全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (2) : 349～355
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 06 - 16; 修回日期 : 2005 - 10 - 24
基金项目 : 长江学者和创新团队发展计划项目 ( IRT0453) ; 高等学校全国优秀博士学位论文作者专项资金项目 (200357)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: grmb@ sicau1edu1cn)
应用 RAPD 标记和细胞质基因组 PCR2RFL P技术
研究大花蕙兰的遗传多样性
甘　娜 1, 2 　谭向红 1 　陈其兵 1 　魏育明 2 　郑有良 23
(1 四川农业大学林学园艺学院 , 雅安 625014; 2 四川农业大学小麦研究所 , 成都 611830; 3 四川师范大学地理与资源
科学学院 , 成都 610066)
摘 　要 : 利用 RAPD、叶绿体和线粒体基因组 PCR2RFLP标记系统评价了大花蕙兰 20个品种的遗传多
样性。在 50个 RAPD引物分析中 , 有 36个引物 (7210% ) 能揭示材料间的多态性 , 材料间遗传相似系数
为 01503～01765, 平均 01598, 根据遗传相似系数进行聚类分析表明 , RAPD标记能将所有材料区分开。在
7个叶绿体基因组 ( cpDNA) 的 PCR2RFLP分析中 , 6个标记 (8715% ) 可扩增出 1至多条清晰的谱带 ; 扩
增产物经 7种限制性内切酶消化后 , 6个标记的 19种引物 /酶组合共检测到 53条 DNA片段 , 其中多态性片
段有 37条 , 占 6918% ; 材料间遗传相似系数变化范围为 01571～01949, 平均值为 01766。在 8个线粒体基
因组 (m tDNA) 的 PCR2RFLP标记分析中 , 只有 3个 (3715% ) 标记能得到 1条清晰的谱带 ; 利用 7种限制
性内切酶对 3个标记的扩增产物消化后 , 在 10种标记 /酶组合中 , 共检测到 33条酶切片段 , 其中 21条
(6316% ) 具有多态性 ; 遗传相似系数为 01634～11000, 平均 01829。这些结果表明 , RAPD标记揭示的大花
蕙兰遗传多样性最高 , 其次为 cpDNA PCR2RFLP标记 , 而 m tDNA PCR2RFLP标记揭示的遗传多样性最低。
关键词 : 大花蕙兰 ; RAPD; PCR2RFLP; cpDNA; m tDNA
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0220349207
Genetic D iversity in C ym bidium Ba sed on RAPD M arkers and PCR2RFL P
Ana lyses of O rganellar D NA s
Gan Na1, 2 , Tan Xianghong1 , Chen Q ibing1 , W ei Yum ing2 , and Zheng Youliang23
(1 College of Forestry and Horticu lture, S ichuan A gricu ltura l U niversity, Yapian 625014, China; 2 Triticeae Research Institu te,
S ichuan A gricu ltura l U niversity, Chengdu 611830, China; 3 Faculty of Geography and Resources Science, S ichuan N orm al
U niversity, Chengdu 610066, Ch ina)
Abstract: The genetic diversity among 20 Cym bid ium accessions was investigated by RAPD markers and
PCR2RFLP analyses of organellar DNA s. In RAPD analyses, the amp lified p roducts of 36 p rimers (7210% )
were polymorphic. The RAPD2based genetic sim ilarity ( GS) among 20 Cym bid ium accessions ranged from
01503 to 01765, with the mean of 01598. Based on genetic sim ilarity matrix resulting from RAPD makers, the
genetic relationship s among 20 Cym bid ium accessions were estimated by UPGMA ( unweighted pair group
method with arithmetic means) clustering analysis. It was found that all 20 Cym bid ium accessions could be
distinguished by RAPD markers. In cpDNA PCR2RFLP analyses, 6 out of 7 markers (8715% ) could p roduce
one or more than one distinct bands by direct electrophoresis in 2% agrose gels. After the amp lified p roducts
were digested by 7 restriction enzymes, a total of 53 bandswere detected in 19 cpDNA PCR2RFLP marker/en2
zyme combinations, among which 37 bands (6918% ) were polymorphic. The cpDNA PCR2RFLP2based ge2
netic sim ilarity ( GS) among 20 Cym bid ium accessions ranged from 01571 to 01949, with the mean of 01766.
Of the 8 m tDNA PCR2RFLP markers, 3 markers (3715% ) could p roduce one distinct band with no polymor2
phism detected by direct electrophoresis in 2% agrose gels. After the amp lified p roductswere digested by 7 re2
striction enzymes, a total of 33 bands were detected in 10 m tDNA PCR2RFLP marker/ enzyme combinations,
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
among which 21 bands (6316% ) were polymorphic. The m tDNA PCR2RFLP2based genetic sim ilarity ( GS)
among 20 Cym bid ium accessions ranged from 01634 to 11000, with the mean of 01829. These results sugges2
ted that relatively higher level of genetic polymorphism in Cym bid ium could be detected by RAPD markers,
whereas relatively lower level genetic polymorphism could be estimated by m tDNA PCR2RFLP markers.
Key words: Cym bid ium ; RAPD; PCR2RFLP; cpDNA; m tDNA
大花蕙兰是兰科兰属 (Cym bid ium ) 多年生附生性兰草本植物。关于大花蕙兰的栽培技术、繁殖
方法等方面已有较多研究〔1, 2〕, 但兰属植物变异性大 , 中间类型多 , 且至今未能解决其分类和系统学
的问题 , 给进一步杂交培育新品种带来不便。近年来 , RAPD技术已被应用于兰花等观赏植物的分类
及进化等方面的研究〔3～7〕。植物细胞质基因组包括叶绿体基因组 ( cpDNA ) 和线粒体基因组 (m tD2
NA)〔8〕。相对于核基因组来说 , 其遗传模式为简单的单亲遗传 , 较少发生重组 , 偶尔发生突变 , 序列
和结构进化速度较慢 , 可作为物种鉴定和研究种间分子进化以及系统发育的理想工具〔9, 10〕。本研究采
用 RAPD和细胞质基因组 PCR2RFLP技术 , 对大花蕙兰 20个不同的品种的品种鉴定和遗传多样性进
行系统评价。
1　材料与方法
111　供试材料
试验材料为 20个大花蕙兰品种 (图 2) , 其中 1～3号由四川省农业科学院园艺研究所提供 , 4～
20号由绵阳鲜绿果蔬有限责任公司从日本向山兰园株式会社引进的 17个品种。
112　D NA的提取
取新鲜叶片约 3 g, 在液氮中研磨成粉末 , 转入 50 mL离心管中 , 加入 15 mL预热至 65℃的 2 ×
CTAB提取缓冲液 (100 mmol/L Tris2HCl, pH 810, 2% CTAB , 2% PVP, 10 mmol/L EDTA, 012% β -
巯基乙醇 ) , 65℃水浴保温 1～2 h, 其间倒转离心管数次 , 取出离心管冷却至室温。加入等体积氯仿
/异戊醇 (24 /1) 混匀 , 3 500 r/m in离心 12 m in。取上清液加入 1 /10体积的 10%的 CTAB, 轻摇混
匀 , 加等体积氯仿 /异戊醇 ( 24 /1) 混匀 , 3 500 r/m in离心 12 m in, 取上清液加 016倍体积的异丙
醇 , 沉淀 DNA, 用针头勾出 DNA沉淀 , 用 70%乙醇冲洗 2～3次。空气中干燥后用 TE溶解备用〔11〕。
113　RAPD扩增反应
利用上海生工生物工程公司生产的 50个 10聚体随机引物对材料进行扩增筛选 , 共筛选出谱带清
晰的引物 36个。反应在 PTC2220型 PCR仪上进行。反应总体积 25μL, 含 20～30 ng模板 DNA, 012
mmol/L dNTPs, 115 mmol/L MgCl2 , 012μmol/L引物 , 1 U Taq DNA聚合酶 (上海 Promega) , 1 ×
PCR buffer (10 mmol/L Tris2HCl , pH 813, 5 mmol/L KCl)。扩增程序是 94℃预变性 3 m in后进行 50
个循环扩增反应 , 每循环为 94℃变性 1 m in, 36℃复性 1 m in, 72℃延伸 2 m in; 最后 1次为 72℃延伸
10 m in。取 20μL扩增产物 , 与 5μL溴酚蓝 (0125%溴酚蓝 , 40%蔗糖水溶液 ) 混匀 , 点入含 015
μg/mL EB的 1%琼脂糖凝胶中 , 以 1 ×TAE缓冲液为介质在 5 V /cm电场强度下电泳 1～2 h。取出凝
胶在 Amersham Phamacia B iotech公司 ImageMaster VDS凝胶成象仪上观察照相并记录。
114　PCR2RFL P反应
利用 7个叶绿体和 8个线粒体基因组通用引物对材料进行扩增筛选 , 结果仅 6个叶绿体引物和 3
个线粒体引物可扩增出稳定而明显的产物 , 其名称、序列、扩增区域与片段大小及参考文献出处列于
表 1。引物由上海生工生物工程公司合成。反应总体积 25μL, 含 100 ng模板 DNA, 012 mmol/L
dNTPs, 115 mmol/L MgCl2 , 65 ng引物 , 1 U Taq DNA聚合酶 (上海 Promega) , 1 ×PCR buffer ( 10
mmol/L Tris2HCl, pH 813, 5 mmol/L KCl)。扩增程序是 94℃预变性 3 m in; 94℃变性 1 m in, 55℃复
性 1 m in, 72℃延伸 3 m in, 40个循环 ; 最后延伸温度 72℃, 10 m in。
053
　2期 甘 　娜等 : 应用 RAPD标记和细胞质基因组 PCR2RFLP技术研究大花蕙兰的遗传多样性 　
表 1　叶绿体和线粒体 PCR2RFL P标记引物序列及来源
Table 1　The pr im er sequences and source for cpD NA and m tD NA PCR2RFL P markers
引物
Primer
序列
Sequence
类型
Type
扩增区域
Amp lified area
长度
Length ( kb)
文献
Reference
trnL2trnR
　
5pi2CGAAATCGGTAGACGCTACG23pi
5pi2ATTTGAACTGGTGACACGAG23pi cpDNA　 基因及基因间区Gene and inter2gene region 110　 〔12〕　
trnT2trnL
　
5pi2CATTACAAATGCGATGCTCT23pi
5pi2TCTACCGATTTCGCCATATC23pi cpDNA　 基因及基因间区Gene and inter2gene region 018　 〔12〕　
trnD2trnT
　
5pi2ACCAATTGAACTACAATCCC23pi
5pi2CTACCACTGAGTTAAAAGGG23pi cpDNA　 基因及基因间区 ,含 trnE和 trnY基因Gene and inter2gene region, including trnE and trnY 112　 〔13〕　
trnH2trnK
　
5pi2ACGGGAATTGAACCCGCGCA23pi
5pi2CCGACTAGTTCCGGGTTCGA cpDNA　 基因及基因间区 ,含 psbA基因Gene and inter2gene region, including psbA 118　 〔13〕　
trnS2trnfM
　
5pi2GAGAGAGAGGGATTCGAACC23pi
5pi2CATAACCTTGAGGTCACGGG23pi cpDNA　 基因及基因间区 ,含 ycf 9和 trnG基因Gene and inter2gene region, including ycf 9 and trnG 113　 〔13〕　
trnS2psbC
　
5pi2GGTTCGAATCCCTCTCTCTC23’
5pi2GGTCGTGACCAAGAAACCAC23’ cpDNA　 基因及基因间区Gene and inter2gene region 115　 〔14〕　
nad 1B2
nad 1C
5pi2GCATTACGATCTGCAGCTCA23pi
5pi2GGAGCTCGATTAGTTTCTGC23pi m tDNA　 基因及基因间区Gene and inter2gene region 112　 〔13〕　
18S 25S
rRNA
5pi2GTGTTGCTGAGACATGCGCC23pi
5pi2ATATGGCGCAAGACGATTCC23pi m tDNA　 基因及基因间区Gene and inter2gene region 112　 〔13〕　
cox1
　
5pi2CTAACCACAAGGATATTGGGAC23pi
5pi2AGTTCTCCAAAAGTATGAAAGGC23pi m tDNA　 基因Gene 115 〔15〕　
在扩增产物中加入 1 U的限制性内切酶 H infⅠ、EcoRⅠ、H ind Ⅲ、B am HⅠ、EcoR321、B suR1、
EcoR881和 Hpa ll, 37℃酶解 1 h。然后在含有 015% EB的 2%琼脂糖凝胶电泳分离中以 1 ×TAE缓冲
液为介质电泳。以 5 V /cm的电压电泳 2～3 h后 , 用 Amersham Phamacia B iotech公司 ImageMaster VDS
凝胶成像仪上观察、成像并记录。
115　数据分析
扩增产物按有带记为 1, 无带记为 0, 计算材料间遗传相似系数 ( GS)〔16〕。根据 GS值或遗传距
离 (12GS) 按不加权成对群算术平均法 (UPGMA, unweighted pair group method with arithmetic means
cluster analysis) 进行遗传相似性聚类。统计分析在 NTSYS2PC软件系统下进行。
2　结果与分析
211　RAPD结果与分析
21111　扩增片段多态性 　RAPD扩增结果表明 , 36个引物的扩增产物均能揭示材料间多态性 , 其中
图 1为引物 OPB 28的扩增结果。36个引物共得到 214条扩增 DNA片段 (表 2) , 平均每个引物能产生
519条 , 其中 199条 (9310% ) 具多态性。不同引物的扩增带数变幅从 2条到 10条不等 , 长度大小
为 200～3 000 bp。
图 1　RAPD引物 O PB28对 20份大花蕙兰材料基因组 D NA的扩增图谱
1～20: 材料序号同图 2, M: PUC19 /MSP DNA marker。下同。
F ig. 1　The genom ic f ingerpr in ts of 20 Cym bidium accession s am plif ied w ith pr im er O PB28 in RAPD ana lysis
1 - 20: The accession number as in Fig12, M: PUC19 /MSP DNA marker. The same below.
153
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
表 2　RAPD随机引物序列及其扩增结果
Table 2　The sequences of 36 random pr im ers and the ir am plif ica tion results
引物
Primers
序列 (5pi23pi)
Sequences(5pi23pi) 条带总数Total bands 多态性条带Polymorphic bands 引物Primers 序列 (5pi23pi)Sequences(5pi23pi) 条带总数Total bands 多态性条带Polymorphic bands
OPB1 GTTTCGCTCC 6 6 OPH18 GAATCGGCCA 　7 　7
OPB3 CATCCCCCTG 5 5 OPH19 CTGACCAGCC 　4 　4
OPB4 GGACTGGAGT 4 4 OPH20 GGGAGACATC 11 11
OPB5 TGCTCTGCCC 2 1 OPP1 GTAGCACTCC 　6 　6
OPB7 GGTGACGCAG 8 8 OPP2 TCGGCACGCA 　6 　5
OPB8 GTCCACACGG 5 4 OPP3 CTGATACGCC 　8 　8
OPH3 AGACGTCCAC 8 8 OPP4 GTGTCTCAGG 10 　9
OPH4 GGAAGTCGCC 9 9 OPP5 CCCCGGTAAC 　7 　7
OPH5 AGTCGTCCCC 5 5 OPP6 GTGGGCTGAC 　5 　5
OPH7 CTGCATCGTG 10 10 OPP7 GTCCATGCCA 　3 　2
OPH9 TGTAGCTGGG 4 4 OPP8 ACATCGCCCA 　3 　3
OPH10 CCTACGTCAG 6 6 OPP9 GTGGTCCGCA 　6 　5
OPH11 CTTCCGCAGT 8 8 OPP14 CCAGCCGAAC 　4 　4
OPH12 ACGCGCATGT 6 5 OPP15 GGAAGCCAAC 　4 　3
OPH14 ACCAGGTTGG 2 2 OPP16 CCAAGCTGCC 　7 　7
OPH15 AATGGCGCAG 6 5 OPP17 TGACCCGCCT 10 10
OPH16 TCTCAGCTGG 5 4 OPP18 GGCTTGGCCT 　4 　2
OPH17 CACTCTCCTC 3 1 OPP19 GGGAAGGACA 　6 　5
合计 Total 214 199
21112　遗传相似系数 　36条 RAPD引物所扩增出的 214条 DNA条带均用于计算大花蕙兰 20个品种
间的遗传相似系数 ( GS)。结果表明 , GS值变化范围为 01503～01765, 平均值为 01598。其中 ‘幸
运彩虹 ’和 ‘幸运霞光 ’遗传相似性最高 , 而 ‘璀璨 ’与其余 19个品种间的遗传相似性相对较低。
图 2　20份大花蕙兰材料基于 RAPD遗传相似系数聚类图
F ig. 2　The dendrogram resulting from RAPD ba sed2genetic sim ilar ity ma tr ix in 20 Cym bidium accession s
21113　聚类分析 　根据 RAPD遗传相似系数按 UPGMA法聚类生成 20个材料间的亲缘关系树状图
(图 2)。以平均遗传相似系数 01598为阈值 , 可将其划分为 4类。从图 2可以看出 , RAPD标记能将
所有供试的 20份材料相互区分开。其中 , ‘璀璨 ’与其它材料间差异较大 , 单独聚为 1类。‘火红天
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　2期 甘 　娜等 : 应用 RAPD标记和细胞质基因组 PCR2RFLP技术研究大花蕙兰的遗传多样性 　
鹅绒 ’、‘新月 ’、‘大花维纳斯 ’、‘幸运彩虹 ’、‘幸运霞光 ’、‘杰灵 ’、‘舞蹈家 ’和 ‘俄尔甫斯 ’
很明显地聚为 1类。‘黄金小神童’、‘红色蜜酒 ’、‘钢琴家 ’、‘莎拉 ’、‘金色梦幻 ’、‘明月 ’、‘黄
色妖姬 ’和 ‘微笑鸡尾 ’也明显聚为 1类 ; 而 ‘台北小姐 ’和 ‘月光维纳斯 ’则聚为另 1类。
212　叶绿体基因组 ( cpD NA) PCR2RFL P分析
21211　多态性 　利用 7个叶绿体基因组 ( cpDNA ) 的 PCR2RFLP标记对 20份大花蕙兰进行了分析 ,
其结果列于表 3。6个引物 (占 8517% ) 可扩增出 1至多条清晰谱带 (图 3, A ) , 利用 H infⅠ、
EcoRⅠ、H indⅢ、B am HⅠ、EcoR321、B suR1、EcoR881等 7种限制性内切酶消化后 , 6个标记的 19
种引物 /酶组合共检测到 53 条 DNA 片段。其中 , 多态性片段有 37 条 , 占 6918%。图 3, B 为
trnL2trnR扩增产物的 EcoRⅠ酶切结果。
图 3　引物 trnL 2trnR ( A) 和引物 /酶组合 trnL 2trnR /EcoRⅠ ( B) 对 20份大花蕙兰材料基因组 D NA的扩增图谱
F ig. 3　The genom ic f ingerpr in ts of 20 Cym bidium accession s resulting from trnL 2trnR ( A) and trnL 2trnR /EcoRⅠ ( B)
marker /enzym e com b ina tion
21212　遗传相似系数 　利用 6个叶绿体基因组的 PCR2RFLP标记扩增产物按 Nei的方法计算
相似系数 ( GS) , 20份大花蕙兰间 GS值变化范围为 01571～01949, 平均值为 01766。其中 ‘幸运
彩虹 ’和 ‘金色梦幻 ’遗传相似性最高 , ‘舞蹈家 ’、‘杰灵 ’、‘微笑鸡尾 ’、032024与其余 16个
品种的遗传相似性相对较低。由于叶绿体基因组 ( cpDNA ) PCR2RFLP分析中谱带较少 , 提供的信
息量有限 , 所以不做进一步的分析。
353
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
213　线粒体基因组 ( m tD NA) PCR2RFL P分析
21311　多态性 　利用 8个线粒体基因组 (m tDNA ) 的 PCR标记对 20份大花蕙兰进行分析 , 其结果
列于表 4。其中 , 3个引物 (占 3715% ) 可扩增出 1条清晰谱带 (图 4, A )。利用 H infⅠ、EcoRⅠ、
H indⅢ、B am HⅠ、Hpa ll、B suR1和 EcoR881等 7种限制性内切酶消化后 , 3个标记的 10种引物 /酶
组合共检测到 33条 DNA片段 , 其中多态性片段有 21条 (占 6316% )。图 4, B为 18S25SrRNA /Hpa ll
的扩增和酶切结果。
图 4　引物 18S25S rRNA ( A) 和 18S25SrRNA /H pa ll ( B) 引物 /酶组合对 20份大花蕙兰材料基因组 D NA的扩增图谱
F ig. 4　The genom ic f ingerpr in ts of 20 Cym bidium accession s resulted from 18S25SrRNA ( A) and 18S25SrRNA /H pa ll
( B) marker /enzym e com b ina tion
21312　遗传相似系数　利用 3个线粒体基因组的 PCR2RFLP标记扩增产物按 Nei (1979) 的方
法计算相似系数 ( GS) , 20份大花蕙兰间 GS值变化范围为 01634～11000, 平均值为 01829。其中
‘火红天鹅绒 ’和 ‘新月 ’间遗传相似性最高 , 而 ‘璀璨 ’与其它 19个材料的遗传相似性相对较
低。由于线粒体基因组 (m tDNA ) PCR2RFLP分析中谱带较少 , 提供的信息量有限 , 所以不做进一
步的分析。
3　讨论
从遗传距离来看 , RAPD标记揭示的材料间的多态性高于叶绿体基因组 ( cpDNA ) PCR 2RFLP
标记 , 而叶绿体基因组 ( cpDNA ) PCR2RFLP标记又高于线粒体基因组 (m tDNA ) PCR2RFLP标
记。这说明大花蕙兰的叶绿体和线粒体基因组比较保守 , 遗传多样性较低 , 不能作为聚类分析的
依据。
RAPD遗传相似系数划分的类群将 ‘璀璨 ’单独聚为 1类。‘璀璨 ’花深绿红心 , 属于绿花系品
种。RAPD遗传相似系数划分的类群也将 ‘舞蹈家 ’、‘幸运霞光 ’、‘俄尔甫斯 ’、032024和 ‘火红天
鹅绒 ’聚为 1类。它们都是红花系品种 , 且除 ‘火红天鹅绒 ’外都是 12月至翌年 2月 (早花型 ) 的
453
　2期 甘 　娜等 : 应用 RAPD标记和细胞质基因组 PCR2RFLP技术研究大花蕙兰的遗传多样性 　
粉红色大花型品种。这些结果说明此标记划分的类群同花色、花期和花朵类型有一定的关系。但是 ,
RAPD标记都没有将 ‘莎拉 ’和 ‘璀璨 ’这两个垂吊品种单独聚为 1类。同时 , RAPD标记也没有将
芳香的品种 ‘黄金小神童 ’、‘台北小姐 ’、‘红色蜜酒 ’和 ‘璀璨 ’单独聚为 1类。这表明根据遗传
相似系数划分的类群与大花惠兰的直立型和垂吊型没有直接联系 , 与其是否具有花香也没有直接联
系。
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