全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (5) : 1141～1144
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 11 - 18; 修回日期 : 2006 - 05 - 29
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30160074) ; 云南省科学基金重点项目 (2002C0003P)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: heyueqiu@ tom1com)
云南野生兰属主要种间亲缘关系的 AFL P分析
张俊祥 1 　李枝林 2 　范成明 1 　程少丽 1 　赵明富 1 　何月秋 13
(1 云南农业大学植物保护学院 , 云南昆明 650201; 2 云南农业大学园林园艺学院 , 云南昆明 650201)
摘 　要 : 采用 AFLP技术对云南省兰属的 14个种和 3个变种中的 38份样本进行了亲缘关系分析。16
对 AFLP引物扩增的条带聚类结果表明 , 云南省国兰遗传多样性非常广泛 , 相同品种间的不同个体扩增出
的条带模式相差很大。依据 AFLP数据 , 在相似系数 0158的水平下 , 38个兰花样品分成 3组 : 莲瓣兰、春
剑、惠兰、寒兰分为第 1组 , 建兰、豆瓣兰、春兰 , 墨兰、虎头兰、西藏虎头兰、大雪兰、碧玉兰、文山
红柱兰、长叶兰和兔耳兰分为第 2组 , 送春和蜜蜂兰分为第 3组。
关键词 : 兰属 ; AFLP; 遗传多样性 ; 亲缘关系
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0521141204
Phylogenetics Ana lysis of the Ch inese O rch ids in Y unnan Prov ince Using
AFL P Techn ique
Zhang Junxiang1 , L i Zhilin2 , Fan Chengm ing1 , Cheng Shaoli1 , Zhao M ingfu1 , and He Yueqiu13
(1 College of P lan t Protection, Yunnan A gricu ltura l U niversity, Kunm ing, Yunnan 650201, Ch ina; 2 College of Garden ing and
Horticulture, Yunnan A gricultural U niversity, Kunm ing, Yunnan 650201, China)
Abstract: Thirty2eight collections of Chinese orchids in Yunnan Province, China, including 14 species
and 3 varieties, were analyzed phylogenetically using AFLP technique. PCR amp lification band pattern with
16 pairs of p rimers indicated that the Chinese orchids were very diverse, and individuals of the same species
had different band patterns. Subgenus Jensoa appeared as a paraphyletic group. Subgenus Cyperorch is was not
a monophyletic group instead formed an offshoot of subgenus Jensoa. A t a sim ilarity coefficient of 0158, the
orchids could be clustered into 3 group s: Cybid ium tortisepa lum W u et Chen, C. tortisepa lum var. long i2
bractea tum , C. faberi and C. kancan belonged to Group 1; C. ensifolium , C. goering ii var. serra tum , C.
goering ii, C. sinense, C. hookerianum , C. tracyanum , C. m astersii, C. low ianum , C. w enshanense,
C. ery th raeum and C. lancifolium to Group 2; C. cyperifolium var. szechuan icum and C. pum ilum to Group
3.
Key words: Cybid ium ; AFLP; Genetic diversity; Phylogenetic relationship
1　目的、材料与方法
本研究以云南野生兰花为材料进行 AFLP分析 , 旨在揭示其主要种间亲缘关系 , 为其育种和系统
发育研究提供理论依据。38个供试样品包括 14个种和 3个变种 (表 2) , 引种栽培于云南农业大学园
林园艺学院温室兰花圃中。DNA的提取采用 CTAB法。AFLP分析采用 Vos等〔1〕建立的方法。利用
M se I和 EcoR I酶切组合进行基因组限制性酶切。所用的接头和引物见表 1 (上海生工 )。针对 M se I
和 EcoR I酶的接头 , 共用 16对引物进行选择性扩增。扩增后采用 4%聚丙烯酰胺凝胶和 B io2Rad电
泳设备 , 在 80W下电泳 115～210 h, 银染后于灯光下计数扩增的条带 , 并构成 0和 1数据矩阵表。
用 UPGMA方法进行聚类分析 , 采用 Percent disagreement方法得到聚类分析图。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
表 1　D NA接头和 AFL P引物的核苷酸序列
Table 1　D NA sequences of adapters and pr im ers
M se I接头和引物
Adap ter and p rimer
核苷酸序列
Nucleotide
EcoR I接头和引物
Adap ter and p rimer
核苷酸序列
Nucleotide
M se I接头 M se I adap ter 5pi2GACGATGAGTCCTGAG23pi EcoR I接头 EcoR I adap ter 5pi2CTCGTAGACTGCGTACC23pi
M se I引物 M se I p rimer 3pi2TACTCAGGACTGAT25pi EcoR I引物 EcoR I p rimer 3pi2CTGACGCATGGTTAA25pi
92H18 5pi2GATGAGTCCTGAGTAA A23pi 92R12 5pi2GACTGCGTACCAATTC C23pi
92G41 5pi2GATGAGTCCTGAGTAA TTA23pi 93B12 5pi2GACTGCGTACCAATTC AGG23pi
92G18 5pi2GATGAGTCCTGAGTAA GCT23pi 92S07 5pi2GACTGCGTACCAATTC ATA23pi
92G02 5pi2GATGAGTCCTGAGTAA AAC23pi 92S03 5pi2GACTGCGTACCAATTC AAG23pi
92G43 5pi2GATGAGTCCTGAGTAA TTC23pi 92S02 5pi2GACTGCGTACCAATTC AAC23pi
92G16 5pi2GATGAGTCCTGAGTAA GGT23pi 92S04 5pi2GACTGCGTACCAATTC AAT23pi
92G37 5pi2GATGAGTCCTGAGTAA TGT23pi 93B14 5pi2GACTGCGTACCAATTC CAC23pi
92F37 5pi2GATGAGTCCTGAGTAA AAA23pi 92S09 5pi2GACTGCGTACCAATTC GAA23pi
92F39 5pi2GATGAGTCCTGAGTAA CCA23pi 93B11 5pi2GACTGCGTACCAATTC ACC23pi
92G35 5pi2GATGAGTCCTGAGTAA TGG23pi 92S10 5pi2GACTGCGTACCAATTC TAA23pi
2　结果分析与讨论
211　种间遗传多样性
采用 M se I + 3引物和 EcoR I + 3引物各 9条 , 构成 16对引物进行选择性扩增。各引物对均能扩
增出清晰的条带 (分布在 100～1 000 bp之间 ) , 共计 851条带 , 平均每对引物扩增出 5312条带。扩
增条带数最多的为引物对 92G43 /93B11, 扩增到 80条 , 最少的为引物对 92G18 /93B12和 92G37 /
92B12, 仅扩增出 28条带。各引物对扩增出的条带多态率非常高 , 平均多态率为 9614%。不同的兰
花以及不同的样本间条带数不同 (表 2) , 表明云南省兰花样品存在很高的遗传多样性。
表 2　兰花名称、采集地点和扩增的条带数
Table 2　Nam es, collection sites and num bers of am plif ied bands of Cym bidium spp.
种类
Species
序号
Code
采集地
Collection site
AFLP条带数
Number of
AFLP band
种类
Species
序号
Code
采集地
Collection site
AFLP条带数
Number of
AFLP band
莲瓣兰 L144 昆明市 Kunm ing 433 蜜蜂兰 C. pum ilum Rolfe L74 保山市 Baoshan 494
C. tortisepalum W u et Chen L160 怒江州 Nujiang 599 L194 文山州 W enshan 504
L168 怒江州 Nujiang 584 豆瓣兰 C. goeringii L27 丽江市 L ijiang 296
春剑 C. tortisepalum var. L38 大理市 Dali 575 var. serra tum W u et. Chen L85 文山州 W enshan 329
longibractea tum W u et Chen L55 大理市 Dali 538 L87 文山州 W enshan 385
蕙兰 C. faberi Rolfe L88 大理市 Dali 503 长叶兰 L68 临沧市 L incang 298
L149 昆明市 Kunm ing 459 C. erythraeum L indl L75 思茅市 Simao 385
寒兰 C. kancan Makino L29 思茅市 Simao 514 建兰 C. ensifolium L46 思茅市 Simao 392
L201 思茅市 Simao 370 L49 思茅市 Simao 403
西藏虎头兰 L19 临沧市 L incang 236 墨兰 C. sinense W illd L11721 文山州 W enshan 309
C. tracyanum L. Castle L28 迪庆州 D iqing 291 L11723 文山州 W enshan 302
送春 C. cyperifolium var. L123 文山州 W enshan 393 碧玉兰 L6 文山州 W enshan 258
szechuanicum W u et Chen L133 大理市 Dali 440 C. low ianum Rchb. f L71 思茅市 Simao 290
L145 昆明市 Kunm ing 427 虎头兰 L9 大理市 Dali 238
大雪兰 C. m astersii L indl L7 临沧市 L incang 349 C. hookerianum Rchb. f L67 大理市 Dali 201
春兰 C. goeringii Rchb. f. L171 怒江州 Nujiang 308 L83 思茅市 Simao 172
L60 大理市 Dali 344 文山红柱兰 L118 文山州 W enshan 274
C. w enshanense. W u et L iu
L61 大理市 Dali 345 兔耳兰 C. lancifolium HookL40 思茅市 Simao 408
L62 大理市 Dali 330 L80 文山州 W enshan 317
212　AFL P聚类分析
从图 1可以看出 , 38个样品种间相似系数在 0156～0174之间。依相似系数 0158的水平 , 可以将
2411
　5期 张俊祥等 : 云南野生兰属主要种间亲缘关系的 AFLP分析 　
38个兰花样品分成 3个组。第 1组 (A) : 莲瓣兰
(L144, L160, L168)、春剑 (L55, L38)、惠兰
(L149, L88)、寒兰 (L29, L201) ; 第 2组 (B )
依相似系数 0164的水平分为两个亚组 : 第 1亚组
(B1) 包括建兰 ( L46, L49 )、豆瓣兰 ( L27,
L85, L87)、春兰 (L60, L61, L62, L171 ) ; 第
2亚组 (B2) 包括墨兰 (L11723, L11721)、虎头
兰 (L9, L83, L67)、西藏虎头兰 (L19, L28)、
大雪兰 (L7)、碧玉兰 (L71, L6)、文山红柱兰
(L118 )、长叶兰 (L68, L75 )、兔耳兰 (L40,
L80) ; 第 3组 (C) : 送春 (L123, L133, L145)
和蜜蜂兰 (L74, L194)。第 2组 (B ) 和第 3组
(C) 在相似系数 0158处聚为一类 , 所有样品在
相似系数 0156处聚为一个整体。
目前 , 各研究者对其分类的结论不尽相
同〔2, 3〕。现存的兰属分类系统是基于宏观形态学
性状、尤其是花粉块的数目以及唇瓣与蕊柱的愈
合程度而建立的〔4〕。
图 1　38个兰属样品亲缘关系树状图
F ig. 1　D endrogram of 38 sam ples of Cym bidium ba sed
on percen t agreem en t sim ilar ity
　　依据陈心启的形态分类方法 , 大花亚属与建兰亚属是一种平行关系〔2〕。孙彩云等〔5〕, 文李等〔6〕
利用 RAPD技术分析认为建兰和墨兰的亲缘关系最近。叶庆生等〔7〕利用同工酶和 SDS2PAGE技术分析
的结果与文李等基本相同。梁红健等〔8, 9〕用 RAPD技术和同工酶分析兰属 5个种 19个品种的亲缘关
系 , 认为寒兰和墨兰的亲缘关系较近。张明永等利用核 DNA的 ITS技术研究发现大花亚属为一复系
群 , 建兰亚属为一并系群 , 但未能将大花亚属的大雪兰、虎头兰、西藏虎头兰、长叶兰、碧玉兰和文
山红柱兰聚类成同建兰亚属平等关系 , 而是将其聚类成为建兰亚属的一个内部支系〔4〕。本研究将大
花亚属的虎头兰、西藏虎头兰、长叶兰和碧玉兰所有样品聚为一类 , 也将其聚类成为建兰亚属的 1个
内部支系 (B2b) , 寒兰和墨兰均属于第 2组 (B组 ) 亲缘关系较近 , 前者属于 B1a支系 , 后者属于
B2a支系。由于兰属在自然条件下 , 许多个体不是完全纯合的〔10〕, 本试验结果亦表明同一种下的不
同个体扩增出的 AFLP条带数差别较大 , 呈现出遗传多样性。由此看来 , 这些分类上的差异可能是因
不同研究者所用的样本不同所致。
莲瓣兰、送春和春剑是兰属中广为栽培但颇有争议的分类群〔11〕。吴应祥等将春剑和莲瓣兰划入
春兰种下的变种 (C. goering ii var. long ibractea tum )〔12〕。鉴于春兰叶的下部有关节 , 花序通常只具 1
朵花 , 春剑与莲瓣兰叶的下部无关节 , 花序通常具 3～5朵花 , 陈心启等又将春剑与莲瓣兰从春兰中
划出来作为莲瓣兰下的两个变种〔11〕。作者的 AFLP聚类结果表明 , 莲瓣兰和春剑亲缘关系较近 , 都被
聚类到第 1组的 A1分支中 , 而这个分支与被划分到 B2b分支内部的春兰相距较远 , 我们的 RAPD结
果也表明莲瓣兰和春剑亲缘关系最近 , 与春兰亲缘关系较远 , 支持陈心启等的形态分类结果〔11〕。Du
Puy等〔13〕认为送春与莎叶兰 (C. cyperifolium ) 更为相似。陈心启等比较了送春、蕙兰和莎叶兰的形
态特征 , 认为送春明显接近莎叶兰 , 而不是蕙兰下的 1个变种 , 将其移入莎叶兰下作为 1个变种
(C. cyperifolium var. szechuan icum )〔11〕。本研究结果表明送春 (图 1的 C1支系 ) 与蕙兰 (图 1的 A
组 ) 亲缘关系较远 , 送春不应是蕙兰下的 1个变种 , 但我们没有收集到莎叶兰 , 故送春是否属于莎
叶兰的 1个变种 , 还有待今后进一步证实。
豆瓣兰叶片宽度较春兰窄 , 通常不具有春兰的香气 , 其他性状与春兰基本相同。陈心启将豆瓣兰
作为春兰的变种。本研究将它们聚类到 B1b分枝 , 即两者在 DNA水平上的亲缘关系亦很近。陈心启
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
将兔耳兰归于建兰亚属的宽叶组 , 而吴应祥将兔耳兰定为一个独立的组〔3〕。王慧中等用 RAPD技术
分析的结果表明 , 兔耳兰与大花亚属材料属于同一组 , 但 AFLP技术分析的结果则表明兔耳兰与建兰
亚属并在同一组〔14〕。张明永等分析兰属 27个种、3个栽培品种的 DNA ITS区段序列 , 其中兔耳兰的
结果支持吴应祥的结果〔3〕。本试验 AFLP结果与王慧中的 RAPD结果一致 , 即兔耳兰与大花亚属亲缘
关系更近 , 被划分到 B2分枝内。由此看来 , 兔耳兰的系统分类定位还有待于采用更多样本做进一步
确证。
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