全 文 ：园 艺 学 报 2005, 32 (1) : 44～48
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 03 - 18; 修回日期 : 2004 - 08 - 18
基金项目 : 中 - 荷联合园艺作物基因组技术实验室资助项目 (2001CB711102)3 通讯作者 Author for correspondence
马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因候选表达序列的
cDNA2AFL P鉴定
郭 军 1, 2 屈冬玉 13 王晓武 1 金黎平 1 谢开云 1 Rays H. Y. J iang2
Francine Govers2
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2Laboratory of Phytopathology, W ageningen University and Graduate
School of Experimental Plant Sciences, B innenhaven 5, 6709 PD W ageningen, The Netherlands)
摘 要 : 利用具有 6个无毒基因不同表现型且处于萌发中的静孢子时期的马铃薯晚疫病菌构建 4个混
合池 , 通过 cDNA2AFLP分析 , 共获得 85个与无毒基因相关的差异表达片段 , 其中与无毒基因 A vr1、A vr2、
A vr32A vr102A vr11、A vr4相关的差异表达片段分别为 20, 28, 16和 21个。将这些差异表达片段对 20个晚疫
病病菌个体进行无毒基因差异表达验证 , 得到 1个无毒基因连锁群 A vr32A vr102A vr11的候选片段 , 即
A11T13A vr3210211S157; 无毒基因 A vr4的候选片段 2个 , 即 A24T19A vr4S122和 A24T24A vr4S142。B last分析
表明 : A11T13A vr3210211S157与马铃薯晚疫病菌萌发孢子囊 ( germ inating sporangium ) EST ( exp ressed
sequence tag) 库中的序列 PG001F101XT7同源 ; A24T19A vr4S122与晚疫病菌萌发中静孢子 ( germ inating
cyst) EST库中的 PH051G101XT7部分序列完全一致 , 而 A24T24Avr4S142与 PH051G10. XT7具有 98%的
同源性。这些结果将促进通过电子克隆并结合 RACE (Rap id Amp lification of cDNA Ends) 技术获得全长的无
毒基因 A vr4。
关键词 : 马铃薯晚疫病菌 ; 无毒基因 ; cDNA2AFLP
中图分类号 : S 532; S 436132; Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2005) 0120044205
Iden tif ica tion of Cand ida te Expressed Sequences A ssoc ia ted w ith Race2spec if2
ic Av irulence Genes by cD NA2Am plif ied Fragm en t L ength Polym orph ism
Guo Jun1, 2 , Qu Dongyu13 , Wang Xiaowu1 , J in Lip ing1 , Xie Kaiyun1 , Rays H. Y. J iang2 , and Francine Govers2
( 1 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, Ch ina; 2Laboratory of Phytopa2
thology, W agen ingen U niversity and Gradua te School of Experim en tal P lan t Sciences, B innenhaven 5, 6709 PD W agen ingen, The
N etherlands)
Abstract: Through cDNA 2A FLP analysis of Four pools w ith d ifferen t phenotypes of Six aviru lence
genes in germ inating cysts of Phy toph thora infestans, to ta lly 85 cand idate transcrip t derived fragm ents
( TD Fs) were obta ined, including 20 for A vr1 , 28 for A vr2 , 16 for A vr3 2A vr10 2A vr11 , and 21 for A vr4 ,
respective ly. O ne candidate TD F of linkage genes A vr3 2A vr10 2A vr11 (A11 T13A vr3 210 211 S157 ) and two
cand idate TD Fs of A vr4 (A24 T19A vr4 S122 and A24 T24A vr4 S142 ) were iden tified through verification
of exp ression of these TD Fs in 20 P. infestans ind ividuals. The resu lts of B last analysis showed that
A11 T13A vr3 210 211 S157 was homologous w ith EST G001 F101XT7 deposited in the Phy toph thora germ i2
nating sporangium EST library, A24 T19 A vr4 S122 was identical w ith part of EST PH051 G101XT7 de2
posited in the Phy toph thora germ inating cyst EST library while A24 T24A vr4 S142 had 98 % sim ilarity to
EST PH051 G101XT7. That would facilitate c loning of fu ll2length A vr4 gene by in silico cloning along
w ith RACE ( Rap id Amp lifica tion of cDNA Ends) technique.
Key words: Phy toph thora infestans; Race2specific avirulence genes; cDNA2AFLP; Candidate transcrip t
derived fragments
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1期 郭 军等 : 马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因候选表达序列的 cDNA2AFLP鉴定
由致病疫霉 ( Phytoph thora infestans) 引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产中最严重的病害 , 是世界
粮食生产的主要威胁之一〔1〕。过去 10多年来 , 全世界许多植物病理学家着手于致病疫霉病原菌 , 特
别是病菌的致病因子和非致病因子的研究 , 希望通过从病原的角度出发揭示其致病机制和寄主抗性机
制 , 以期为马铃薯晚疫病的防治提供理论基础。病菌的无毒基因 (Avirulence gene, A vr基因 ) 是非
致病因子研究中的热点 , 是病原物中决定对带有互补抗病基因的寄主植物特异的非亲和无毒性基因。
目前荷兰瓦赫宁根大学植物病理实验室正在利用图位克隆法 (map2based cloning) 分离马铃薯晚疫病
菌无毒基因 , 并已取得较大的进展〔2～4〕, 但是在短期内分离和鉴定该基因是非常困难的。
cDNA2AFLP是近年来发展起来的一种重要的转录基因组学研究工具 , 被广泛应用于基因差异表
达的研究〔5, 6〕。利用 cDNA2AFLP, 可以区分病菌各个生长时期和不同病菌生理小种基因表达的异同。
本研究拟利用该技术研究马铃薯晚疫病菌萌发中静孢子时期的 6个无毒基因在转录水平上的表达 , 以
进一步从分子水平了解晚疫病病菌无毒性丧失和垂直抗性机制 , 为克隆病原物无毒基因和揭示植物抗
病的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
111 供试菌株
供试菌株包括亲本 80029 (生理小种 21417;
A1交配型 ) 和 88133 (生理小种 11317110111;
A2交配型 ) 及它们的 18个 F1 代群体 , 由荷兰瓦
赫宁根大学植物病理实验室提供〔2〕。表 1列出了
20个菌株及其 6个无毒基因表现型。
112 BSA ( Bulk Segerega tion Ana lysis) 分析
根据 20个菌株 6个无毒基因表现型构建 4个
混合池 , 每个混合池由具有相同的 6个无毒基因
表现型的不同马铃薯晚疫病菌株构成 , 由于每个
无毒基因在 4个池中的表达形式不同 , 所以可用
来初步确定代表 6个无毒基因的候选表达片段
( Transcrip t derived fragments, TDFs)。4个池的组
成为池 1: re11216, T1521, T3022; 池 2: D1222,
D12223, T3523; 池 3: D12217, T1529; 池 4:
T2022, E1223。
113 RNA提取和双链 cD NA的合成
晚疫病菌株培养〔7〕至萌发中的静孢子时期。
利用 Trizol试剂盒提取总 RNA , cDNA的合成按照
SuperScrip tTM Double2Stranded cDNA Synthesis Kit提
供的方法 , 两种试剂盒均购自 Invitrogen生物技术
公司。
表 1 供试 20个菌株及其 6个无毒基因的表现型
Table 1 The phenotypes of six av irulence genes in 20
Phytoph thora infestans
菌株
编号
No.
供试
菌株
Strains
无毒基因 Avirulence gene
A vr1 Avr2 A vr3 Avr4 A vr10 Avr11
1 80029 AVR avr AVR avr AVR AVR
2 88133 avr AVR avr AVR avr avr
3 D1222 avr AVR avr avr avr avr
4 D1229 AVR AVR AVR AVR AVR AVR
5 D12217 AVR avr AVR avr AVR AVR
6 D12218 AVR avr avr avr avr avr
7 D12221 avr AVR avr AVR avr avr
8 D12223 avr AVR avr avr avr avr
9 re11216 AVR AVR avr AVR avr avr
10 E1223 avr avr AVR AVR AVR AVR
11 T1521 AVR AVR avr AVR avr avr
12 T1522 avr AVR AVR avr AVR AVR
13 T1527 AVR AVR AVR avr AVR AVR
14 T1529 AVR avr AVR avr AVR AVR
15 T2022 avr AVR AVR AVR AVR AVR
16 T3022 AVR AVR avr AVR avr avr
17 T3024 AVR AVR AVR AVR AVR AVR
18 T3523 avr avr avr avr avr avr
19 T3524 avr AVR avr avr avr avr
20 T8023 avr AVR avr AVR AVR avr
注 : AVR表示病菌具有此无毒基因表现型 ; avr表示病菌无
此无毒基因表现型。
Note: Avirulence phenotype is indicated by AVR; V irulence phe2
notype is indicated by avr.
114 cD NA2AFL P差异显示
cDNA2AFLP体系及程序参照 Bachem等〔8〕的方法 , 使用 L icor公司生产的 IR2 DNA Analyzer 5200
型测序仪电泳分析。利用分别含有 2个选择性碱基的荧光标记 Apo I引物和非荧光标记的 Taq I引物 ,
共 256对引物组合进行差异片段的筛选。
115 差异片段回收及克隆测序
由于采用荧光标记引物和 L icor DNA自动测序仪 , 所以差异片段无法回收。将产生差异片段引物
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组合的 PCR选扩产物在 6%的聚丙烯酰胺凝胶上分离 , 通过银染显色〔8〕。用刀片切取差异条带 , 浸
泡在高盐缓冲液中 (20%乙醇 , 1 mol·L - 1 L iCl, 10 mmol·L - 1 Tris) 24 h, 再 65℃水浴 2 h, 然后氯
仿抽提 , 乙醇沉淀后吹干 , DNA溶于 40μL水中。取 5μL用作模板在相同的 PCR条件下重新扩增 ,
程序为 95℃ 5 m in, 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 60 s, 30循环后 72℃ 10m in〔9〕。
扩增产物在 1%的琼脂糖上分离 , 检验差异片段的大小是否正确 , 利用 TAKARA公司 PMD182T
载体克隆差异片段后 , 由上海生工代为测序。
116 BLAST分析
对获得序列利用 BLASTN和 BLASTX程序与网上数据库 (NCB I, National Center for B iotechnology
Information) 进行同源性比较 , 如没有显著同源性 , 再用 BLASTN和 BLASTX程序与 Phytophthora属
EST库 ( Syngenta Phytophthora Consortium, http: / / xgi1ncgr1org/ spc / ) 中的序列进行比较分析。
2 结果与分析
211 马铃薯晚疫病菌无毒基因差异表达片段分析及差异表达片段的验证
通过 256对分别含 2个选择性碱基荧光标记 Apo I引物和非荧光标记 Taq I引物组合对 4个池的筛
选 , 从 4个池中共扩增出大约 30000条清晰可见的条带 , 得到与 6个无毒基因相关的 85条差异表达
片段 ( TDFs) , 其中与 A vr1相关的为 20条 , A vr2 28条 , A vr32A vr102A vr11 16条 , Avr4 21条。初步结
果只能说明这些差异表达片段与 6个无毒基因相关 , 要进一步确认是否为 6个无毒基因的候选片段 ,
需要在 20个病菌个体上逐一进行验证。如果某差异表达片段在 20个病菌个体上的表达形式与这 20
个病菌个体相应的无毒基因表现型完全相符 , 即可初步确定为此片段为这个无毒基因的候选片段。根
据此原则 , 通过验证 , 共得到无毒基因连锁群 A vr32A vr102A vr11的候选片段 1条 (图 1 ) , 命名为
A11T13 A vr3210211S157; 无毒基因 A vr4的候选片段 2条 , 命名为 A24T19Avr4S122, A24T24A vr4S142
(图 2) , 没有得到无毒基因 A vr1和 A vr2的候选片段。
图 1 无毒基因连锁群 A vr32A vr102A vr11的候选片段
引 物组合 Apo11和 Taq13, 大小 157 bp; P1, P2, P3, P4代表用于 BSA分析的 4个池 , 1～20表示供试马铃薯晚疫病菌菌株 ;
A表示此无毒基因候选片段在菌株个体上表达 , V表示此无毒基因候选片段在菌株个体上不表达。
F ig. 1 TD F represen ting an A vr32A vr102A vr11 cand ida te
Ap o11 + Taq13, size 157 bp; P1, P2, P3, P4 rep resent 4 pools constructed for BSA analysis, 1 - 20 are No. of 20 P. infestans isolates;
A : A11T13 Avr3210211S157 is exp ressed in P. infestans isolates, V: A11T13 Avr3210211S157 is not exp ressed in P. infestans isolates.
图 2 无毒基因 A vr4的候选片段
引物组合 Apo24和 Taq24, 大小 142 bp; P1, P2, P3, P4代表用于 BSA分析的 4个池 , 1～20表示供试马铃薯晚疫病菌菌株 ;
A表示此无毒基因候选片段在菌株个体上表达 , V表示此无毒基因候选片段在菌株个体上不表达。
F ig. 2 TD F represen ting an A vr4 cand ida te
A po24 + Taq24, size 142 bp; P1, P2, P3, P4 rep resent 4 pools constructed for BSA analysis, 1 - 20 are No. of 20 P. infestans isolates;
A: A24T24A vr4S142 is exp ressed in P. infestans isolates, V: A24T24Avr4S142 is not exp ressed in P. infestans isolates.
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1期 郭 军等 : 马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因候选表达序列的 cDNA2AFLP鉴定
212 马铃薯晚疫病菌无毒基因候选片段序列分析
利用 BLASTN和 BLASTX序列比对程序 , 借助于 NCB I和 Phytophthora Consortium数据库 , 对 3个
无毒基因候选片段进行了比对和分析 (表 2)。通过 BLASTX分析 , 没有获得与此 3个无毒基因候选
片段具有显著相似性的已知蛋白质。BLASTN结果表明 : A11T13A vr3210211S157与马铃薯晚疫病菌萌
发中孢子囊 EST库中的 EST PG001F101XT7同源 , E值为 2e210; A24T19Avr4S122与晚疫病菌萌发中
的静孢子 EST库中的 EST PH051G101XT7部分序列完全一致 , E值为 3e245; A24T24A vr4S142与该序
列的同源性为 98% , E值为 3e252。利用 DNAStar软件对 3个 EST A24T19A vr4S122, A24T24A vr4S142
和 PH051G101XT7进行比较分析 , 发现 EST PH051G101XT7的开放阅读框包含 A24T19A vr4S122和
A24T24A vr4S142的序列 , 并对 PH051G101XT7进行 BLASTX分析 , 发现与大豆疫霉菌 Phytoph thora so2
jae诱导寄主产生坏死反应的未知蛋白 AA024646有低同源性 , E值为 114。
表 2 3个无毒基因候选片段的 Bla st分析结果
Table 2 Bla st results of three av irulence gene cand ida tes
无毒基因候选片段 Name
of Avr gene candidate TDFs
无毒基因候选片段序列
Sequence of Avr gene candidate TDFs
EST同源性
EST Homogy
E值
E value
A11T13Avr3210211S157
AAGCTGGTTGAAGCGCGACTGCTTTTCACTCTGGAAGTGCTGCGTATCCTGCTC2
CGTCGCAGCCAACTCCTTGTCAATCGCACGTTGCTTGGCTGTCTGACGCTCTCC2
GGCCTTCCGAAGCTCT
G001F10. XT7
2e210
A24T19Avr4S122
TCGTTATTTGCCATCTCAGACGCCGACTTACCGTTGAGTTTAAGCGTCGTGATG2
ACACTTTTTATATGGGTTCCCTCCATGGCCCACTTC
PH051G10. XT7
3e245
A24T24Avr4S142
TCCCGCGCTCCTGAAGTATGTCAAGTTGTATCTTGATTTTAAACCAGTCAGGGA2
CCTTAACGCAAAATCCCGTCTCCAAGCTAGACGGCCCATATCTTAGTTTCGCT2
GGA
PH051G10. XT7
3e252
3 讨论
本试验结果首先表明利用 cDNA2AFLP技术研究马铃薯晚疫病菌不同特异生理小种和病菌特定生
长时期的基因表达的可行性 ; 结合 BSA策略 , 获得了许多与无毒基因相关的 TDFs, 为晚疫病菌无毒
基因的最终克隆提供了一条快速有效的途径。利用 cDNA2AFLP研究基因差异表达 , 选择好研究时期
是至关重要的〔10, 11〕。在本试验中 , 确定利用萌发中静孢子这个时期来鉴定无毒基因的依据为 : 在马
铃薯 -晚疫病菌互作过程中 , 许多病菌基因在寄主产生抗性或病菌致病性方面具有重要作用 , 例如病
菌的 ipi基因、 car基因 , 研究表明 , 这些基因都会在病菌的侵染前期 (萌发中的静孢子时期 ) 表达 ,
并且具有正向调控作用〔7, 12〕。据此可以推定 , 能够引起含有相应抗性基因的马铃薯植株产生过敏性坏
死反应的晚疫病菌的无毒基因将会在侵染前期 (萌发中的静孢子时期 ) 表达。此外 , 从大豆疫霉菌
Phytophthoa sojae中克隆的无毒基因 A vr1b /A vr1k〔13〕以及从番茄叶霉菌 C ladosporium fu lvum 中克隆的无
毒基因 A vr9和 Avr4〔14〕, 都是通过植株诱导后再进行克隆。但对克隆马铃薯晚疫病菌无毒基因而言 ,
如果利用 cDNA2AFLP技术去研究病原菌侵染的马铃薯材料 (马铃薯和晚疫病菌的混合体 ) , 将会获
得来自马铃薯植株和病菌的太多的差异表达片段 , 这非常不利于获得与无毒基因相关的 TDFs。因此
本试验选择把病菌培养在黑麦琼脂培养基上 , 以只得到与病菌相关的 TDFs。本试验结果表明利用马
铃薯晚疫病菌萌发中的静孢子时期 , 进行其基因差异表达研究并鉴定无毒基因是可行的。
无毒基因 Avr4候选片段 A24T19A vr4S122和 A24T24A vr4S142测序分析结果表明该两个序列与
PH051G101XT7具有高度同源 , 而 PH051G101XT7 与诱导寄主产生坏死反应有关 , 说明该 EST
PH051G101XT7很有可能就是无毒基因 Avr4的一端序列 , 这将有利于我们下一步通过电子克隆快速
获得全长的无毒基因 A vr4。需要说明的是 , 所得的 3个无毒基因候选片段尚需进一步的试验验证 ; 此
外通过 cDNA2AFLP技术获得的只是片段而不是完整的 cDNA, 所以要获得完整的无毒基因 , 需通过
RACE等其他方法获得全长的 cDNA克隆 , 然后对全长无毒基因通过马铃薯 X病毒 ( PVX) 表达体系
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或农杆菌瞬时表达体系 (Ag robacterium tum efaciens transient exp ression assay, ATTA ) 进行功能验证 ,
目前这些试验正在进行中。
参考文献 :
1 Erwin D C, R ibeiro O K. Phytophthora disease worldwide. Saint Paul, M inn. : APS Press, 1996
2 van der Lee T, De W itte I, D renth A, A lfonso, C, Govers, F. AFLP linkage map of the oomycete Phytophthora infestans. Fungal Genetics
and B iology, 1997, 21: 278～291
3 van der Lee, T, Robold, A, Testa, A, vanpit Klooster, J W , Govers, F. Mapp ing of avirulence genes in Phytophthora infestans with amp lified
fragment length polymorphism markers selected by bulked segregant analysis. Genetics, 2001, 157: 949～956
4 W hisson, S C, van der Lee, T, B ryan, G J, W augh, R, Govers, F, B irch, P R J. Physical mapp ing across an avirulence locus of Phytoph2
thora infestans using a high rep resentation, large insert bacterial artificial chromosome library. Molecular and General Genom ics, 2001, 266:
289～295
5 Bachem C W , van der Hoeven R S, de B ruijn SM, V reugdenhil, D, Zabeau, M, V isser, R G. V isualization of differential gene exp ression
using a novel method of RNA fingerp rinting based on AFLP: analysis of gene exp ression during potato tuber development. The Plant Journal,
1996, 9: 745～753
6 Cooper B. Collateral gene exp ression changes induced by distinct p lant viruses during the hypersensitive resistance reaction in Chenopodium
am aranticolor. The Plant Journal, 2001, 26 (3) : 339～496
7 van W est P, de Jong A J, Judelson H S, Emos, A M, Govers, F. The ipiO gene of Phytophthora infestans is highly exp ressed in invading
hyphae during infection. Fungal Genetics and B iology, 1998, 23: 126～138
8 Bachem C W , Oomen R J F, V isser R G F. Transcrip t imaging with cDNA2AFLP: A step2by2step p rotocol. PlantMolecular B iology Report2
er, 1998, 16: 157～173
9 娄 平 , 王晓武 , Guusje Bonnema, 方智远. 利用 cDNA2AFLP技术鉴定甘蓝显性核不育基因相关表达序列. 园艺学报 , 2003, 30
(6) : 668～672
Lou P, W ang X W , Bonnema G, Fang Z Y. Gene exp ression associated with dom inant male sterility in cabbage is revealed by cDNA2amp li2
fied fragement length polymorphism analysis. Acta Horticulturae Sinica, 2003, 30 (6) : 668～672 ( in Chinese)
10 Dellagi A, B irch P R, Heilbronn J, Lyon G D, Toth I K. cDNA2AFLP analysis of differential gene exp ression in the p rokaryotic p lant patho2
gen E rw inia carotovora. M icrobiology, 2000, 146 (1) : 165～171
11 Q in L, Overmars H, Helder J, Popeijus H, van der Voort J R, Groenink W , van Koert P, Schots A, Bakker J, Smant G. An efficient cD2
NA2AFLP2based strategy for the identification of putative pathogenicity factors from the potato cyst nematode Globodera rostochiensis. Mol.
Plant2M icrobe Interact. , 2000, 13 (8) : 830～836
12 GÊrnhaldt B, Rouhara I, Schmelzer E. Cyst germ ination p roteins of the potato pathogen Phytophthora infestans share homology with human
mucins. Mol. Plant2M icrobe Interact. , 2000, 13: 32～42
13 Tyler B rettM. Molecular basis of recognition between Phytophthora pathogens and their hosts. Annu. Rev. Phytopathol. , 2002, 40: 137～167
14 Joosten M H A J, DeW it P J GM. The tomato2C ladosporium fulvum interaction: a versatile experimental system to study p lant2pathogen inter2
actions. Annual Review of Phytopathology, 1999, 37: 335～367
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