全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (6) : 895 - 898
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 12 - 17; 修回日期 : 2008 - 02 - 27
基金项目 : 霍英东教育基金项目 (104031) ; 广东省自然科学基金项目 (05300848)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: yuyixun106@ sohu1com)
车轮梅茎段高效再生体系的建立
刘娟旭 1, 2 , 刘　玲 1 , 余义勋 13 , 王　静 1 , 黄现宝 1
(1 华南农业大学园艺学院 , 广州 510642; 2 University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences, Apopka, FL
3270328504, USA)
摘 　要 : 以车轮梅 (Rhaphiolepis indica L indl. ) 茎段为外植体 , 探讨基本培养基种类、植物生长调节
剂组合、蔗糖浓度和 AgNO3等对茎段器官发生和植株再生的影响。结果表明 : MS + 62BA 210 mg·L - 1 +
NAA 015 mg·L - 1 + AgNO3 110 mg·L - 1 +蔗糖 40 g·L - 1培养基最适合不定芽的分化和增殖 , 不定芽分化
率达 90%以上 , 平均每外植体分化不定芽数达 5138个。不定芽可在 1 /2MS培养基中有效伸长 , 适宜的生
根培养基为 1 /2MS +NAA 110 mg·L - 1 , 生根率达到 100%。
关键词 : 车轮梅 ; 茎段 ; 植物生长调节剂 ; 不定芽再生
中图分类号 : S 685112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0620895204
Establishm en t of A H ighly Eff ic ien t System of Shoot Regenera tion from Stem
Segm en t Explan ts of R haph io lep is ind ica L indl.
L IU Juan2xu1, 2 , L IU L ing1 , YU Yi2xun13 , WANG J ing1 , and HUANG Xian2bao1
(1 College of Horticulture, Sou th China A gricultural U niversity, Guangzhou 510642, Ch ina; 2U niversity of F lorida, Institu te of
Food and A gricultura l Sciences, A popka, FL 3270328504, USA )
Abstract: An efficient p lant regeneration p rotocol for R haphiolepis ind ica L indl. was achieved via orga2
nogenesis direct formation on stem segment exp lants in vitro. Several factors affecting in vitro regeneration of
R. ind ica , such as basic medium, different hormones combination, concentrations of sucrose and AgNO3 ,
were exam ined. The op timum medium for shoot regeneration wasMS medium containing 210 mg·L - 1 62BA ,
015 mg·L - 1 NAA, 110 mg·L - 1AgNO3 and 40 g·L - 1 sucrose. 90% of adventitious shoot regeneration fre2
quency with 5138 shoots per exp lant was obtained. Excised shoots were effectively elongated in 1 /2 MS medi2
um. Elongated shoots of 310 cm rooted when they were transferred to 1 /2MS medium containing 110 mg·L - 1
NAA after 40 days and developed into healthy p lantlets, which resulted in a rooting rate of 100%.
Key words: Rhaphiolepis ind ica L indl. ; stem segment; p lant growth regulator; shoot regeneration
车轮梅 (R haphiolepis ind ica L indl. ) 为蔷薇科 (Rosaceae) 石斑木属的一种优良野生花灌木。车
轮梅树高 1～4 m, 枝叶繁茂 , 春夏满树白花 , 花朵中心为淡红色或橙红色 , 花形奇特 , 秋季紫黑色
球果缀满枝头 , 极具观赏价值 , 开发前景广阔。车轮梅多以种子繁殖 , 也可以扦插繁殖 (代色平
等 , 2007)。车轮梅开花虽盛 , 但开花时间较短 , 花色还不够丰富。本研究建立起车轮梅高效再生体
系 , 有可能为利用现代生物技术改良其品质打下基础。
1　材料与方法
111　无菌苗的获得
车轮梅种子于 2004年 12月采于华南农业大学校园。用自来水洗去种子表面灰尘 , 70%酒精消毒
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
30 s, 再用 011%升汞溶液消毒 8～10 m in, 无菌水冲冼 4次 , 再用刀轻微刻伤种皮 , 接种到 1 /2MS培
养基中 , 5 d后种子膨大发芽 , 2周后第 1片真叶长出。35 d后可切取茎段用于再生培养。
112　不定芽再生
11211　基本培养基筛选 　切取无菌苗茎段 015～110 cm, 平接于不同种类的基本培养基中。以 MS、
1 /2MS、W PM和 B5为基本培养基 , 附加 62BA 210 mg·L - 1、NAA 015 mg·L - 1、AgNO3 110 mg·L - 1、
琼脂粉 7 g·L - 1和蔗糖 30 g·L - 1 , 用 011 mol·L - 1 NaOH将 pH值调至 518～610, 121 ℃高压 (112
kg·cm - 2 ) 灭菌 20 m in。其中 AgNO3为过滤灭菌。
接种外植体后置于 24～26 ℃, 光照强度 3 000 lx, 光照时间 12～14 h·d - 1条件下培养。每培养
瓶接种 5个外植体 , 每处理 8瓶。35 d后统计每个处理再生不定芽数和每个外植体再生的芽数 , 计算
不定芽分化率、每个外植体平均再生芽数 , 确定再生最适培养基。不定芽分化率 ( % ) =再生不定芽
外植体数 /接种外植体数 ×100; 平均再生不定芽数 =再生不定芽总数 /能再生的外植体数。
11212　NAA和 62BA配比 　以 MS为基本培养基 , 添加不同浓度的 62BA和 NAA , 另加 AgNO3 110
mg·L - 1。将材料切割成 015～110 cm的茎段接种于不同诱导培养基上 , 35 d后统计再生不定芽数。
11213　蔗糖浓度 　试验设 5个蔗糖浓度 : 10、20、30、40、50 g·L - 1 , 以茎段为外植体 , 基本培养
基与培养条件同上。
11214　AgNO3 　设 6个 AgNO3浓度 : 0、015、110、115、210、215 mg·L - 1 , 试验材料、基本培养基
与培养条件同上。
113　不定芽增殖
增殖培养以 MS为基本培养基 , 附加 210 mg·L - 1 62BA和 110 mg·L - 1 AgNO3 , 另 NAA浓度设置
3个处理 : 011、015和 110 mg·L - 1。经过 1～2次继代后小丛芽逐渐分化出不定芽 , 每个处理接种
40个外植体 , 继代时间 40 d, 继代 3次后统计增殖倍数。
114　生根和移栽
将再生不定芽接种到不添加任何植物生长调节剂的 1 /2MS培养基中伸长生长。不定芽伸长至 310
cm时 , 接种到 1 /2MS生根培养基附加 NAA (015、110、115、210、215 mg·L - 1 ) 及蔗糖 30 g·L - 1
和琼脂粉 7 g·L - 1。每个生根处理包含 30个外植体 , 3次重复。50 d后统计生根情况 , 记录每个外
植体的生根数 , 计算生根率。
邓肯氏新复极差法进行数据差异显著性测验。
2　结果与分析
211　不定芽的分化
21111　培养基种类的影响　切取车轮梅无菌苗茎段 015～110 cm平接于不同种类的基本培养基中 , 2
周后车轮梅茎段上部伤口处开始直接分化出浅绿色球形不定芽 (图版 , A～C)。少数外植体基部伤口
处也可分化不定芽 , 不过数量较少。从表 1可以看出 , 车轮梅茎段在 1 /2MS、MS、W PM和 B5等 4种
不同基本培养基中均可以分化出不定芽 , 但不定芽分化率有显著差异 , MS培养基中不定芽分化率最
高 , 达到 9313%。表 1还表明 : 基本培养基不仅影响不定芽分化率而且影响每个外植体分化不定芽
的个数。平均每个外植体再生芽数最高的 (5122个 ) 也发生在 MS培养基上 , 说明 MS为车轮梅茎段
不定芽诱导的最适培养基。
21112　NAA和 62BA配比的影响 　从表 2可以看出 , 62BA对车轮梅不定芽分化影响很大 , 最适浓度
为 210 mg·L - 1。单独使用 NAA时芽分化率为 0, 单独使用 62BA, 芽分化率较低 , 最佳组合是 62BA
210 mg·L - 1 +NAA 015 mg·L - 1 , 此时不定芽分化率可达 9215%。
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　6期 刘娟旭等 : 车轮梅茎段高效再生体系的建立 　
表 1　基本培养基对车轮梅茎段不定芽分化的影响
Table 1　Effects of ba sic m ed ium on shoots d ifferen tia tion of
Rhaph io lep is indica stem segm en t
基本培养基
Basic medium
不定芽分化率 /%
Shoots differentiation rate
平均不定芽数
Number of shoots
per exp lant
1 /2MS 7117 c 2186 c
MS 9313 a 5122 a
W PM 8114 b 3179 b
B5 5417 d 3181 b 表 2　NAA和 62BA配比对车轮梅茎段不定芽分化的影响Table 2　Effects of NAA and 62BA com b ina tion on shootsd ifferen tia tion frequency of R. indica stem segm en t /%NAA / (mg·L - 1 ) 62BA / (mg·L - 1 )0 110 210 3100 0 4010 5715 4715012 0 6215 7715 7215015 0 7010 9215 7510110 0 6010 8215 5510
21113　蔗糖浓度的影响 　蔗糖浓度对车轮梅茎段离体不定芽形成有明显的影响 (表 3)。当蔗糖浓度
达到 40 g·L - 1时 , 不定芽再生率和平均芽数达到最大 , 分别为 9113%和 5108个。10 g·L - 1蔗糖处
理中产生的芽生长缓慢 , 这可能与后期生长过程中碳源不足有关 , 而含 50 g·L - 1的蔗糖培养基渗透
压过高 , 也不利于不定芽的形成。
21114　AgNO3浓度的影响 　从表 4可以看出 , 适宜浓度的 AgNO3对车轮梅茎段离体不定芽分化有明
显促进作用。110 mg·L - 1 AgNO3处理 35 d后不定芽再生率和平均芽数分别是 9214%和 5138个。但
随着 AgNO3浓度的增加 , 不定芽再生率和平均芽数都降低。受伤的外植体特别是伤口处易产生较多的
乙烯 , 使培养物的生长分化受到影响。
在培养基中添加乙烯抑制剂 (如 AgNO3等 ) 促进外植体再生已引起人们的注意 ( Chi et al. ,
1990)。AgNO3可以促进愈伤组织的器官发生与体细胞胚胎发生 , 促进一些再生困难芽的产生 (张鹏
等 , 1997) , Radke等 (1992) 报道 , 分化培养基中添加 AgNO3可以促进芽原基的产生和伸长。林良
斌等 (1999) 也认为 AgNO3能够提高甘蓝型油菜的植株再生。
表 3　蔗糖浓度对车轮梅茎段不定芽分化的影响
Table 3　Effects of d ifferen t concen tra tion s of sucrose on shoots
d ifferen tia tion of R. indica stem segm en t
蔗糖 /
( g·L - 1 )
Sucrose
外植体数
Number of
exp lants
不定芽分化率 /%
Shoots
differentiation rate
平均不定芽数
Number of shoots
per exp lant
10 40 6811 d 3119 c
20 40 7219 cd 3148 c
30 40 7912 b 4103 b
40 40 9113 a 5108 a
50 40 7618 c 4116 b 表 4　AgNO 3 浓度对车轮梅茎段不定芽分化的影响Table 4　Effects of AgNO 3 concen tra tion s on shoots d ifferen tia tionfrom stem segm en t of R. indica stem segm en tAgNO3 /(mg·L - 1 ) 外植体数Number ofexp lants 不定芽分化率 /%Shootsdifferentiation rate 平均不定芽数Number of shootsper exp lant0 40 8114 c 3172 c015 40 8311 bc 3185 bc110 40 9214 a 5138 a115 40 8413 b 3191 b210 40 7114 d 4118 b215 40 6615 d 3104 d
　　综合以上优化结果 , 茎段不定芽分化的最佳培养基为 MS + 62BA 210 mg·L - 1 +NAA 015 mg·L - 1
+ AgNO3 110 mg·L - 1 +蔗糖 40 g·L - 1。
212　不定芽增殖
将获得的小丛芽转入不同增殖培养基中进行丛生苗诱导。接种的不定芽在设计的几种培养基上均
能增殖 , 其中也以最佳分化培养基 MS + 62BA 210 mg·L - 1 +NAA 015 mg·L - 1 +AgNO3 110 mg·L - 1
中增殖倍数最高 , 达到 3141 (图版 , D )。从第 3次增殖培养开始 , 丛生苗的增殖倍数逐渐减少。
213　不定芽的伸长、生根及移栽
将再生不定芽接到无植物生长调节剂的 1 /2M S培养基中 , 3周后可伸长至 310 cm (图版 , E) ,
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多数在 20～25 d时开始有不定根突起 , 35～40 d
每株长出 3～4条粗细均匀的根。由表 5可知最佳
生根培养基为 1 /2MS + NAA 110 mg·L - 1 , 生根
率达 100% (图版 , F)。根长至 3 cm左右时炼苗
2～3 d, 用流水洗去根上的培养基 , 移栽到经过
消毒处理的园土和泥炭土等体积混合的基质中 ,
每周浇水 2次 , 2周后长出新的小叶 , 成活率可
达 90%以上 (图版 , G)。
表 5　NAA浓度对车轮梅茎段不定芽生根的影响
Table 5　Effects of NAA concen tra tion s on shoots rooting
of R. indica stem segm en t
NAA / (mg·L - 1 ) 外植体数Number of exp lants
生根率 /%
Rooting rate
015 90 6819 d
110 90 10010 a
115 90 9116 b
210 90 8417 c
215 90 8214 c
References
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图版说明 : A. 茎段伤口分化不定芽初期 ; B. 茎段两端分化不定芽 ; C. 仅茎段上端分化出不定芽 ; D. 不定芽切下后增殖 ; E. 不定
芽伸长 ; F. 不定芽生根 ; G. 移栽成活。
Explana tion of pla tes: A. Shoots differentiation from stem segment cuts at initial stage; B. Multip le shoots formation from top and basal cuts of
stem segment; C. Multip le shoots formation only from top cuts of stem segment; D. M icrop ropagation of adventitious shoots; E. Elongated shoots
in elongation medium; F. Rooting seedlings; G. Survived in vitro p lantlets transp lanted in flower pots.
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