全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (12) : 1742 - 1750
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 06 - 27; 修回日期 : 2008 - 09 - 27
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 (2006AA100108) ; 重庆市 ‘十一五’柑橘选引种重大专项 (2007—2010) ; 重庆市自然科学
基金项目 (CSTC, 2007BB1381)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: qibinhong@1631com)
枳属种质遗传多样性及其与近缘属植物亲缘关系的
SSR和 cpSSR分析
龚桂芝 , 洪棋斌 3 , 彭祝春 , 江 东 , 向素琼
(中国农业科学院柑橘研究所 , 西南大学柑橘研究所 , 重庆 400712)
摘 　要 : 应用核基因组 SSR和叶绿体基因组 SSR, 分析了枳属 28份枳及枳杂种种质的遗传多样性及其
与近缘属植物的亲缘关系。核基因组 SSR分析表明普通枳的遗传差异明显 , 22个 SSR位点的平均多态性信
息含量 ( P IC) 为 0151, 平均期望杂合度为 0152, 表明中国枳种质资源具有较丰富的遗传多样性。在遗传
距离约 0116时 , 22份普通枳可以分成 4个类型。叶绿体基因组 SSR分析则发现普通枳间基本无差异 , 表
明以母系遗传为特征的枳叶绿体基因组相对保守。富民枳与普通枳无论是在核基因组还是在叶绿体基因组
上均存在较大差异 , 支持富民枳种的地位。SSR和 cpSSR结合使用可比较准确地鉴定枳杂种。
关键词 : 枳 ; SSR; cpSSR; 遗传多样性 ; 亲缘关系
中图分类号 : S 666　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1221742209
Genetic D iversity of Poncirus and Its Phylogenetic Rela tion sh ips w ith Rela2
tives a s Revea led by Nuclear and Chloropla st SSR
GONG Gui2zhi, HONG Q i2bin3 , PENG Zhu2chun, J IANG Dong, and X IANG Su2qiong
(C itrus Research Institu te, Chinese A cadem y of A gricultural Sciences, Sou thw est U niversity, Chongqing 400712, China)
Abstract: Twenty2eight accessions of trifoliate orange ( Poncirus trifolia ta Raf. ) , hybrids and seven
accessions of its relatives, were analyzed for genetic diversity and phylogenetic relationship using nuclear and
chlorop last SSR markers. Average P IC ( polymorphism information content) value of 0151 and average
expected heterozygosity of 0152 were given according to nuclear SSR results. Twenty2two common trifoliate or2
ange accessions could be divided into four group s with a genetic distance of 0116. It indicates a rich genetic
diversity of China trifoliate orange germp lasm. cpSSR revealed no difference among common trifoliate orange
accessions which indicates a relatively conservative chlorop last genome. Four cpSSR loci were found different
between Fum in ( P. polyand ra S. Q. D ing et al. ) and common trifoliate orange. Fum in trifoliate orange is
genetically distant from common trifoliate orange, from its hybrids as well as relatives. Therefore it could be
regarded as a true species. The combined app lication of nuclear and chlorop last SSR could serve a more accu2
rate way to identify trifoliate orange hybrids.
Key words: Poncirus trifolia ta; SSR; cpSSR; genetic diversity; phylogenetic relationship
枳属 ( Poncirus) 是柑橘的近缘属 , 原产中国 , 分布广泛。落叶性、三出复叶是枳区别于其他柑
橘近缘属的明显特征。同时枳具有耐病、抗寒、矮化、使接穗品种早结丰产等特性 , 是柑橘栽培的重
要砧木资源和遗传研究的重要材料。以枳为亲本育成的部分砧木 , 如卡里佐枳橙等 , 已取代酸橙、粗
柠檬等砧木 , 广泛用于世界柑橘栽培。
　12期 龚桂芝等 : 枳属种质遗传多样性及其与近缘属植物亲缘关系的 SSR和 cpSSR分析 　
枳属长期被认为是单种属 , 但在几千年的栽培过程中产生了丰富的变异类型 (郭天池 等 ,
1996) , 并与其近缘属杂交产生了众多的天然枳杂种 , 仅在国家果树种质重庆柑橘圃就收集保存了百
余份枳资源材料。根据形态特征 , 枳被划分成大叶系、小叶系、无刺系、畸形花等多种类型 , 根据园
艺性状及染色体特性 , 又鉴定出矮化系及多倍体类型等。枳属另一特异种质 ———富民枳的发现 , 动摇
了人们对枳属为单种属的认识 , 较多的研究支持富民枳种的地位 (丁素琴 等 , 1984; Fang, 1993;
Pang et al. , 2003; 吴兴恩 等 , 2003) , 但富民枳究竟是种还是杂种迄今仍有争议。
利用 SSR ( simp le sequence repeat) 标记对柑橘及近缘属植物研究已经有一些报道 ( Pang et al. ,
2003; Barkley et al. , 2006) , 但较少涉及枳属种质资源。对枳属植物较系统的研究多集中在 RAPD
(吴兴恩 等 , 2003)、RFLP、 ISSR ( Fang et al. , 1997) 和 AFLP (庞晓明 等 , 2003) 等分子标记
上。
作者从 150多对 SSR和 EST2SSR引物中筛选出了在枳属种质中表现多态性的 22对引物 , 结合在
枳和枳杂种上表现差异的 7对 cpSSR ( chlorop last simp le sequence repeat) 引物 , 选取保存在国家果树
重庆柑橘圃的枳属 28份普通枳和枳杂种以及部分可能参与枳杂种形成的柑橘近缘属材料 7份 , 进行
了遗传多样性分析和亲缘关系研究。
1　材料与方法
111　供试材料
本研究选用了保存在国家果树重庆柑橘圃不同地理来源的普通枳 ( Poncirus trifolia ta Raf. ) 22份
(表中 1～22号 ) , 特异种质即富民枳 ( P. polyandra S. Q. D ing et al. ) 1份 , 枳杂种 5份。此外 , 还
选用了参与或可能参与枳杂种形成的近缘属代表材料朱红橘 (C itrus ery throsa Hort. ex Tanaka)、华盛
顿脐橙 (C. sinensis O sbeck)、马叙葡萄柚 (C. parad isi Macf. )、晚白柚 (C. grand is O sbeck)、宜昌
橙 (C. ichangensis Swingle )、云南小香橼 ( C. m ed ica L. var. yunnanensis S. Q. D ing) 和金豆
( Fortunella h indsii var. ch in tou Swingle) 用于枳天然杂种来源的鉴定。材料详见表 1。
112　总 D NA的提取
于 2007年春取供试材料嫩叶 , 用 CTAB 法提取总 DNA, 加 RNaseA 至终浓度 20 μg·mL - 1 ,
37 ℃保温 1 h去除 RNA, 重新用乙醇沉淀并溶解在少量超纯水中 , 琼脂糖电泳结合 B iorad紫外分光
光度计检测 DNA质量和浓度 , 将 DNA浓度稀释至 50 ng·μL - 1 , - 20 ℃保存备用。
113　SSR及其产物的扩增检测
SSR引物来源于已公开发表的文献 (Chen et al. , 2006; J iang et al. , 2006; 张连峰 等 , 2006)
和根据 GenBank中的 EST序列自行设计 , 设计方法见 J iang等 (2006) 的文献 , 由上海英骏生物工程
公司合成。叶绿体 SSR引物根据新近发表的柑橘叶绿体基因组序列 (Bausher et al. , 2006) , 通过搜
索其中的简单重复序列 , 采用 Primer Prim ier 5设计。
核基因组 SSR扩增采用 20μL反应体系。各组分终浓度为 : 25～50 ng总 DNA、1 ×buffer、115
mmol·L - 1 MgCl2 , 012 mmol·L - 1 dNTP, 上游引物和下游引物各 012μmol·L - 1 , TaqDNA聚合酶
1 U。叶绿体 SSR扩增反应体系经优化 , 除模板 DNA调整为 10 ng、TaqDNA聚合酶调整为 015 U , 其
余与核基因组 SSR相同。
PCR扩增反应在 B iometra公司生产的 PCR仪上进行。核基因组 SSR采用 Touch2down PCR扩增程
序进行扩增 : 94 ℃预变性 4 m in; 94 ℃ 45 s, 起始退火温度 60～56 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 每循环降
015 ℃, 10个循环 ; 94 ℃ 45 s, 56～52 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 24个循环 ; 72 ℃延伸 5 m in; 4 ℃保存。
退火温度根据相关引物的 Tm值进行调整。叶绿体 SSR参照核基因组 SSR扩增程序进行优化后确定
为 : 起始退火温度 65～58 ℃, 7个循环 , 每个循环降 1 ℃; 降落后退火温度 58 ℃, 17个循环 , 其余
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步骤与前者相同。扩增产物用 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 银染检测。
114　引物筛选
选择地理来源和形态差异较大的旺苍大叶枳和 5号小花枳进行基因组 SSR引物的初步筛选 , 从
150多对引物中筛选出多态性好、分辨率高的 22对核基因组 SSR引物。 cpSSR则采用旺苍大叶枳、5
号小花枳、富民枳、卡里佐枳橙进行初步筛选 , 从 11对引物中获得 7对在枳和枳杂种间表现差异的
引物。
115　数据处理
每对 SSR引物检视 1个位点 , 每条多态性带为 1个等位基因 , 有带记为 1, 无带记为 0。转化成
AA、AB、BB矩阵用 popgen32软件计算等位基因数、等位基因频率、观测杂合度和期望杂合度。参
照文献计算标记位点的多态性信息含量 ( P IC) ( Sm ith et al. , 1997)、遗传相似系数和遗传距离
(Nei & L i, 1979)。用 Treecon ( version 113b) 软件 , 根据遗传距离矩阵 , 按 UPGMA ( unweighted
pair group method arithmetic averages) 法进行聚类分析 , 并对数据进行 500次重复抽样 bootstrap检验。
表 1　不同来源的枳、枳杂种和可能的亲本材料
Table 1　Accession s of Poncirus, its hybr ids and rela tives in th is study
编号
Code
种质名称
Accession name
类型
Type
来源
O rigin
1 黄岩枳 Huangyan 大叶大花 Large2leaf, large flower 浙江黄岩 Huangyan, Zhejiang
2 厚皮枳 Thick2skin 大叶大花 Large2leaf, large flower 福建闽侯 M inhou, Fujian
3 东海枳 Donghai 大叶大花 Large2leaf, large flower 江苏东海 Donghai, J iangsu
4 泸溪枳 Luxi 大叶大花 Large2leaf, large flower 湖南 Hunan
5 旺苍大叶枳 W angcang Daye 大叶大花 Large2leaf, large flower 四川旺苍 W angcang, Sichuan
6 湖北早实枳 Hubei Zaoshi 大叶小花 ;实生选系 Large2leaf, small2flower; Seedling 湖北武汉 W uhan, Hubei
7 薄皮枳 Thin2skin 大叶小花 Large2leaf, small2flower 福建闽侯 M inhou, Fujian
8 唐河枳 Tanghe 大叶小花 Large2leaf, small2flower 河南唐河 Tanghe, Henan
9 莒南枳 Lünan 大叶小花 Large2leaf, small2flower 山东莒南 Lünan, Shandong
10 皱皮枳 Crinkle2skin 大叶小花 Large2leaf, small2flower 江苏 J iangsu
11 永顺枳 Yongshun 大叶小花 Large2leaf, small2flower 湖南永顺 Yongshun, Hunan
12 日本枳 Japanese 大叶小花 Large2leaf, small2flower 日本 Japan
13 22号枳 22 小叶大花 ;实生选系 Small2leaf, large2flower; Seedling 重庆北碚 Beibei, Chongqing
14 小叶枳 Small2leaf 小叶大花 Small2leaf, large2flower 美国 America
15 枣阳小花枳 Zaoyang Small2flower 小叶小花 Small2leaf, small2flower 湖北枣阳 Zaoyang, Hubei
16 7721 小叶小花 ;实生选系 Small2leaf, small2flower; Seedling 重庆北碚 Beibei, Chongqing
17 飞龙枳 Flying D ragon 变种 Variation 美国 America
18 灌云 1号 Guanyun 1 四倍体 Terap loid 江苏灌云 Guanyun, J iangsu
19 5号小花 Small2flower 5 大叶小花 ;实生选系 Large2leaf, small2flower; Seedling 重庆北碚 Beibei, Chongqing
20 东湖 1号 Donghu 1 大叶大花 Large2leaf, large2flower 湖北武汉 W uhan, Hubei
21 穿城 1号 Chuancheng 1 大叶小花 Large2leaf, small2flower 江苏泗阳 Siyang, J iangsu
22 84285 小叶小花 Small2leaf, small2flower 湖北枣阳 Zaoyang, Hubei
23 富民枳 Fum in 常绿 Evergreen 云南富民 Fum in, Yunnan
24 朱红橘 ×枳 Zhuhong Citrandarin 人工杂种 (C. erythrosa ×P. trifolia ta) 重庆北碚 Beibei, Chongqing
25 卡里佐枳橙 Carrizo Citrange 人工杂种 (C. sinensis ×P. trifolia ta) 美国 America
26 施文格枳柚 Swingle Citrumelo 人工杂种 (C. paradisi ×P. trifoliata) 美国 America
27 简阳枳柚 J ianyang Zhiyou 天然杂种 ( P. trifolia ta ×C. grandis) 四川简阳 J ianyang, Sichuan
28 枳宜昌 Zhiyichang 天然杂种 ( P. trifolia ta ×C. ichangensis) 河南唐河 Tanghe, Henan
29 朱红橘 Zhuhong Tangerine 浙江黄岩 Huangyan, Zhejiang
30 华盛顿脐橙 W ashington Navel O range 美国 America
31 马叙葡萄柚 Marsh Grapefruit 美国 America
32 晚白柚 W anbaiyou 福建 Fujian
33 宜昌橙 Ichang Papeda 重庆北碚 Beibei, Chongqing
34 云南小香橼 Yunnan Xiaoxiangyuan 云南 Yunnan
35 金豆 Golden Bean Kumquat 湖南 Hunan
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2　结果与分析
211　核基因组 SSR标记多态性及枳种质遗传多样性分析
28份枳属种质材料在 22个核基因组 SSR位点共扩增出 103个等位基因 , 平均每个位点可检测
4168个 , 最少为 2个 , 最多为 10个。平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为 0174和 0159。 SSR
标记多态性信息含量 ( P IC) 为 0142～0181, 平均 0158。若除去富民枳和枳杂种 , 22份普通枳在 22
个 SSR位点共扩增出 55个等位基因 , 每个位点可检测 2～6个 , 平均 2150个 ; 平均观测杂合度和平
均期望杂合度分别为 0179和 0152; P IC值为 0128～0177, 平均 0151。
P IC是衡量微卫星 DNA座位变异程度高低的重要指标。当某微卫星座位 P IC > 015时 , 表明其为
高度多态座位 ; 0125 < P IC < 015时 , 为中度多态座位 ; P IC < 0125时 , 为低度多态座位 (Botstein et
al. , 1980)。从表 2可见 , TAA41、CMS4、 F10、Cit12、Cit05在 22份普通枳上的 P IC值大于 015,
表现为高度多态座位 , 其余为中度多态座位。若加上富民枳、枳杂种 , 则除 Cit20、CSSR052、 F52
外 , 均表现为高度多态。
期望杂合度是假定各基因座位符合 Hardy2W einberg平衡的前提下计算的杂合度 , 多个座位期望杂
合度的平均值为平均期望杂合度 , 常用来度量群体遗传多样性 , 平均期望杂合度值越高 , 反映群体遗
传一致性就越低 , 遗传多样性越丰富 ( Frankham et al. , 2002)。在多倍体中 , P IC常被用来代替期望
杂合度 (He) 近似地估算遗传多样性水平。本研究中 , 22份普通枳在 22个 SSR位点的平均期望杂合
度为 0152, 平均 P IC为 0151, 若将枳杂种及富民枳计算在内 , 则平均期望杂合度和平均 P IC分别达
0159和 0158 (表 2) , 表明我国枳种质资源遗传多样性较丰富 , 属中偏高水平。
表 2　22对 SSR引物对 28份枳种质材料的扩增多态性
Table 2　D iversity sta tistics for 22 SSR markers stud ied in 28 Poncirus accession s
SSR位点
SSR loci
普通枳 (1～22)
Common trifoliate orange
等位基因数
A lleles
observed
观测杂合度 ( Ho)
Observed
heterozygosity
期望杂合度 ( He)
Expected
heterozygosity
P IC值
P IC value
普通枳、富民枳、枳杂种 (1～28)
Common and Fum in trifoliate orange, and hybrids
等位基因数
A lleles
observed
观测杂合度 ( Ho)
Observed
heterozygosity
期望杂合度 ( He)
Expected
heterozygosity
P IC值
P IC value
cAGG9 3 0118 0142 0141 3 0121 0154 0153
CMS4 4 1100 0166 0165 7 0196 0175 0173
TAA15 2 0186 0150 0149 5 0186 01 62 0161
TAA41 6 1100 0179 0177 10 0196 0182 0181
Cit05 3 1100 0159 0157 5 0196 0164 0163
Cit12 3 0168 0162 0161 6 0171 0173 0171
Cit15 2 0186 0150 0149 5 0182 0166 0165
Cit20 2 0181 0149 0148 2 0164 0150 0149
CSSR035 2 0182 0149 0148 4 0179 0153 0152
CSSR045 2 0186 0150 0149 4 0179 0158 0157
CSSR052 2 0181 0149 0148 3 0179 0155 0154
CSSR059 2 0186 0150 0149 6 0121 0158 0157
F9 2 0182 0149 0148 5 0179 0154 0153
F10 3 1100 0167 0165 3 0186 0164 0163
F14 2 0150 0150 0149 6 0157 0162 0161
F21 2 0186 0150 0149 4 0179 0158 0157
F31 2 0182 0149 0148 3 0179 0155 0154
F41 2 0186 0150 0149 5 0186 0157 0156
F52 3 0132 0129 0128 5 0143 0143 0142
F53 2 0182 0149 0148 3 0182 0153 0152
F65 2 0182 0149 0148 4 0168 0156 0155
F72 2 0182 0149 0148 5 0179 0154 0153
平均 Average 2150 0179 0152 0151 4168 0174 0159 0158
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212　枳、枳杂种、富民枳及其近缘属植物的 cpSSR多态性分析
11对 cpSSR引物的扩增产物在普通枳 (1～22号材料 ) 间均无差异 (图 1)。其中有 7对引物在
普通枳和以枳为父本的枳杂种间表现出多态性 , 有 4对引物在普通枳和富民枳间表现出多态性。7个
cpSSR位点在 35份供试材料中共检测出 37个等位基因 , 平均每对可检测 5129个。标记位点的多态
性信息含量为 0131～0155, 平均 0148。
图 1　引物 14T12对 35份材料的扩增结果
编号对应种质见表 1。
F ig. 1　The band prof iles of cpSSR am plif ied by the pr im er pa irs of 14T12
The codes were the same as Table 1; M: pUC18 /M sp IDNA marker.
213　枳种质及近缘属植物的聚类分析
21311　基于核基因组 SSR标记的聚类分析 　
根据 22对核基因组 SSR引物的扩增数据 , 按 Nei和 L i (1979) 遗传距离矩阵进行 UPGMA法聚
类 (图 2)。从聚类结果可见 , 在遗传距离 0177时 , 聚类图有最大跳跃值 , 35份材料被划分为两个
类群 : 即普通枳、枳杂种及富民枳为一个类群 , 柑橘属、金柑属材料为另一类群 , 表明枳属与柑橘属
和金柑属间确实存在较大的遗传差异。进一步对枳属材料内部进行分析 , 在遗传距离 0153时 , 22份
普通枳紧密聚成一类 , 从枳杂种和富民枳中分离出来 , bootstrap值高达 97% ; 当遗传距离为 0116时 ,
22份普通枳又可分为 4个类型 : 第一类包括唐河枳、莒南枳、湖北早实枳、日本枳、飞龙枳、皱皮
枳、黄岩枳、东海枳 , 除飞龙枳外 , 均为大叶类型 ; 第二类包括灌云 1号、厚皮枳、泸溪枳、永顺
枳、小叶枳、穿城 1号 , 除小叶枳外 , 也均为大叶类型 ; 第三类包括旺苍大叶枳、22号枳、东湖 1
号枳 , 为大花类型 ; 第四类包括 5号小花、84285、枣阳小花枳、7721枳 , 为小花类型。
22份普通枳遗传距离在 0～016之间。其中 , 一类中的黄岩枳、皱皮枳和东海枳 , 二类中的泸溪
枳、永顺枳、小叶枳和穿城 1号枳 , 以及三类中的旺苍大叶、东湖 1号和 22号枳 , 遗传距离均为 0,
22个 SSR位点均不能将它们区分开来 , 反映了各类内这些材料之间遗传差异很小。枣阳小花枳、
7721枳、5号小花、84285与其他枳差异较大 , 遗传距离在 014～016之间。富民枳与 22份普通枳、
枳杂种及近缘属材料的遗传距离都较大 , 分别为 0167～0171、0165～0183、0171～0190。在本研究中
旺苍大叶枳与 5号小花遗传差异较大 , 遗传距离为 0160, 从聚类图上看属不同的类群 , 而 Pang等
(2003) 应用 AFLP标记的研究则将它们聚在一起。22份普通枳材料也没有严格按地域特点进行聚
类 , 这与庞晓明等 (2003) 的研究结果一致。飞龙枳与日本枳聚在一起 , 再与大部分来自我国江浙
等东海沿岸的枳相聚 , 这与飞龙枳为日本从枳的变异中选出这一实际情况相符 , 而日本枳可能也是就
近从我国山东或江浙一带引入。
从聚类图 2还可以看出 , 富民枳聚于普通枳和枳杂种的外围 , 说明富民枳与枳的亲缘关系比枳杂
种与枳的亲缘关系更远。
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　12期 龚桂芝等 : 枳属种质遗传多样性及其与近缘属植物亲缘关系的 SSR和 cpSSR分析 　
图 2　基于核基因组 SSR标记的 35份枳属种质及其近缘属材料聚类树状图
F ig. 2　D endrogram of 35 accession s in th is study ba sed on nuclear SSR da ta
21312　基于叶绿体基因组 SSR标记的聚类分析 　
根据 7对叶绿体基因组 SSR标记的扩增数据 , 进行 UPGMA聚类分析所得的亲缘关系树状图如图
3。当遗传距离为 0172时 , 所有材料可以分 4组 : (1) 22份普通枳和简阳枳柚 ; (2) 富民枳、云南
小香橼、卡里佐枳橙、华盛顿脐橙、晚白柚、施文格枳柚、马叙葡萄柚 ; (3) 金豆 ; (4) 朱红橘 ×
枳、朱红橘、枳宜昌、宜昌橙。从图 3还可以看出 , 已知亲本的枳杂种卡里佐枳橙、朱红橘 ×枳分别
毫无差异地与其母本华盛顿脐橙、朱红橘聚在一起 ; 施文格枳柚与其母本邓肯葡萄柚的芽变马叙葡萄
柚无差异地聚在一起 ; 22份普通枳与简阳枳柚也完全无差异地为一类 , 表明简阳枳柚应为以枳为母
本的杂种来源 ; 枳宜昌远离枳而与宜昌橙、朱红橘、朱红橘 ×枳聚在一起 , 表明枳宜昌的母本来源并
非枳。
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图 3　基于叶绿体基因组 SSR标记的 35份枳属种质及其近缘属材料聚类树状图
F ig. 3　D endrogram of 35 accession s in th is study ba sed on cpSSR da ta
3　讨论
311　我国枳种质资源的遗传多样性及变异来源
长期以来 , 枳一直被认为可能是真正柑橘植物中最稳定、变异最少的种。但由于枳具有一年多次
开花、大多数枳为单多胚混合类型、自交亲和、属间杂交可育、易产生芽变等特点 , 使其仍然可能通
过有性及无性繁殖的方式产生变异。枳从我国传至国外时间不长 , 但美国鉴定出并加以命名的枳类型
达 40个以上 , 日本除早期发掘若干变种外 , 还鉴定出大叶系、小叶系、曲针系、单胚系、四倍体、
无刺系等多种类型 (郭天池 等 , 1996)。我国为枳属植物的起源中心 , 有更悠久的栽培历史 , 产生
的变异类型更为丰富。庞晓明 (2002) 采用 AFLP标记对 69份枳种质的研究 , 获得平均 28122%的多
态性比率 , 对比 Fang等 (1997) 用 RFLP及 ISSR标记检测美国保存的 48份枳材料所得到的约 10%
的多态性比率 , 认为我国现存的枳资源要比美国保存的资源含有更丰富的遗传多样性。从本研究核基
因组 SSR标记位点的平均 P IC及遗传杂合度看 , 我国的枳资源遗传多样性较丰富 , 群内变异应属中
偏高水平 , 此结果支持庞晓明 (2002) 的观点。从本研究 cpSSR标记分析可以看出 , 以母性遗传为
特征的叶绿体基因组在普通枳间无差异 , 认为我国枳属种质群内变异主要来自种内杂交、自交、及自
然突变等。虽然大部分枳变异类型都是从实生后代中选出 , 但却不能肯定变异究竟来自有性杂交还是
珠心系的无性突变 , 但由于自然条件下无性突变的概率极低 , 因此认为 , 变异可能主要还是来自有性
繁殖产生的基因重组。
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　12期 龚桂芝等 : 枳属种质遗传多样性及其与近缘属植物亲缘关系的 SSR和 cpSSR分析 　
312　富民枳的分类地位
富民枳分布于云南富民县老青山海拔 2 399～2 480 m的半山沟中。因其在形态上不同于普通枳 ,
为常绿类型 , 丁素琴等 (1984) 认为是枳属一新种。范眸天等 (1998) 通过对富民枳、普通枳及其
近缘属植物花粉形态的比较 , 认为富民枳是较枳更为原始的种类。刘利勤等 (2007) 通过对富民枳
染色体核型的研究 , 也认为富民枳是较枳更为原始的类型 , 并支持富民枳种的地位。 Fang ( 1993)
通过对富民枳、普通枳、柑橘属、金柑属 6种同工酶的比较 , 支持富民枳种的地位 , 并认为在进化过
程中 , 富民枳可能是联系枳属与柑橘属的 “桥梁 ”。庞晓明 (2003) 根据高纯合频率 SSR位点也支持
富民枳种的地位。但郭天池等 (1996) 推测可能是人为遗弃的半野生天然枳杂种。吴兴恩等 (2003)
对枳、富民枳、枳橙进行 RAPD分析认为富民枳与枳橙亲缘关系更近而与枳更远。根据本研究核基因
组 SSR分析 , 富民枳与枳杂种、普通枳、柑橘属及金柑属植物的遗传距离分别为 0175、0169、0180、
0179, 结合聚类分析发现富民枳与枳杂种和普通枳亲缘关系均较远 , 但与柑橘属及金柑属植物相比 ,
则其与普通枳的亲缘关系还是相对近些 , 因此推测富民枳不大可能从柑橘属及金柑属直接衍生而来。
从基于叶绿体基因组 SSR标记的聚类图看 , 富民枳叶绿体 DNA与普通枳差异大而更接近枸橼、柚和
甜橙 , 据此推测富民枳可能与枸橼、柚等有更相似的母系血缘或起源关系。
与庞晓明等 (2003) 的研究结果一致 , 富民枳在 22个位点的纯合频率非常高 , 达 21 /22。本研
究中还发现 , 在普通枳中 , SSR位点的纯合频率相对较高的还有枣阳小花枳、7721枳、5号小花、
84285, 分别为 10 /22、12 /22、12 /22、13 /22, 其余为 3 /22～5 /22, 其中 7721枳和 5号小花为近年的
实生选系 , 枳杂种纯合频率为 3 /22～9 /22。因为 SSR位点的遗传符合孟德尔分离规律 , 自交、回交、
种内杂交有利于位点纯合频率的提高。即便是富民枳来源于当年马帮遗弃的枳杂种 , 也应该是枳杂种
经多代自交以及长期自然选择幸存下来的类似亲本的个体。此外 , 35份供试材料中 SSR位点纯合频
率较高的还有柑橘属及金柑属材料 , 而且被认为更原始的宜昌橙 (14 /22)、云南小香橼 (17 /22) 和
金豆 (16 /22) 明显高于栽培种的朱红橘 ( 9 /22)、华盛顿脐橙 ( 8 /22) 和马叙葡萄柚 (9 /22) 等。
因此 , 本研究支持富民枳种的地位 , 并认为富民枳是较原始的种 , 但富民枳在枳属植物起源与演化过
程中究竟起什么作用仍需进一步研究。
313　枳杂种的鉴定及天然杂种简阳枳柚与枳宜昌的来源
从本研究 cpSSR分析看 , 已知亲本的枳杂种卡里佐枳橙、朱红橘 ×枳分别毫无差异地与其母本
华盛顿脐橙、朱红橘聚在一起 , 施文格枳柚则与其母本邓肯葡萄柚的芽变马叙葡萄柚无差异地聚在一
起 , 验证了通过 cpSSR鉴定某一杂种母本来源的可行性。天然杂种简阳枳柚毫无差异地与普通枳聚
成一类 , 枳宜昌则远离枳而与宜昌橙聚在一起 , 说明简阳枳柚是一以枳为母本的枳杂种 , 而枳宜昌则
不然。从聚类图 3可以看出 , 枳宜昌虽然与宜昌橙聚在一起 , 但其叶绿体 DNA遗传差异较大。造成
这种差异的原因可能有两个 : (1) 本试验所用宜昌橙是采自重庆北碚金刀峡的野生宜昌橙 , 而枳宜
昌则引自河南唐河 , 毗邻湖北枣阳 , 可能是由于不同来源的宜昌橙之间叶绿体 DNA也存在差异的缘
故 ; (2) 本试验所用的枳宜杂种来自于以宜昌橙为父本的杂种后代。从核基因组 SSR分析看 , 枳杂
种均聚于普通枳的外围 , 简阳枳柚与卡里佐枳橙和施文格枳柚聚在一起 , 与卡里佐枳橙的亲缘关系更
近。众多的研究表明 , 甜橙的起源和柚有关 (N icolosi et al. , 2000; Barkley et al. , 2006) , 结合简阳
枳柚树势强、嫩梢有毛、有部分花序花等形态特征 , 认为简阳枳柚可能是以枳为母本的天然枳柚杂
种。枳宜昌则是以枳为父本的天然宜枳杂种或宜昌橙杂种后代与枳的杂种。此外 , 不论从核基因组
SSR还是从 cpSSR聚类分析看 , 枳宜昌与朱红橘都存在某种关系 , 而朱红橘和宜昌橙都具有耐寒、有
异味的特点 , 但朱红橘是否有宜昌橙血缘 , 以及不同来源的宜昌橙叶绿体 DNA是否存在差异 , 均还
需进一步研究求证。
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
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