全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(8)：1125—1130
Acta Horticuhurae Sinica
香榧品种遗传变异与品种鉴定的 ISSR分析
戴 正 ，陈力耕h，童品璋
( 浙江大学农业与生物技术学院，杭州 310029； 青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266109； 浙江省诸暨市林业
局，浙江诸暨311800)
摘 要：利用 ISSR方法对香榧本地 9个实生品种和8个优良无性系的遗传变异和品种间的遗传关系进
行了分析，从 50个随机引物中筛选出l2条多态性引物用于正式扩增，共扩增出 104个 DNA片段，其中88
个片段为多态性扩增片段，占总扩增片段的84．6％。根据 ISSR引物的扩增图谱 ，确定部分供试品种的特
异条带。基于Nei’S遗传距离分析，利用UPGMA法构建了分子树状图。聚类结果把供试的香榧9个实生品
种和8个优良无性系分为两大组，第一组包括大圆榧 、米榧、旋纹榧 、獠牙榧、芝麻榧 、落霜榧、象牙榧，
第二组包括小圆榧、茄榧和细榧优良无性系。
关键词：香榧；ISSR；遗传变异；遗传关系
中图分类号：S 664．5 文献标识码：A 文章编号：0513．353X (2008)08．1125-06
Genetic Variation and Fingerprinting of Torreya grandis Cultivars Detected
by ISSR Markers
DAI Zheng 一．CHEN Li—geng ．and TONG Pin．zhang
(‘Agriculture and Bio—technology Colege，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China； Colege of Horticulture，Qingdao
Agricultural Unive~ity，Qingdao，Shandong 266109，China； Forestry Bureau ofzh~ji City，Zhuji，Zhejiang 311800，China)
Abstract：Inter—simple sequence repeat(ISSR)was used to determine the genomic DNA variations and
relationships in Torreya grandls Fort．Seventeen individuals including 9 cuhivars and 8 elite clones were used
in ISSR analysis．Of the 50 ISSR primers subjected to screening，1 2 produced reproducible，polymorphic and
disc—repant fragments．Using these primers，104 DNA bands were amplifed．of which 84．6％ were polymor—
phic．The average number of DNA bands amplifed by each primer was 1 1．DNA profiles based on ISSRs have
revealed potential diagnostic for various individual accessions．A dendrogram generated using the Unweighted
Pair Group Method with Arithmetic Average based on Nei’S distance showed that the Torreya grandh euhivars
were clustered into two groups．Th e first group included Dayuanfei，Mini，Xuanwen~i， Liaoyafei，Zhimafei，
Luoshuangfei and Xiangyafei，the second group included Xiaoyuanfei，Qiefei and the clone cuhivars of Torreya
grandis‘Merrillii’．
Key words：Torreya grandis Fort．；1SSR；genetic variation；genetic relationship
榧树 (Toreya grandis Fort．ex Lind1．)是裸子植物红豆杉科 (Taxaceae)榧属的第三纪孑遗植
物，为国家二级保护树种 (孟鸿飞 等，2003)。香榧 (Toreya grand~‘Merili’)是榧树中的优良
变异经人工选育后嫁接繁殖栽培的优良品种，是我国珍贵的干果果树，具有食用、药用、材用、绿化
等多种用途。在香榧 1 300多年的栽培历史中，由于多采用实生繁殖，产生了丰富的变异类型，人们
选育出了多个品种，其中以细榧的品质最佳，著名的枫桥香榧和市场上供应的香榧均为细榧类型。浙
收稿日期：2008—04—08；修回日期：2008—06—11
基金项目：教育部博士点基金项目 (20030335118)
}通讯作者 Author for corespondence(E-mail：lgchen@zju．edu．cn)
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园 艺 学 报 35卷
江省诸暨市林业局通过近20年优株选育和大批量繁殖试验，并经过新类型的比较，从中选育出8个
细榧的优良无性系。多年来，我国学者在形态学研究的基础上提出了香榧品种的不同分类系统 (马
正三，1982；刘权 等，1993；康宁和汤仲埙，1995)。20世纪 90年代以后，将 RAPD技术应用于香
榧品种分类的研究已有报道 (谭晓风 等，2002)。ISSR (inter—simple sequence repe~)分子标记 (zi—
etkiewicz et a1．，1994)在果树种质鉴定、亲缘关系分析、遗传图谱的构建和种质资源的遗传多样性
研究中得到了广泛应用 (Fang et a1．，1998；Eiadthong et a1．，1999；Luisa et a1．，2001；Sankar&
Moore，2001；邱英雄 等，2004；张青林和罗正荣，2004)。本研究利用 ISSR分子标记技术对香榧的
9个实生品种和细榧的 8个优良无性系进行了遗传变异的研究，旨在为科学准确地区分品种、品系、
类型，揭示其起源、演化关系，为香榧优良种质资源鉴定提供可靠的分子水平的依据。
1 材料与方法
1．1 植物材料及其 DNA提取
9个实生品种和8个无性系当年生幼叶 (图4)均采自浙江省诸暨市林业局香榧品种资源圃。
采用改良的 CTAB法 (Doyle，1991)提取香榧的总 DNA，用 1．0％的琼脂糖电泳检测，DNA的
浓度和纯度通过紫外分光光度计测定。
1．2 ISSR反应的条件和扩增程序
采用Mastercycler Gradient PCR仪 (Eppendorf)进行 ISSR—PCR扩增反应。经过比较和优化确定
25 L的PCR反应液含有的组分和终浓度为：约60 ng模板 DNA，1．2 U Taq酶，1．5 mmol·L
MgC1，，0．25 mmol·L～dNTPs，0．3 p~mol·L 引物，2％ 甲酰胺。PCR扩增条件：94 c预变性 5
min；94 oC变性 1 min，52 oC复性 45 S，72 oC延伸2 min，45个循环；72 oC延伸5 min。PCR产物在
含有 EB的1．5％琼脂糖凝胶中电泳，以 100 bp marker(GeneRulerl00 ladder，Fermentas UAB，Inc．)
作为 DNA标准物对照，EPSON (Japan)紫外自动成像仪照相。位点的命名由所用引物和条带大小来
确定。
1．3 扩增产物和差异带的分析方法
电泳图谱每一条带 (DNA片段)均为一个分子标记，代表一个引物的结合位点。根据各分子标
记的迁移率及其有无统计二元数据；有带 (显性)记作 1，无带 (隐性)记为0，强带和弱带的赋值
均为1。对于多态位点，仅在重复试验中稳定出现的差异带用于数据分析。根据这个二元数据矩阵，
采用 Popgene软件 (Yeh et a1．，1997)计算多态性条带比率 (PP 、观测等位基因数 (A )、有效
等位基因数 (A )、Nei’S基因多样性 ( )、Nei’S遗传距离 (D)，Shannon信息指数 (Ho)。基于
Nei’S遗传距离，利用NTSYSpc．1．80版软件的UPGMA分析品种间遗传关系。
2 结果与分析
2．1 PCR条件优化及 IsSR的引物筛选
ISSR引物是根据 British Columbia大学公布的序列设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司
合成。从50个引物中选出12个扩增条带较多、信号强、背景清晰的用于ISSR．PCR反应 (表1)，变
性温度根据引物的 Tm值变化 1～3 oC。
在其他反应条件不变的情况下，研究 25 L反应体积中模版 DNA用量在 100、80、70、60、50、
40、30、20、10 ng时 ISSR扩增的结果。从图1可以看出，当DNA用量为60 ng时，扩增的条带多并
且最清晰；而 DNA用量过多或者过少时，则 DNA条带少且不清晰。
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8期 戴 正 等 ： 香榧品种遗传变异 与品种鉴定 的 IS S R 分析 1127
表 1 IS S R 引物序 列 和 多态性 条带数
T able 1 L istof12 IS S R prim ers and polym orphic bands
obtained in the study
} R = A ／ T ： Y = C ／ G
图 2 为基 因组 D N A 的电泳结果 ， 经 紫外分光
光度计检测纯度均适合于 IS S R ． P C R 扩增 反应 。
2． 2 IS S R 扩增结果
表 1 结果表 明 ， 筛选 的 12 条 IS S R 引物对 17
个香榧品种扩增 ， 共扩增 出 104 条 D N A 条带 ， 其
中多态 性 D N A 条带 88 条 ， 占总 条带 的 84 ． 6％ 。
本研究引物扩增 的所 有条带能够 区 分供试 香榧 的
所有 品种 。 每个引物扩增 的 D NA 条带数在 5 一 17
之 间 ， 平均 1 1 条 。 条带 大小在 300 ～ 3 000 bp 之
间 。 引物 U B C 815 扩增 的 IS S R 产物图谱如 图 3 。
M l 2 3 4 5 6 7 8 9
图 1 D N A 浓度梯 度对 IS S R 反 应 的影 响
1 — 9 模板 D N A 的用 量分别为 ： 100 、 80 、 70 、 60 、 50 、
4 0 、 30 、 20 、 10 ng扩增 的 IS S R 产物 。
引物为 U B C 853 ， 品种 为旋纹榧 。
F ig． 1 E fects ofD N A concentration O H IS S R reaction
No ． 1 — 9 am the products am plied by 100 ， 80 ， 70 ． 60 ． 50
4 0 ． 30 ， 20 ． 10 ng oftem plate D N A respectively
(U B C 853 ． X uanw enfei)．
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
图 2 香榧 17 个样品 的基 因组 D N A 的 电泳结 果
1 一 】7 数字 为品种代码 ． 详 见图 4 。
F ig． 2 T he electrophoresis resultoftotalD N A of17
T orreya grandis F ort． individuals
l 一 17 stand for cuhivar code listed in F ig 4
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
3 000
2 000
l500
l200
l03 1
900
800
700
600
500
4 00
300
图 3 用 U B C 815 对香榧 9 个实生 品种 和 8 个优 良无 性 系进 行 IS S R - P C R 扩增 的谱带
1 一 17 为品种代号详 见图 4 ． M 表示 D N A 标准分子量 ． 箭头表示 品种特异性 扩增 条带 。
F ig． 3 IS S R - P C R profi es of 17 T orreya grandis F ort． in dividuals using U B C 815 prim er
1 — 17 stand for culti~，ar code listed in F ig． 4 ； M indicates D N A m arker；
T he band m arked w ith arrow is the cuhivar— specific ．
挀
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园 艺 学 报
本研究发现，3 端锚定一个碱基的ISSR引物 (如UBC 808、UBC 812、UBC 813、UBC 815、UBC
824)扩增样本 DNA的多态性位点百分率平均为 83．32％，而锚定两个碱基的引物 (如 UBC 835、
UBC 840、UBC 842、UBC 844、UBC 845、UBC 853)扩增样本 DNA的为62．48％。
2．3 香榧品种遗传变异分析
本试验的Popgene分析结果表明，17个香榧品种的Nei’S基因多样性 (H )为0．2353；Shannon
多态性信息指数 (Ho)为 0．3541；观测等位基因数 (A。)为 1．7333，有效等位基因数 (A )为
1．4057，多态性条带比率 (尸．P日)为 84．6％。说明香榧品种之间的遗传变异较大，品种资源非常丰
富。
2．4 香榧品种的DNA指纹图谱
通过对香榧9个品种和 8个优良无性系的扩增图谱分析，检测到两个品种和两个优良无性系的特
异性条带。这些特异性条带分别是：引物 UBC 812扩增的细榧 (优 1)的 1 300 bp左右的特异性条
带；引物UBC 815扩增的细榧 (优5)的 1 200 bp左右的特异性条带；引物UBC 865扩增的大圆榧的
600 bp左右的特异性条带；引物UBC 865扩增的茄榧的800 bp左右的特异性条带。以上这些指纹图
谱的特征条带可以用于香榧品种间鉴定的分子依据。
2．5 香榧品种间的ISSR聚类分析
根据 DNA扩增结果计算品种间的遗传距离，Nei’S遗传距离 (D)的范围在0．021～0．348之间。
其中细榧 (优6)和细榧 (优4)的遗传距离最近 (D=0．021)，细榧 (优 1)与大圆榧的遗传距离
最远 (D=0．348)。基于 Nei’S遗传距离，根据 UPGMA法构建了 17个香榧品种遗传关系树状图 (图
4)。从树状图可以看出，在结合线 L处，被明显地划为两组。第一组包括大圆榧、米榧、旋纹榧、
獠牙榧、芝麻榧、落霜榧和象牙榧。第二组包括小圆榧和茄榧，还有细榧优良无性系。
1大圆榧 Dayuanfei
3米榧 Mifei
7旋纹榧 Xuanwenfei
5獠牙榧 Liaoyafei
6芝麻榧Zhimafei
8落霜榧Luoshuangfei
l7象牙榧Xiangyafei
2小圆榧 Xiaoyuanfei
4茄 榧 Qiefei
9细榧 (优1)Xifei(You1)
11细榧 (优3)Xifei(You 3)
15细榧 (芽变)Xifei(Yabian)
l6细榧 (介龙)Xifei(Jielong)
12细榧 (优4)Xifei(You 4)
l4细榧 (优6)Xifei(~u 6)
13细榧 (优5)Xifei(You 5)
10细榧 (优2)Xifei(You 2)
0 O8 0．14 0I2l
遗传距离 Genetic distance
图4 香榧品种的 Nei’s遗传距离 UPGMA聚类图
1一l7为品种代码； 种子形状为圆形，其余的为长形。
Fig．4 Dendrogram ofUPGMA based onNei’s genetic distance oftrees ofTorreya grandis
No． 1—17 stand for euhivar code； $Seed shape is circular，the rest are long．
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8期 戴 正等：香榧品种遗传变异与品种鉴定的 ISSR分析
3 讨论
基因组中的SSR一般为2～6个寡聚核苷酸，用于ISSR的引物常为5 或3 端锚定的二核苷酸、三
核苷酸、四核苷酸重复序列，重复次数一般为4～8次，使引物的总长度达到20 bp左右。5 或3 端用
于锚定的碱基数目一般为 1～4个，锚定的目的是引起特定位点退火，使引物与相匹配 SSR的一端结
合，而不是中间，从而对基因组中特定片段进行扩增和检测 (邹喻苹 等，2001)。哀建国等 (2005)
在百山祖冷杉 ISSR遗传多样性的研究中发现扩增结果与引物序列和加锚位置有密切关系，3 端锚定
两个碱基的引物比锚定一个碱基的引物扩增产物的多态性要高。本试验中发现，锚定于3 端一个碱
基的引物扩增产物的多态性相对较高，如引物 UBC 808、UBC 812、UBC 813、UBC 815、UBC 824扩
增样本 DNA的多态性位点百分率平均为 83．32％；而锚定两个碱基的引物扩增产物的多态性相对较
低，如引物 UBC 835、UBC 840、UBC 842、UBC 844、UBC 845、UBC 853扩增样本 DNA的多态性位
点百分率平均为62．48％。说明在 3 端锚定一个碱基的引物比较适合香榧品种遗传变异的ISSR检测。
本结果与其他裸子植物的ISSR或 RAPD数据进行比较，表明香榧的遗传多样性 (PPB=84．6％)
比银杏 (葛永奇 等，2003) (PP日=52．27％)、水杉(李晓东 等，2003)(PPB=38．62％)和银杉
(汪小全 等，1996)(PPB=32％)的自然群体的遗传多样性高得多。说明香榧经过 1 300多年的实
生繁殖和人工选育，产生了较高的遗传变异，品种资源比较丰富，这对香榧优良品种的选育是极为有
利的。
从香榧品种遗传关系树状图可以看出，细榧的优良无性系之间的遗传距离较近，被划为一组，其
中细榧 (优2)与其他的无性系品种的遗传距离较远，说明细榧 (优 2)在 DNA水平上较其他无性
系品种已有了一定的分化。另外，细榧的8个优良无性系品种都和实生品种的遗传距离较远，说明栽
培品种细榧在长期的自然繁殖和人工选育的过程中，在 DNA水平上同其他的粗榧品种相比变异较大。
从聚类结果可以看出，传统的形态学上的分类 (圆籽型和长籽型)以及谭晓风等 (2002)的研
究结果都和本试验的DNA分子标记的分类结果完全不同。尽管谭晓风等的分类结果和传统形态学上
的分类结果基本吻合，但 UPGMA的分类结果也表明，形态学上属于长榧的茄榧、旋纹榧同形态学上
属于圆榧的聚在了一组。本试验结果显示，传统形态学上属于圆榧的小圆榧和传统形态学上属于长榧
的细榧优良无性系以及茄榧聚在一组，而原来形态学上属于长榧的米榧、旋纹榧、獠牙榧、芝麻榧、
象牙榧却和形态学上属于圆榧的大圆榧、落霜榧聚在一组，这一分类结果完全打破了传统形态学上根
据种子表型性状来分类的结果。分子聚类结果不同于形态学分类这一现象可能是由于引种交流导致了
某些地区品种基因在不同地区种质问的渗入，可能与基因漂移现象有关。
本试验检测到香榧两个实生品种和细榧两个优良无性系的特异性条带，可作为实际生产中香榧品
种鉴定的分子依据。
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