种。
F ig. 8　In vitro tested effects of the an tisrum on the developm en t of c itrus canker d isea se
A: 1∶100 dilution of anti2serum of mouse; B: 1∶200 dilution of anti2serum of mouse;
“ + ”: Anti2serum of mouse m ixed with X. axonopodis pv. citri;
“ - ”: Pre2immune serum m ixed with X. axonopodis pv. citri.
3　讨论
柑橘溃疡病是由地毯黄单孢杆菌柑橘致病变种 X. axonopod is pv. citri引起的一种检疫性病害 , 建
立快速准确的检测技术对柑橘溃疡病的检疫检验和病害流行学的研究具有重要意义。PCR和 EL ISA
等方法已广泛用于该病害的检测与诊断。
目前 , 对柑橘溃疡病菌 PCR检测的引物设计主要基于质粒 DNA序列及 16S rDNA与 23S rDNA之
间的内转录间隔区序列 , Hartung等 (1993) 基于质粒设计的引物能扩增 A菌系及柑橘溃疡病菌的两
个近缘种 , 不能扩增 B /C /D和 E菌系。Cubero & Graham (2002) 根据柑橘溃疡病菌质粒 pthA 基因
设计的引物其优点在于不仅可以检测出 A, C及大多数 B 菌系 , 而且可以检测出 AW类群 , 但由于
pthA基因与黄单胞杆菌属的多个致病变种的无毒基因家族 DNA序列高度同源 , 因此检测的特异性欠
佳。王中康等 (2004) 根据基因组中的保守蛋白设计的引物 JYF5 /JYR5能特异性扩增出柑橘溃疡病
菌的目的 DNA带 , 但是根癌农杆菌经引物 JYF5 /JYR5能扩增出与柑橘溃疡病菌的目的 DNA大小相
近的片段 , 肉眼观察电泳结果时很难辨别 , 容易作出错误的判断 (罗志萍和洪霓 , 2006)。
本试验根据 pthA基因设计的引物 p1和 p2, 能从湖南各柑橘产区分离的柑橘溃疡病菌分离物中非
常稳定地扩增出 pthA基因的 NLSs目的片段 , 如再结合王中康等 ( 2004) 所设计的引物 JYF5 /JYR5,
利用 PCR技术从质粒和基因组两方面对柑橘溃疡病进行鉴定 , 其结果将更加快速准确可靠。另外 ,
获得的 NLS多肽的抗血清能与柑橘溃疡病菌特异性结合 , 利用抗血清通过 EL ISA法可快速鉴定柑橘
溃疡病病原菌 , 为柑橘溃疡病分子鉴定开辟一条新的途径。
pthA在病原菌致病过程中起着重要作用 , 将 pthA导入非致病的黄单胞杆菌内 , 能引起其在柑橘
上致病 ; 将其导入对柑橘非致病菌 X. phaseoli和 X. cam pestris, 重组菌对柑橘仍不致病 , 但能引起它
们各自的特异宿主 (大豆、棉花 ) 的超敏反应 (HR) ( Yang et al. , 1996)。pthA基因作为 avr/ pth基
因家族成员之一 , 具有能在抗性寄主上引起 HR, 在感病寄主上加重水渍状症状或引起溃疡状 . 肿瘤
状毒性症状等共同特点。
它们与宿主作用的过程可能是 : 首先致病蛋白 PthA通过细菌的 Ⅲ型泌出通道被注入植物细胞内 ,
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NLSs与宿主细胞中的内输协助因子 ( importinα) 特异性互作 , 而后与 importinβ一起使 PthA蛋白进
入细胞核 ; 进入核内的 PthA调节寄主转录作用 , 并通过依赖 NLSs的识别作用激活寄主细胞的 HR反
应 ( Yang et al. , 1996)。
目前获得的抗血清不能抑制病原菌的生长 , 是因为该抗血清是以致病基因核定位信号序列表达的
融合蛋白免疫获得 , 因而不具备抑菌功能 , 只对致病过程产生影响 , 这也初步印证了前人推断的柑橘
溃疡病致病机理。
本试验中 , 抗血清能延迟离体叶片发病进程 , 减轻病情 , 可能是通过与病菌侵染过程中产生的
NLSs发生竞争性结合 , 使宿主细胞中的 importinα不能较好与 NLSs结合所致。但是 , 由于本研究所
用抗血清是多克隆的 , 因而不能较好地结合核定位信号 ; 同时 , 抗体位于宿主细胞质中时才能发挥其
最佳效应 , 而离体接种时抗血清与致病蛋白难以充分结合。因此 , 抗血清不能完全抑制离体叶片发
病 , 只能延迟感病速度 , 减轻感病程度。
本实验室将以抗血清滴度高的第 3只小鼠制备单克隆抗体 , 筛选出高滴度的单克隆抗体进行进一
步的抑制发病试验 , 并拟分离出抗体基因的重链可变区和轻链可变区 , 构建单链抗体基因 (S cFv)
并将其导入柑橘 , 以便更好地探讨溃疡病的致病分子机理。
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