全 文 ：园 艺 学 报 2005, 32 (1) : 54～59
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 04 - 21; 修回日期 : 2004 - 06 - 17
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30060054)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: linjf@ scau1edu1cn)
应用 cDNA2AFL P技术分离草菇冷诱导表达基因
郭丽琼 1, 2 林俊芳 1, 23 杨丽卿 2 刘瑞瑞 2
(1 华南农业大学食品学院生物工程系 , 广州 510640; 2 中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室 , 海口
571101)
摘 要 : 采用 cDNA2AFLP技术筛选获得了 5个草菇冷诱导表达基因片段 VC1、VC2、VC3、VC4和
VC5。测序结果表明 , 5个 DNA片段大小分别为 247 bp、219 bp、172 bp、350 bp和 171 bp。同源性 BLAST
搜索结果显示 , VC1、VC2、VC3、VC4和 VC5片段目前都没有同源的核酸序列 ; VC1片段翻译的蛋白质序
列与粗糙脉孢菌 (N eurospora crassa) 的假拟蛋白具有一定的同源性 , VC2片段翻译的蛋白质序列与水稻的
AMP脱氨酶具有一定的同源性 , VC3片段翻译的蛋白质序列与 D anio rerio的糖原合酶激酶 3α具有较高的
同源性 , VC4片段翻译的蛋白质序列与 Leuconostoc m esen teroides的假拟蛋白有一定的同源性 , VC5片段翻译
的蛋白质序列没有搜索到同源序列。
关键词 : 草菇 ; cDNA2AFLP; 冷诱导表达基因
中图分类号 : S 64611 + 3; Q 812 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2005) 0120054206
Isola tion of Cold Stress Genes through cD NA2AFL P from V olva rie lla volvacea
Guo L iqiong1, 2 , L in Junfang1, 23 , Yang L iqing2 , and L iu Ruirui2
(1D epartm ent of B ioengineering, College of Food Sciences, South China Agricultural U niversity, Guangzhou 510640, China; 2 S tate
Key Laboratory of Tropical Crop B iotechnology, Chinese Academ y of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China)
Abstract: Five cold stress gene fragments were isolated through cDNA2AFLP from V olvariella volvacea
and were designated as VC1, VC2, VC3, VC4 and VC5 respectively. DNA sequence results indicated that
these five DNA fragments had 247 bp, 219 bp, 172 bp , 350 bp and 171 bp respectively. BLAST search re2
sults showed thatVC1, VC2, VC3, VC4 and VC5 had no significant homologous nucleotide sequences found
in databases. Postulated p rotein sequences of VC1, VC2 were homologous with the hypothetical p rotein of
N eurospora crassa and the putative AMP deam inase of O ryza sa tiva, respectively. Postulated p rotein sequences
of VC3, VC4 were homologous with the glycogen synthase kinase three alpha in D anio rerio and the hypothet2
ical p rotein in L euconotoc m esen teroides respectively. But postulated p rotein sequence of VC5 had not found the
significant homologous p rotein sequence in the databases yet.
Key words: V olva riella volvacea; cDNA2AFLP; Cold stress gene
草菇 (V olvariella volvacea) 是一种高温型的食用菌 , 在 4℃低温条件下 , 其菌丝会发生自溶而死
亡 , 子实体会发软甚至液化或腐烂〔1, 2〕。陈明杰等的研究结果表明〔3～5〕, 草菇在低温胁迫下 , 细胞内
的可溶性蛋白组分和 RNA组分都发生了变化 , 大分子量的蛋白质和 RNA组分减少 , 小分子量的蛋白
质和 RNA组分显著增加。根据这一结果 , 我们推测 , 在低温胁迫下 , 草菇的基因表达发生了变化 ,
有些基因关闭而停止表达 , 另一些基因则受低温诱导而启动表达 , 再有一些基因的表达水平可能增强
或减弱。陈明杰等利用 mRNA差别显示技术分离了草菇低温诱导的一些 DNA片段 , 但未见其 DNA序
列报道〔6, 7〕。
cDNA2AFLP技术〔8〕具有假阳性低、特异性高、重复性好等特点 , 能够在一定程度上克服常用差
1期 郭丽琼等 : 应用 cDNA2AFLP技术分离草菇冷诱导表达基因
异显示技术如 DD /RT2PCR、 cDNA2RDA、 cDNA Subtractive Hybridization等共同存在的假阳性高的问
题 , 因而已被广泛应用于植物、动物和微生物的差异表达基因的克隆分离和遗传作图方面〔9～12〕。我
们采用 cDNA2AFLP技术克隆分离草菇冷诱导表达基因 , 并对其 DNA序列进行测序和结构分析。本文
报道这一研究结果。
1 材料和方法
111 草菇菌株及其菌丝体培养
草菇菌株 V34购自华中农业大学菌种保藏中心。采用常规方法配制改良的马铃薯葡萄糖琼脂培
养基 (改良的 PDA培养基配方 : 去皮马铃薯 200 g, 葡萄糖 20 g, 蛋白胨 2 g, 磷酸二氢钾 016 g, 硫
酸镁 015 g, 琼脂 25 g, 水 1000 mL) , 高压灭菌后倒于培养皿中。每一直径 910 cm的培养皿灌注培养
基 25 mL, 凝固后铺上一层无菌硫酸纸 , 接种一块约 015 cm2 的草菇 V34菌种块 , 置于 28℃培养箱中
恒温培养。
112 菌丝体低温处理
草菇菌丝体在 28℃培养箱中恒温培养 10 d后分成 3组 , 第 1组不作预处理立即提取总 RNA , 第
2组在 4℃下处理 2 h后提取总 RNA, 第 3组在 4℃下处理 6 h后提取总 RNA。
113 草菇菌丝体总 RNA的提取和 m RNA的纯化及双链 cD NA的合成
使用 TR Izol ( Invitrogen公司产品 ) 及其说明提取草菇菌丝体的总 RNA。称取 015～110 g的草菇
菌丝体 , 在液氮中研磨至粉末 , 迅速加入 5 mL TR Izol试剂 , 拌匀后转至离心管中于室温下静置抽提
5 m in。4℃下 12000 r·m in - 1离心 15 m in, 转上清液于新离心管中 , 加 1 mL氯仿 , 混匀后室温抽提 5
m in。离心并转上清液于新离心管中 , 加 215 mL异丙醇室温沉淀 5 m in。离心后沉淀的 RNA用 1 mL
75% DEPC处理的乙醇漂洗 1次 , 离心沉淀的 RNA溶于 250μL的 DEPC处理水中 , 加 250μL的 2 ×
RNase2free DNaseⅠ处理混合液 ( 20 mmol·L - 1 Tris2HCl, pH 810, 20 mmol·L - 1 MgCl2 , 0104 U ·
μL - 1 RNase2free DNaseⅠ) , 37℃下温育 1 h以消化混杂的 DNA。加 500μL饱和酚 ∶氯仿 (1∶1) 室温
抽提 5 m in, 离心取上清液 , 无水乙醇沉淀 , 75% DEPC处理的乙醇漂洗 , 离心沉淀即得草菇菌丝体
总 RNA , 于 - 80℃下保存备用。采用 O ligotex mRNA纯化系统 (Q IAGEN公司产品 ) 及其说明从以上
提取的草菇菌丝体总 RNA中分离纯化草菇菌丝体 mRNA。采用 AMV Reverse Transcrip tion系统 ( Pro2
mega公司产品 ) 反转录合成草菇菌丝体双链 cDNA。
114 草菇菌丝体双链 cD NA的酶切和接头连接
使用 EcoRⅠ和 M seⅠ (New England B iolabs公司产品 ) 酶切草菇菌丝体双链 cDNA , 酶切产物用
Q IAquick PCR Purification Kit (Q IAGEN公司产品 ) 纯化后与 EcoRⅠ和 M seⅠ接头连接。EcoR Ⅰ接头
的两条寡核苷酸序列为 : 顶链 5pi2CTCGTAGACTGCGTACC23pi, 底链 5pi2PAATTGGTACGCAGTCTAC23pi;
M seⅠ接头的两条寡核苷酸序列为 : 顶链 5pi2GACGATGAGTCCTGAG23pi, 底链 5pi2PTACTCAGGACTCAT2
3pi, 其中 P为磷酸化碱基。两种接头的顶链和底链以相同浓度分别退火后即为 EcoRⅠ接头和 M seⅠ接
头。寡核苷酸由美国 OPERON公司合成。
115 初级模板的制备和 PCR预扩增
与两种接头连接的草菇菌丝体双链 cDNA片段稀释 10倍后即成为 PCR预扩增的初级模板。PCR
预扩增的反应体系为 : 1 ×PCR Buffer ( 10 mmol·L - 1 Tris2HCl, pH 815, 50 mmol·L - 1 KCl, 011%
Triton X2100, 不含 MgCl2 ) , 215 mmol·L - 1 MgCl2 , 200μmol·L - 1 dNTPs, 0125μmol·L - 1 EcoRⅠ预
扩增引物和 M seⅠ预扩增引物 , 215 U Taq DNA Polymerase (Q IAGEN公司产品 ) , 初级模板 5μL, 反
应总体积 50μL。PCR预扩增的反应条件为 : 94℃预变性 5 m in; 循环参数为 : 94℃变性 30 s, 52℃退
火 45 s, 72℃延伸 1 m in, 20次循环 ; 72℃后延伸 6 m in。EcoRⅠ预扩增引物的序列为 : 5pi2GACTGCG2
TACCAATTCN23pi; M seⅠ预扩增引物的序列为 : 5pi2GATGAGTCCTGAGTAAN23pi, 其中 N为 A、C、G、
55
园 艺 学 报 32卷
T的任一碱基。EcoRⅠ和 M seⅠ的预扩增引物由美国 OPERON公司合成。
116 次级模板的制备和 PCR选择扩增
PCR预扩增产物稀释 50倍后即为 PCR选择扩增的次级模板。PCR选择扩增的反应体系与预扩增
的反应体系相同 , 但扩增引物改变为 EcoRⅠ和 M seⅠ选择扩增引物 , 扩增模板改变为次级模板。选择
扩增反应采用 Touchdown PCR进行 , 反应条件是 : 94℃预变性 4 m in; 前 13个循环 94℃变性 30 s,
65℃ (每一循环降低 017℃) 退火 35 s, 72℃延伸 1 m in, 13次循环 ; 后 23个循环 94℃变性 30 s,
56℃退火 35 s, 72℃延伸 1 m in, 23次循环 ; 随后 72℃继续延伸 6 m in。EcoRⅠ选择扩增引物的序列
为 : 5pi2GACTGCGTACCAATTCNN (N) 23pi; M seⅠ选择扩增引物的序列为 : 5pi2GATGAGTCCTGAGTA2
ANN (N ) 23pi, 其中 N为 A、C、G、T的任一碱基 , (N ) 为有或无这一个碱基。EcoRⅠ和 M seⅠ的选
择扩增引物由美国 OPERON公司合成。
117 PCR选择扩增产物的差别显示和差异条带的回收
PCR选择扩增产物采用 118%的琼脂糖 ( SIGMA公司产品 ) 凝胶电泳和溴化乙锭染色进行差别
显示。DNA差异条带的回收采用 Q IAquick Gel Extraction Kit (Q IAGEN公司产品 ) 及其说明进行。
118 D NA差异条带与质粒载体的连接及其转化大肠杆菌感受态细胞
回收的 DNA差异条带与 T2easy载体 ( Promega公司产品 ) 连接后 , 转化大肠杆菌 DH5α感受态
细胞 , 37℃培养过夜。连接反应参照 T2easy载体试剂盒说明进行。大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备
及其转化参照文献 〔13〕进行。
119 转化子插入片段的酶切鉴定和 D NA差异片段的 Northern杂交
挑取白色单菌落 , 提取质粒 , 酶切鉴定插入片段。选取大小正确的插入片段作为探针进行 DNA
差异片段的 Northern杂交。草菇菌丝体培养和低温处理按照上述方法进行 , 菌丝体总 RNA的提取采
用上述的 TR Izol方法进行。RNA甲醛变性凝胶电泳分离、印迹转移、尼龙膜 ( Hybond2N + , Amer2
sham公司产品 ) 紫外交联 (UV CrossL inker, Stratagene公司产品 ) 参照文献 〔13〕进行。探针标记、
预杂交、杂交、洗膜和显色采用 D IG DNA Labeling and Detection Kit (ROCHE公司产品 ) 及其说明进
行。
1110 D NA特异片段的序列测定
挑取含有插入特异片段的质粒进行 DNA 序列测定。质粒提取采用 Q IAp rep Sp in M inip rep Kit
(Q IAGEN公司产品 ) 及其说明进行。插入特异片段的 DNA序列测定由上海联合基因公司完成。
1111 D NA特异片段的序列同源性搜索与相似性比对
采用美国国家生物技术信息中心 NCB I的 blastn和 blastx两种 BLAST程序进行 DNA特异片段的序
列同源性搜索与相似性比对。
2 结果与分析
211 PCR选择扩增产物和 D NA差异条带
共采用 16种 EcoRⅠ选择扩增引物和 12种 M seⅠ选择扩增引物 , 进行了 196次选择扩增。扩增获
得 5个 4℃低温处理诱导表达的 DNA差异条带 , 分别命名为 VC1, VC2, VC3, VC4和 VC5。有些选
择扩增的产物为 DNA弥散团 (图 1, Ⅰ, 图未全附 ) , 没有 DNA条带出现 ; 还有些选择扩增的产物
虽有 DNA条带 , 但不同处理间的 DNA条带带型相同 (图 1, Ⅱ, 图未全附 ) ; 只有一部分选择扩增
的产物出现了不同的 DNA带型 , 4℃低温处理的样品选择扩增出了差异的 DNA条带 (图 1, Ⅲ、Ⅳ、
Ⅴ, 图未全附 )。
212 D NA差异片段的特异性
DNA差异片段的 Northern杂交结果表明 , 采用 cDNA2AFLP方法所获得的 DNA差异片段只有在特
定的低温处理条件下表达。DNA差异片段 VC1、VC4、VC5只有在低温处理 6 h的草菇菌丝体中表
65
1期 郭丽琼等 : 应用 cDNA2AFLP技术分离草菇冷诱导表达基因
达 , 而低温处理 2 h和未经低温处理的均未表达 (图 2, Ⅰ、Ⅲ; 图未全附 ) ; DNA差异片段 VC2、
VC3在低温处理 2 h和低温处理 6 h的草菇菌丝体中表达 , 而对照未表达 (图 2, Ⅱ; 图未全附 )。说
明本研究所获得的 DNA差异片段是草菇低温诱导表达的特异性片段。
图 1 PCR选择扩增产物电泳图
M: DNA Marker, 大小为 ( bp) ; M1: 1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100; M2: 15000、10000、7500、5000、
2500、2000、1000、750、500、250、100; M3: 2000、1000、750、500、250、100. N. 对照菌丝 ; T. 在 4 ℃下处理 2 h的菌丝 ;
S. 在 4 ℃下处理 6 h的菌丝。Ⅰ. 不同处理间的选择扩增的产物为 DNA弥散团 ; Ⅱ. 样品选择扩增出的 DNA条带带型相同 ;
Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ. 样品选择扩增出差异的 DNA条带。
F ig. 1 Electrophoresis of PCR selective am plif ica tion products
M: DNA Marker ( bp) ; M1: 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100; M2: 15000, 10000, 7500, 5000,
2500, 2000, 1000, 750, 500, 250, 100; M3: 2000, 1000, 750, 500, 250, 100. N, T, S: results of samp les from
control mycelium, mycelia treated at 4 ℃ for two hours and six hours respectively. Selective amp lification p roducts in different.
treatments: Ⅰ is DNA smear; Ⅱ is the same DNA band type; Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ are difference DNA band.
图 2 D NA差异片段的 Northern杂交结果
上图 : Northern杂交结果 ; 下图 : RNA电泳图。N. 对照菌丝 ; T. 4 ℃处理 2 h的菌丝 ; S. 4 ℃处理 6 h的菌丝。Ⅰ. 以片段 VC1
为探针的 Northern杂交结果 ; Ⅱ. 以片段 VC2为探针的 Northern杂交结果 ; Ⅲ. 以片段 VC5为探针的 Northern杂交结果。
F ig. 2 Northern blot ana lysis of d ifferen tia l D NA fragm en ts
Upper Fig. : Northern B lotting; Bottom Fig. : RNA loading amount control. N, T, S: results of samp les from control mycelium, mycelia
treated at 4 ℃ for two hours and six hours respectively. Ⅰ. Northern B lotting with VC1 p robe; Ⅱ. Northern B lotting with VC2 p robe;
Ⅲ. Northern B lotting with VC5 p robe.
213 D NA特异片段的碱基序列
将 VC1, VC2, VC3, VC4, VC5 DNA特异片段的 DNA序列测定结果列于表 1。DNA特异片段长
度分别为 247、219、172、350和 171 bp, 其 GC含量分别为 52123%、48140%、50100%、51171%
和 43186%。
214 D NA特异片段的序列同源性
blastn和 blastx两种 BLAST程序进行的 DNA特异片段序列同源性搜索结果列于表 2。5个 DNA片
段都没有发现同源的核酸序列。VC1、VC2、VC3、VC4片段翻译的蛋白质序列分别与粗糙脉孢菌
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园 艺 学 报 32卷
(N eurospora crassa) 的假拟蛋白、水稻的 AMP脱氨酶、D anio rerio的糖原合酶激酶 3α、L euconostoc
m esen teroides的假拟蛋白有一定的同源性。VC5翻译的蛋白质序列没有搜索到同源序列。
表 1 D NA特异片段的碱基序列及其 GC含量
Table 1 Nucleotide sequences and the ir GC con ten t of D NA fragm en ts
DNA片段
DNA fragments
核酸序列
Nucleotide sequence
片段大小
Length ( bp)
GC含量
GC content( % )
VC1
ACATGCCTATGGTCTGTGATGGGGTTACGGATGCAATTTCTTTCAATATGTCATCCTCCGGCA
GAGGAAGCGCGCCTACCATTACGAATGTGCAGTGCGGGAATGTCACGGACGCCGATCCTTC
AAGGATTCCTGGGGGCGATGTTTCAGTCTGGAGATGGAGTGCTACGTTGACCAACTTCCCTG
ATGGTGTTCTAAGAATAACGGTTTCTAATCCACCTGCTGCAGGCAACGCCAGCACAGGGGT
247
52123
VC2
GCTGAGAACGGTAACTGGGATGGGCCTTGGCCATGGCCCTGGAATATTTGCACCTCATTCTG
GGGGCGATCTTCATTACTTGAGGTATCTCCTCCCTGAACATTTTTCCTGGCCTGTCCAGGTGT
TGGGTCCCTTTCTACTATTCCCGGAGTGTCACCACTCACAACAGGAGAAGTAGAATCGGTAA
TAAAAGTTGGATCAGAATCGGGTATTTCGTCA
219
48140
VC3
TTGGTATTATCGTCATTTAGGTTTTCCGACCACGCACGGCCCCGGAGGCAATTGACCTCGTGT
CAAAGTTATTGGAGTATACGCCTTCTGCTCGTCTTAGCGCGATAGAGGCGATGATTCATCCGT
TCTTTGACGAATTGCGGGCCGAAGGCGCAAGAATGCCAAATGGTAA
172
50100
VC4
ACTTGGAGATGTTGGCTGACCCCAGAGGGTGTTGCACCAGTCATCCACGTCTTTCAACGATCG
GTCACGCCCGACGACCTCCCGAGCAATATGATATAATTCACGAAGGTCGACTGCTTCGGTCC
ACGCCCGATCCACTGCGCGATACACCTTCACAATACGAGGAAAGCGAAGCTCGTAATGCTTT
TCCCGATCAGAACGATGTACTTGCCGAATGCGTGTGCGCTTACCTTACTCCGTGGGGCTTTTG
TGAAGCCCGCACCGCATATTTCCGCCAATATCGGTACATTCAGAACAATACTAGGAGGGGCA
AGAGTAGATAGGAGGGTAAGATCATAAGATAGTCCACC
350
51171
VC5
ATCGACTGATCTAGGGCGATGTTCTCTTTGCTGATGTCGATGAACTCAAAATTTTGTGATTCTT
TGGGTTAGGTATGATGAACTCCATCCCAGTGAGCAAGCGAACAGGATTGTTGCGCGAGAAAT
AGCGCAGGTTATTCAAGGCAAACAAAATCGGTGGACAACTTGGTT
171
43186
表 2 D NA特异片段的序列同源性
Table 2 Sequence hom ology of spec if ic D NA fragm en ts
DNA片段
DNA fragments
核酸数据库搜索
B lastn
核酸 - 蛋白质数据库搜索
B lastx
VC1
没有搜索到同源序列
No significant homology found
假拟蛋白 (粗糙脉孢菌 ) Hypothetical p rotein (N eurospora crassa)
同源率 Identities = 30 /79 (37% )
相似率 Positives = 47 /79 (59% )
VC2
没有搜索到同源序列
No significant homology found
AMP脱氨酶 (水稻 ) Putative AMP deam inase〔O ryza sativa ( japonica cultivar2group) 〕
同源率 Identities = 22 /70 (31% )
相似率 Positives = 31 /70 (44% )
VC3
没有搜索到同源序列
No significant homology found
糖原合酶激酶 3α Glycogen synthase kinase 3α(D anio rerio)
同源率 Identities = 34 /50 (68% )
相似率 Positives = 38 /50 (76% )
VC4
没有搜索到同源序列
No significant homology found
假拟蛋白 Hypothetical p rotein (Leuconotoc m esenteroides subsp. M esenteroides ATCC8293)
同源率 Identities = 22 /64 (34% )
相似率 Positives = 33 /64 (51% )
VC5
没有搜索到同源序列
No significant homology found
没有搜索到同源序列
No significant homology found
3 讨论
Northern杂交结果证明 , 本研究克隆分离的 5个 DNA差异片段均是草菇菌丝体低温诱导表达的
特异片段 , 这说明 cDNA2AFLP技术克隆分离差异表达基因具有特异性强、重复性高的特点。与前人
的研究报道相一致〔10, 14, 15〕。Money等采用该技术 , 比较了不同批次合成的 cDNA经过 10种不同的
M seⅠ选择引物扩增所产生的条带 , 结果是不同批次的选择扩增结果完全一致〔14〕。Habu等用同一矮
牵牛植株上的不同花芽的 RNA进行 cDNA2AFLP重复试验 , 14个差异条带在不同批次试验中的重复
率达 100%〔15〕。Fukuda等的研究结果也证明 , cDNA2AFLP技术的特异性和重复性高于 95%〔10〕。
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1期 郭丽琼等 : 应用 cDNA2AFLP技术分离草菇冷诱导表达基因
本研究克隆分离的 5个 DNA特异片段的大小为 171～350 bp之间 , 片段偏短。其原因可能有二 :
一是本研究所采用的 cDNA2AFLP技术中进行 cDNA酶切的酶为典型的 EcoRⅠ和 M seⅠ两种酶 , 这样
经过两种酶切成的 cDNA模板片段可能较短 ; 二是草菇基因组较小 (约为 25 Mb) , 而本研究在进行
选择扩增时所使用的引物至少包含有两个选择性核苷酸。
本研究克隆分离的 5个 DNA特异片段都没有搜索到同源的核酸序列。但它们翻译的蛋白质序列
分别与一些生物的假拟蛋白、α21, 3葡聚糖合酶、AMP脱氨酶、糖原合酶激酶 3α、转位酶序列具有
较高或一定的同源性 , 这可能意味着草菇细胞中的这些蛋白或酶与低温胁迫应答有关。
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