全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (1) : 84～88
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 04 - 06; 修回日期 : 2005 - 06 - 17
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30100117) ; 山东省自然科学基金资助项目 ( Y2000D05)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xdongli@ sdau1edu1cn)
潍坊萝卜中芜菁花叶病毒分离物的分子特性及 CP
基因的表达
刘金亮　于晓庆　田延平　都　杰　竺晓平　李向东 3 　严敦余
(山东农业大学植物保护学院 , 泰安 271018)
摘 　要 : 从表现红心病的潍坊萝卜块根上得到一芜菁花叶病毒 ( Turnip m osa ic virus, TuMV ) 分离物
( TuMV2Ra) , 通过 RT2PCR获得了该分离物的外壳蛋白 (CP) 基因 , 对其进行了序列测定 , 并将其核苷酸
序列及推导出的氨基酸序列与 GenBank中登录的其它 20个 TuMV萝卜分离物的相应序列进行比较和分析。
结果表明 , TuMV2Ra与这 20个分离物 CP基因核苷酸序列的同源性为 8919% ～9910% , CP氨基酸序列同
源性为 9418% ～9917% ; 其中与中国浙江杭州萝卜的两个分离物 HZLB1、HZLB2同源性最高 , 核苷酸序列
的同源性为 9817%和 9910% , 氨基酸序列同源性为 9910%和 9917%。TuMV2Ra与 1999年从表现相同症状
的潍坊萝卜得到的分离物 CH INA2W F CP基因核苷酸同源性为 93166% , 氨基酸同源性为 96153% , 说明病
毒发生了比较大的变异 , 而且变异的位点主要在 CP的 N末端。将 TuMV2Ra CP基因克隆到原核表达载体
pET222b ( + ) , 在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中表达出分子量为 38 kD的融合蛋白。W estern blotting分析证明
TuMV2Ra CP在大肠杆菌中得到了正确表达。
关键词 : 芜菁花叶病毒 ; 萝卜 ; CP基因 ; 分子特性 ; 基因表达
中图分类号 : S 63113　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0120084205
M olecular Character iza tion and Coa t Prote in Gene Expression of a Tu rn ip
m osa ic virus Isola te from Rad ish in W e ifang
L iu J inliang, Yu Xiaoqing, Tian Yanp ing, Du J ie, Zhu Xiaop ing, L i Xiangdong3 , and Yan Dunyu
(College of P lan t P rotection, Shandong A gricu ltura l U niversity, Ta ipian 271018, China)
Abstract: A Turn ip m osa ic virus ( TuMV ) isolate ( TuMV2Ra) was obtained from the radish root with
symp tom of red flesh in W eifang. The coat p rotein (CP) gene of TuMV2Ra was amp lified by RT2PCR and its
comp lete nucleotide sequence was determ ined. Homologies of the nucleotide and deduced am ino acid se2
quences were compared between the CP region of TuMV2Ra and those of 20 TuMV radish isolates in Gen2
Bank. TuMV2Ra shared identities of 8919% - 9910% and 9418% - 9917% with these 20 radish isolates in
nucleotide and corresponding am ino acid sequences. It had highest homologies with two isolates from Hang2
zhou, HZLB1 and HZLB2, which amounted to 9817% and 9910% at nucleotide level and 9910% and
9917% at am ino acid level. The nucleotide and am ino acid sequences sim ilarities between TuMV2Ra and
CH INA2W F (obtained from the red flesh radish ofW eifang in 1999) were 93166% and 96153% respectively.
Most of the mutations occurred at the N term inus of CP. The CP gene of TuMV2Ra was cloned into exp ression
vector pET22b ( + ) , transferred into E. coli BL21 (DE3) and exp ressed as a 38 kD fusion p rotein when
induced with IPTG. The result of western blotting assay showed that TuMV2Ra CP gene had been correctly ex2
p ressed.
Key words: Turn ip m osa ic virus; Radish; CP gene; Molecular characterization; Gene exp ression
芜菁花叶病毒 ( Turn ip m osa ic virus, TuMV ) 寄主范围广泛 , 可侵染 43科 156属的 300多种植物 ,
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　1期 刘金亮等 : 潍坊萝卜中芜菁花叶病毒分离物的分子特性及 CP基因的表达 　
目前已成为世界范围内危害蔬菜最严重的 5种病毒之一 , 尤其是对十字花科蔬菜生产造成了严重的威
胁〔1～4〕。
TuMV属于马铃薯 Y病毒属 ( Potyvirus) , 能够由至少 89种蚜虫以非持久方式传播〔5〕。病毒粒子
弯曲线状 , 其基因组为正单链 RNA, 约 10 000个核苷酸 , 表达时首先翻译成多聚蛋白 , 然后在病毒
编码的蛋白酶作用下加工形成各种功能蛋白。其中外壳蛋白 ( coat p rotein, CP) 核苷酸序列比较保
守 , 也是 TuMV基因组最富有特征的区域。常用 CP氨基酸的序列来作为 TuMV不同株系的鉴定标
准〔6〕。近年来 , TuMV的分子进化及其致病机理成为研究的热点领域〔3, 5, 7～9〕。
潍坊萝卜是有名的土特产 , 前几年深受红心病的危害。作者于 1999年从潍坊红心病萝卜上得
到 1个病毒分离物 , 经过生物学和血清学检测以及分子生物学鉴定 , 证明该分离物是芜菁花叶病
毒〔10〕, 初步推测红心病症状的形成可能是该病毒和潍坊萝卜长期共同进化的结果。为了更进一步
了解 TuMV在潍坊萝卜上的变异情况 , 2004年从红心病潍坊萝卜上得到 1个 TuMV分离物 , 并获
得其 CP基因 , 对其进行了序列测定和分析 , 还构建了其表达载体 , 使其在大肠杆菌中得到正确表
达。
1　材料与方法
111　材料
发病萝卜样品采自潍坊市潍城区 , 表现红心病症状 , 经 EL ISA检测携带 TuMV, 暂命名为萝卜分
离物 ( TuMV2Ra) ; 大肠杆菌 DH5a、原核表达载体 pET222b ( + )、大肠杆菌 BL21 (DE3) 均由本实
验室提供 ; RNA2solv Reagent购自 Omega公司 , 硝酸纤维素膜为 Pall Gelman公司产品 , 碱性磷酸酯酶
标记的 A蛋白购自 Sigma公司。
112　RT2PCR扩增目的基因
根据 Kong等〔11〕的序列设计 1对引物 , 其中 5pi2端引物为 GCG GAT CCA ATC TTC GAA GAT TAC
GAA GA (下划线为 B am HⅠ酶切序列 ) , 与位于复制酶 (N Ib) 基因内的 305～325位碱基序列一致 ;
3pi2端引物为 : A GT CGA CCC TTG CTT CCT ATC AAA TG (下划线为 Sa lⅠ的酶切序列 ) , 与 1 426～
1 408位非编码区最末端碱基反向互补。
按 RNA2solv Reagent试剂盒说明书从萝卜块根上直接提取其总 RNA。称 015 g萝卜病根研磨 , 加
1 mL RNA2solv Reagent, 剧烈震荡 , 放置 10 m in, 12 000 r/m in离心 10 m in。取上清 , 加 200μL氯
仿 , 剧烈震荡 15 s, 冰上放置 10 m in, 12 000 r/m in离心 15 m in。取上层水相加 500μL异丙醇和 500
μL 018 mol/L柠檬酸三钠与 112 mol/L氯化钠混合溶液 , 置室温 10 m in, 12 000 r/m in离心 10 m in。
加 80%乙醇洗涤沉淀 , 7 500 r/m in离心 5 m in。空气中干燥 , 加无 RNAase的水溶解 RNA, - 70℃保
存。按参考文献 〔10〕的方法进行 TuMV2Ra CP基因扩增。
113　PCR产物的克隆
PCR产物回收后与 pMD182T ( TaKaRa公司产品 ) 连接 , 连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态细
胞 , 提取质粒 , 经 PCR及酶切鉴定筛选重组质粒 , 重组质粒序列测定由上海生工公司完成。
114　D NA序列比较与分析
采用 DNAMAN 5102软件对 TuMV2Ra CP核苷酸序列和推导的氨基酸序列与 GenBank中收录的其
它 20个 TuMV萝卜分离物的相应序列进行比较和分析。
115　TuM V2Ra C P基因的原核表达
11511　原核表达载体的构建 　含有 TuMV2Ra CP基因重组质粒经 B am HⅠ和 Sa lⅠ双酶切 , 琼脂糖凝
胶电泳回收目的片段 , 并与同样经 B am HⅠ和 Sa lⅠ酶切的 pET222b ( + ) 连接 , 转化大肠杆菌 BL21
(DE3)。将菌液涂到含氨苄青霉素 (Amp ) 的 LB固体培养基上 , 于 37℃培养 12～16 h。挑取单菌
落 , 置于含 Amp的 LB培养基中振荡培养 12～16 h。碱法小量提取质粒 DNA , 对有外源片段插入的
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质粒用 B am HⅠ和 Sa lⅠ双酶切 , 鉴定插入片段的大小是否正确。
11512　TuMV2Ra CP基因的诱导表达 　按参考文献 〔12〕和 〔13〕的方法 , 取含有 TuMV2Ra CP表
达载体的 BL21细胞 , 置于含有 Amp的 LB培养基中 , 37℃活化过夜。将活化过夜的 BL21菌液按 1∶
100转入含有 Amp的 LB培养基中 , 在通气良好条件下继续培养到对数生长中期 (OD600 = 016)。加
入 IPTG至终浓度为 014 mmol/ L , 在 37℃、220 r/m in下培养 4 h。将培养好的菌体置于冰上 5 m in,
然后 4℃, 5 000 r/m in离心 5 m in, 收集菌体备用。
11513　SDS2PAGE及 W estern blotting分析 　将诱导表达的 BL21菌体悬浮在 1 /20培养体积的 10
mmol/L Tris2Cl (pH 810) 中 , 加入等体积的 2倍 SDS样品缓冲液 , 沸水煮 5 m in。样品用 5%的浓缩
胶、12%的分离胶进行 SDS2PAGE, 以转化未重组 pET222b ( + ) 的 BL21作对照。电泳结束后用 5
倍体积的考马斯亮蓝 R250染色 4 h, 在脱色摇床上脱色至背景清晰。将表达的融合蛋白进行 W estern
blotting鉴定分析。
2　结果与分析
211　TuM V2Ra C P基因的扩增及克隆
以表现红心病萝卜块根总 RNA为模板 , 经反转录及 PCR扩增 , 得到了长度约为 111 kb的目的片
段。扩增产物经纯化后克隆到 pMD182T载体上。经蓝白斑筛选和酶切鉴定 , 得到了含有插入片段的
重组子 pTuRa CP。
212　TuM V2Ra C P基因序列测定和同源性分析结果
通过分别测定两个 PCR反应克隆到的片段的序列 , 确定了该片段的核苷酸序列 ( GenBank登录
号为 AY941820)。扩增产物长度为 1 121 bp, 其中包含 48 bp N Ib序列、864 bp CP序列及 209 bp非编
码区 (3pi2UTR) 序列。CP基因编码 288个氨基酸 , 其中含有蚜虫传播马铃薯 Y病毒属病毒所必需的
DAG基序。该分离物 CP氨基酸序列与国内外其它 20个 TuMV萝卜分离物的同源性都在 9418%以上 ,
说明该分离物是 TuMV的 1个成员。
图 1　TuM V2Ra与其它 TuM V萝卜分离物 CP核苷酸序列同源性比较
图中文字依次为 GenBank登录号 - 分离物 - 分离地点。
F ig. 1　Phylogenetic ana lysis of nucleotide sequences of
TuM V2Ra and other 20 TuM V rad ish isola tes
Accession number2isolate name2origin of location were listed. 图 2　TuM V2Ra与其它 TuM V萝卜分离物 CP氨基酸序列同源性比较图中文字依次为 GenBank登录号 - 分离物 - 分离地点。F ig. 2　Phylogenetic ana lysis of am ino ac id sequences ofTuM V2Ra and other 20 TuM V rad ish isola tesAccession number2isolate name2origin of location were listed.
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　1期 刘金亮等 : 潍坊萝卜中芜菁花叶病毒分离物的分子特性及 CP基因的表达 　
　　该分离物与 GenBank中收录的其它 20个 TuMV萝卜分离物的相应核苷酸序列同源性比较 , 发现
以同源性 95%为界可把 21个分离物分成两组 (图 1) : 中国山东 3个分离物 , 江西、云南和台湾分离
物以及日本、韩国 R9和 RH分离物为第 1组 ; 其他几个分离物为第 2组。在第 1组中 , 台湾 R分离
物与其它分离物的同源性在 9116% ～9611% ; 在第 2组中 , TuMV2Ra与中国浙江的 HZLB1、HZLB2
同源性最大 , 与两者的同源性分别为 9817%和 9910% , 与其它分离物的同源性为 8919% ～9319%。
TuMV2Ra CP氨基酸序列与 GenBank中收录的上述 20个 TuMV萝卜分离物的 CP氨基酸序列比较
的结果 (图 2) 与核苷酸比较的结果基本一致。所不同的是 , 中国 Radish leaf分离物和韩国 Sowon地
区的 RG分离物各自形成 1个分支 , 二者与其它 20个分离物 CP氨基酸序列同源性分别为 9113% ～
9615%和 9117% ～9619%。另外 , 中国台湾分离物 R氨基酸比较结果和核苷酸比较结果差异也较大。
TuMV2Ra与李向东等〔10〕1999年从潍坊萝卜得到的分离物 (CH INA2W F) 序列差异较大 , 两者核
苷酸和氨基酸同源性分别为 93166%和 96153% , 变异的位点主要发生在 N端。TuMV2Ra与 CH INA2
W F分离物在 CP N端的 10、22、24、25、33、44、45、56、58和 C端的 220等 10个位置发生了改
变 , 分别是 Glu变成 A sp、A rg变成 Lys、Gly变成 A rg、 Ser变成 A la、A rg变成 Lys、Thr变成 A la、
Gln变成 Leu、Val变成 A la、 Ile变成 Thr、Ser变成 Phe。其中 , 有 3个是非解离的极性氨基酸变成疏
水氨基酸 , 1个是疏水氨基酸变成非解离的极性氨基酸 , 其它的都属于同类氨基酸间的突变。
213　TuM V2Ra C P基因的原核表达
3　结论与讨论
本研究中对 TuMV2Ra CP基因进行了克隆和序列测定 , 将所得序列与 GenBank中收录的 20个
TuMV萝卜分离物的相应序列进行比较。结果表明 , 该病毒 CP氨基酸序列与国内外其它 20个 TuMV
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萝卜分离物的同源性都在 9418%以上。将 TuMV2Ra CP基因克隆到原核表达载体 pET222b ( + ) , 在
大肠杆菌 BL21 (DE3) 中表达出了分子量为 38 kD的融合蛋白 ; W estern blotting分析证明 TuMV2Ra
CP在大肠杆菌中得到了正确表达。
TuMV2Ra分离物和其它 20个分离物都是 TuMV萝卜上的分离物 , 但 CP基因核苷酸和氨基酸序
列上存在较大差异。从 21个 TuMV萝卜分离物序列比较结果看 , TuMV CP基因序列并无明显的地域
特异性。
李向东等于 1999年采集到了潍坊萝卜红心病的标本并进行了鉴定 , 证明该病害是由 TuMV引起
的 ; 同时发现从红心萝卜病叶中分离到的 TuMV在其它萝卜品种上并不引起红心症状 , 且泰安 TuMV
分离物在潍坊萝卜上也不引起红心症状 , 推测红心病是 TuMV与潍坊萝卜长期共同进化的结果〔10〕。
TuMV为 RNA病毒 , 其依赖于 RNA的 RNA聚合酶 (RNA2dependent RNA Polymerase, RdRp) 出错率
较高 , 使 TuMV的变异较快 , 这也使病毒能更好地适应寄主。以前生物学和血清学的研究也表明
TuMV是一种高度变异的病毒〔14～16〕。时隔 5年 , 从同一种病害样品中分离得到的分离物 ( TuMV2Ra
和 CH INA2W F) 核苷酸和氨基酸序列发生了较大变化 , 突变的氨基酸多出现在 CP的 N端 , 且多为同
类氨基酸间的突变。现在还不清楚是哪些核苷酸或氨基酸的改变导致了红心症状的形成 , 有必要对
TuMV变异情况及致病机理进行深入研究。
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