全 文 ：第 1卷 第 3期
19 92年 9月
激 光
L A SR E
生 物 学
B I OL O G Y
V ol
.
1付0 . 3
S eP
。
1 9 92
草菇( V olv ar iell av olv a c e a )、 银丝草菇
( V
.
b o mb y e in a )原生质体分离研究
李东屏 张志光
( 湖南省生物研究所 , 长沙 )
摘 要 本文对草菇 、 银丝草菇菌丝原生质体制备的最佳条件作了探讨 。 结果表明 , 培养两
天的草菇菌丝 , 以o . SM K C I或 o . SM M g S O ` . , H : O作渗 透压稳定剂 , 2 . 5% L y w a l l z y m e ( v /
m ) , 3 5℃ 下酶解 1 . 5一 2 小时 ,原生质体产量可达 1 . 5 X 10 。个 / m l以上 ; 培养 3 天的银丝草菇菌
丝 , 以。 . SM K C I作渗透压稳定剂 , 1 . 5% L y w al l z y m e , 28 ℃酶解 2 一 3 小时 , 原生质体产量可
达 2 . 8 x 10 e个 / m l以上 。 此研究对以后的原生质体融合育种打下了基础 。
关键词 草菇 , 银丝草菇 ; 原生质体
分类号 5 6魂6 , Q 9 4 3
现代细胞工程技术为培育优 良菌种展示了广阔的前景 , 真菌细胞的原生质体不仅是细胞
杂交的 良好亲本 , 而且是外源基因转移的理想受体 。 原生质体能超越性细胞的一些不亲和障
碍 , 为较远缘的真菌细胞杂交提供了融合亲本。 本实验筛选出了草菇 、 银丝草菇原生质体分
离的最佳条件 , 为后期的融合工作打下了基础 。
1 材料与方法
1
.
1 菌种
浏阳草菇〔V o l v a r i e l l a v o l v a e e a ( B t: 11. e x F r . ) S i n g . 〕 , 菌种由本室提供简称 V ; 银丝
草菇〔V . b o m b y e i n a ( s e h a e f f . e x F r . ) s i n g . 〕 , 菌种由河北省微生物所提供 , 简称V 。 。
1
.
2 菌丝生长培养墓
工 : 马铃薯20 % , 葡萄糖 2 % ; 韭 : 马铃薯20 % , 葡萄糖 2 % , 10 %稻草浸煮液 ; l :
马铃薯 20 % , 麦芽糖 2 % ; V1 : 马铃薯 20 % , 可溶性淀粉 2 % , V ; 蛋白陈 0 . 2% , 葡萄糖
2 %
, 酵母膏。 . 2% 。
1
.
3 醉及醉液的配制
溶壁酶 ( h y w a l l` y m e ) , 广东微生物所 ; 纤维素酶 ( C e l l u l a s e s # O N O Z U K A # , R
一
1 0 )
, 日本 , 蜗牛酶 ( H e l i e a s e s ) 中科院生物物理所 , 溶菌酶 ( L y s o z y m e ) , 上海东
风试剂厂。
称取一定量酶 , 用渗透稳定剂溶解 , 无菌快速滤纸过滤 , 再用细菌过滤器除菌 , 低温冰
箱保存 。
1
.
4 渗透压稚定荆
本文收稿 日期 : 19 02一 07一 2 5
第 3期 李东屏 : 1{l:龙、、 ( V ol v r o i el l ;、 v ol v : 、 e。 :` )、个陡丝草菇( V .J f。 , n b y e i o a )原生质体分离研究 1忍7
各种浓度的M g S 0 4 t 7 11 2 0 、 N a C I、 K C I、 1士露醉 、 11一梨醉 、 蔗糖溶液 。
1
.
5 菌丝培养法
1
.
5
.
1 三角瓶液体培养 菌丝接种于盛液体培养墓的三角瓶中 , 摇床上振荡培养一天 , 再静
止培养一天后 , 可用于分离原生质体 。
1
.
5
.
2 玻璃纸平板培养 菌丝接种于玻璃纸平板上培养两天 , 用于原生质体分离及释放过程
观察 。
勺. 6 原生质体分离 、 纯化
取培养 2 一 3 天的菌丝 , 用三层纱布过滤并用无菌渗透压稳定剂冲洗 2 一 3 次 , 得到湿
干菌丝 。 3 克左右菌丝加酶液 10 m l , 35 ℃酶解 2 一 3 小时后用纱布加少量脱脂棉过滤 , 离
心 ( 3 5。。 r / m in ) 10 分钟 , 去上清液 , 沉淀用渗透压稳定剂稀释 , 再离心 , 重复二次 , 最后
即可得到较为纯净的原生质体。 实验前原生质体用荧光增白剂检查去壁是否完全 , 以荧光素
双醋酸酷确定原生质休的活力 。 原生质体计数用血球计数板进行。
2 实验结果
2
.
1 原生质休的释放过程
草菇菌丝在35 ℃ , 银丝草菇菌丝在 26 ℃ 下酶解 5 分钟后即开始释放原生质体 。 刚开始是
顶端释放 。 顶端细胞的尖端细胞壁被溶解后 , 原生质被膜分解包裹 , 并从缺口挤了出来 。 由
于缺乏壁的保护和表面张力变化 , 原生质体变成球形 。 一般草菇从一个缺 口可释放 1 一 3 个
原生质体 , 而银丝草菇则一般是 2 一 5 个 。 释放过程中可见相邻原生质体发生 自然融合现
象 。 约半小时后 , 可观察到一些菌丝侧面产生很多空洞 , 原生质体从侧位释放出来 。 一些菌
丝则细胞横隔溶解而释放出原生质体束来 。 随着酶解时间的延长 ,大部分菌丝断裂 ,此时可见
短菌丝一端或两端释放原生质体 。 至酶解比较彻底时整条菌丝的细胞壁被溶解 。 此时 , 可见
许多原位释放的原生质体 。 原生质体一般 6 一 18 协m , 平均 12 件m , 极少数可达 25 林m 。 原
生质体在酶液中逐渐增大液泡 , 从而使体积增大 。
2
.
2 菌龄与菌丝 t
菌龄对原生质体释放的影响很明显 , 幼嫩菌丝所得原生质体产量较高 , 超过一定菌龄的菌
丝 ,就很难制取原生质体 。 但在一定的时间范围内 , 菌龄对原生质体产量影响不大 , 这时用来
酶解的菌丝量明显影响原生质体产量 。 兼顾二者 , 以草菇培养二天 ,银丝草菇培养三天为宜 。
( o
.
SM K C I作渗透压稳定剂的酶液 ( 1 5 m g / m l , 溶壁酶 )每毫克酶与 Z o m g菌丝一起培养 。
〔二二二二 代表银丝菇
已乙乙三Z 代表草菇
〕 〕
4 8 6 0 7 2 8 4 (卜r )
原生质体释放蚤(xl。沪个\日一)
王慈养汁+间
图 1 草菇和银 丝草菇菌龄对原生质体释放量 的影响示意 图
2
.
3 醉系的选择
用不同的酶来制备原生质体 , 发现溶劈酶的效果最佳 。 溶菌酶 、 蜗牛酶儿乎对草菇和银
拙8 激 光 生 物 学
丝草菇不起作用 ;溶壁酶和其他酶混合使用 ,
考虑 , 我们最后用溶壁来制备原生质体 。
2
.
4 酶液浓度
表 1 采用不 a1J 晦制备草菇 、 银 丝草菇
原生质体 的效果
鹰一一一三壑些迁竺仁丝些竺:竺望竺一一_万 中 名 英 名 v v b
I 溶壁酶 1 . 6拓 L y w a l l z y m e 15 2 8
I 蜗牛酶 1 . 5拓 H e l i e a s e s 0 0
I 纤维素酶 1 . 5男 C e l l u l a s e s 1 . 2 1 . 0
万 溶菌酶1 . 5男 L y s o : y m e 0 0
V l l 拓+ 1 0 . 5男+ 1 0 . 6拓 一 1 5 . 2 28 . 1
砚 1 0 . 5拓 + 1 1拓+ V 0 . 5万 一 2 . 3 3 . 2
产量会有所增加 ,
第 1卷
但幅度不大 。 为经济和方便
表 2 不同酶浓度时原生质体产量的影响
酶浓度 ( 拓 ) 原生质体个数 ( 1的个 /
m l)
2
。
5
2
。
0
1
.
5 2
.
8 1
.
5
1
.
0 1
.
5 0
.
7
0
.
7 0
.
1 0
.
1
0
.
5 0
.
1 0
.
1
使用溶壁酶 , 以 1 . 5%浓度较为适宜 。 若浓度太高 , 易使原生质体变形 , 甚至破裂 , 产
量反而下降 , 也不经济 ; 浓度太纸 , 破壁困难 , 则原生质体产量不足 。
2
。
5 渗透压趁定荆
渗透压稳定剂的种类和浓度对原生质体分离影响极大 。用 K CI 、 M g s o ` · 7 H : o 、 N a CI 、
蔗糖 、 甘露醇和山梨醇等作渗透压稳定剂进行过大量酶解对比实验 , 结果以 0 . S M K CI 作等渗
剂制草菇和银丝草菇原生质体效果最佳 , 以。 . SM m g S O 4 · 7 H : 0 制草菇原生质体 , 效果也相
当不错 。
表 3 不同渗透压稳定剂对原生质体产量的影响二下
K C I
N a C!
M g SO ` · 7H 2 0
蔗 糖
甘 露 醇
山 梨 醇
0
.
3 M 0
.
3 M 0
.
4M 0
.
4M 0
.
5M 0
.
5M 0
.
6M 0
.
6M 0
.
7M 0
.
7M
V V b V V b V V b V V b V V b
3 0 8 8 1 97 2 1 3 2 0 3 2 5 1 1 6 8 2 08 肚 了2
8 1 9 8 3 1 1 4 8 0 1 0 8 7 2 丫8 10 2 2
101 1 3 1 90 6 2 19 8 1 02 18 1 1 30 3 2 2 0
5 7 7 0 1 3 5 1 7 1 1 3 2 1了0 1 2 0 1 50 1 6 2 6
1 3 1 5 2 9 3 5 7了 8 0 7 2 8 5 2 1 2 9
6 7 5 6 8 4 6 0 9 2 4 7 了8 7 1 0
. . . . . .州 . . . . . . . . . , ` . . . . . , . . , , , 二. . 目. . . , , 奥. . . . . .二. . . 曰. . .曰口曰 . . 璐目 . 曰 . . . 色硬晌 . ~ ` r , 巨 . , . 口 , 军. . . . 由细 . . 睁 , , . . ` . . . . . 曰 . . , . . . , . . . 门 . . . . . . . . 叫 . ` . . . ” . . . . . . , .口 勺. 目口州 . . 斗 . .` 吮 . . 侧 . , . . . . , .州曰“ . 曰` . .
表中数据为1 0个周定视野巾原生质休个数的平均数
/ 公
一
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/ /一 ` 、 \ 犷_ _ _ _ 一圣二、 \ 减一 - 一一一 :戈少 K C I如 K C I X”一卜 M g S O .一 , 卜度9 5 0 ; 石`ǎ杀今续圈州璐)
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_ _ _一 _ _ _— 一口 . 3 0 . 4 0 石 0 6 一一一 -一一~ -月卜 MO。 7
采用两种渗透压 稳定剂的原生质体释放 曲线 图
第 3 期 李东川 :草成 ; ( Vo l va rio l lau v l vo e e :、 )、 惬仗丝草了 :!结 ( V .!, u J ,i b y c i ,, : ` ) !弓(生质休分高扣J岁乙
2
.
6 酶解温度
酶解温度对原生质体分离也有一定影响。 草菇较适宜的温度是 34 ~ 35 ℃ , 银丝草菇则以
28 ~ 30 ℃为好 。 温度较低时 , 原生质体产量减少 , 温度太高时 , 则原生质体变形较多。
2
.
7 酶解时间
用酶液处理菌丝几分钟即开始释放原生质体 , 释放速度逐渐加快 , 草菇 1 . 5~ 2 小时即
达高峰期 , 银丝草菇 2一 3小时后达高峰期 , 之后有几个小时的稳定期。 但酶解时间太长 ( 超
过 8 小时 ) 产量反而下降 ,
2
.
8 培养基的选择
这可能是早期原生质体破裂所致 。
在 工 、 五 、 1 、 w 、 V号培养基
上培养菌 丝 , 然 后用溶壁酶酶解脱
壁 , 结果表明 , 培养基不同 , 菌丝所
形成的原生质体数 目也不相同。
图表中可以看出 , 亚号 培 养 草
菇 , V号培养银丝草菇效果好 。
匕 一 一 一 一 补 V 今
一 一 一卜 V
一寸 -一士一一一刁勺 ( h r )
ǎ一氏\令乞叫é八代喇址鹭州唱à
3 讨论
影响原生质体形成的因素很多 。 首先 ,
用于培养菌丝的培养基的成分不同能使原生
质体的获得量表现差异 。 本实验用稻草浸煮
液培养草菇菌丝以及 C Y M 培 养银丝草菇其
他条件相同的情况下原生质体释放量 占明显
优势 。 可能由于培养基成分不同导致了新合
成细胞壁的结构差异 , 这种微小的差异 又引
起对酶敏感度反应不一 , 从而使菌丝细胞释
放的原生质体量有差异 。
其次菌丝体的菌龄对原生质体释放的影
图 3
表 4
释放时间
不同时间的原生质体释放 曲线图
不同培养基的原生质体形成数 目表
酶解时间 ( 分 )
莽 3 0 6 0 90 120 15 0
基 - -一— -一— — — —V V b V V b V V b V V b V V b1 6 2 8 3 1 09 16 9 1 5 6 1丫0 1 5 9 18 2 16 1 183
O曰nO臼九
万 6 7 04 1 1 2 1 7 4 1 5 8 19 0 16 7 2 1 9 16 9 2 2
V 7 1 1 0 3 12 8 19 9 1丫0 2 3 2 18 1 2 4 6 1 8 0 2 4
响主要也在于壁的成份和结构发生了变化 。 酶解时 , 首先菌丝顶端见到原生质体释放 , 因为
尖端部分是新合成的壁 , 成份相对简单 , 壁也相对薄些 。 随着菌龄的增加 , 壁不断沉积色素
等生物质 , 阻碍了酶的作用 , 使壁难以解体释放原生质体 。
用酶法破壁制取原生质体 , 酶的作用无疑是关键的。 不同种或者同一种不同分布区域的
菌体 , 其细胞壁的结构就可能存在差异而需要不同的酶系统 。 而且 , 酶的质量 、 纯度对原生
质体的形成有非常大的影响。 担子菌细胞壁的主要成分是几丁质和甘露聚糖 , 还有少量蛋白
质 、 类脂 、 无机盐和其他物质 。 现 已有多种破除真菌细胞壁的酶类 , 一般用混合酶类比单一
酶效果好 。 本研究中单独使用蜗牛酶 、 溶菌酶效果极差 , 而用溶壁酶 ( 为一种混合酶 ) 能达
到令人满意的效果 。
第三 , 渗透压稳定剂是原生质体形成和稳定的重要因素 。 据 J . F . P e b e r d y报道 , 作为渗
透压稳定剂 , 无机盐较糖和糖醇对丝状真菌更合适 , 本实验证实了该观点 。 渗透压稳定剂的
种类和浓度对原生质体分离的影响极大 。用 0 . 6M K C I作等渗剂时 , 可发现草菇顶端细胞有些
从尖端流出原生质 , 而不形成原生质体 , 可能是高渗透压使膜承受不住破裂所致 。 用 o . SM
K C I作等渗剂时 , 可发现一个菌丝细胞释放多个原生质体 , 尤 以银丝草菇为甚 。 而用。 , SM -
13 0
激 光 生 物 学 第 1卷
一一 一_ 一一一 一一 一一一 ~一一 目一一一一一 .一一一一一 一一 一一一一一 ~一一一 ~m g S O ` .7 H 2 0作渗剂时 , 草菇细胞很多只释放一个原生质体 , 且休积较大 。此外 , 酶解温度 , 酶解时间和 p H值等对原生质体释放也有很大的影响 。 温度主要影响
酶的适力和菌体的生理状态 , 酶解时间过长会导致原生质体数量的减少 , 主要原因可能是酶
继续作用于膜系统使膜破裂所致 。
参考文献
何泰强 . 食用菌的细胞融合 . 食用菌 , 1 9 8 6
虐汉泉等 . 书狡生物学通报 , 1 9 8 7 , 14 ( 1 )
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( H u n a n B i o l o g y R e : e a r e h I n s t i t u t e
, C h a n g s h a )
A b s t r a e t
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K e y w o r d s : V
. v o l v a e e a , V
.
b o m b y e i n a ; p r o t o p l a s t
一信息一
据中国科大物理系李银妹提供 , 该校激光生物实验室研究成功了激光俘获与操纵生物活
体动态监测技术 , 于 6 月 2 日通过安徽省技术鉴定 。
中国科大与安徽大学生物系 已运用这一技术开展了激光对水蚤心脏博动的影响和酵母原
生质体光致融合的研究 , 并取得了定性的结果。 目前 , 科研人员正将此技术运用于医学 、 生
物领域 , 并用在光致融合、 癌细胞的观察上 , 有望取得新的重大进展 。