全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 105 - 110
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 08 - 14; 修回日期 : 2006 - 11 - 30
基金项目 : 安徽省教育厅自然科学研究项目 (2006KJ211B)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: cbj@ ahau1edu1cn)
大白菜几丁质酶基因 CHB 4的克隆及序列分析
甘德芳 1 , 朱苏文 2 , 范　军 2 , 程备久 23
( 1安徽农业大学园艺学院 , 合肥 230036; 2安徽农业大学生命科学学院 , 合肥 230036)
摘 　要 : 根据已知的几种十字花科植物几丁质酶基因保守序列设计特异性引物 , 以大白菜叶片基因组
DNA为模板 , 通过 PCR反应扩增出约 1 kb的 DNA片段和几丁质酶基因 5′端序列片段 (150 bp)。利用不同
浓度的水杨酸处理苗龄 7 d的大白菜 , 选择酶活力较高的处理植株叶片提取 RNA, 采用 RACE技术扩增。
研究结果表明 , CHB 4基因的 DNA序列长度为 1 517 bp (DDBJ登录号 : AB257452) , 包含有 1个长度为
508 bp内含子。该基因编码的产物是由 268个氨基酸残基组成的蛋白质 , 氨基酸序列与油菜 ClassⅣ类几丁
质酶的同源性达 99% , 与其它几种高等植物的同源性达 50%以上。
关键词 : 大白菜 ; 几丁质酶基因 ; 克隆 ; RACE
中图分类号 : S 63411　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120105206
C lon ing and Sequence Ana lysis of Ch inese Cabbage Ch itina se Gene CHB 4
GAN De2fang1 , ZHU Su2wen2 , FAN Jun2 , and CHENG Bei2jiu23
(1 School of Horticulture, A nhui A gricultural U niversity, Hefei 230036, Ch ina; 2 School of L ife Science, A nhui A gricultural
U niversity, Hefei 230036, China)
Abstract: Based on the conserved sequence of the chitinase of crucifers, about 1 kb DNA fragment and
5′2end fragment (150 bp) were amp lified by PCR from genom ic DNA of Chinese cabbage. Experiments were
performed on 72day2old Chinese cabbage seedlings after germ ination with salicylic acid of different concentra2
tions. Total RNA was p repared from the p lant with higher chitinase activity, and 3′2 end fragment was amp li2
fied by 3′RACE. Comparing Chinese cabbage chitinase sequence cloned in this experiment with that reported
in GenBank composed of 1 094 bp nucleotide of B rassica napus, the experiment showed that the chitinase se2
quence of Chinese cabbage is 1 517 bp in size with one intron of 508 bp (DDBJ accession number:
AB257452) , and shares as high as 99% identity with B. napus and over 50% with other high p lants in cod2
ing region.
Key words: Chinese cabbage; Chitinase gene; Clone; RACE
几丁质酶是高等植物普遍存在的一种能降解几丁质的糖苷酶 , 由于能催化真菌细胞壁中几丁质的
水解 , 使其原生质外渗 , 故能抑制真菌的生长增殖 , 具有提高植物的抗真菌能力 (孟亮和崔德才 ,
2004)。正常情况下 , 大多数高等植物中的几丁质酶基因表达水平很低或不表达 , 而当其受到病原菌
侵染 (Rasmussen et al. , 1992; Park et al. , 2005)、真菌激发子 (陈崇顺 等 , 2000)、外源几丁质、
乙烯 (B roglie et al. , 1989)、机械损伤 (Hamel & Bellemare, 1995)、紫外线辐射等因素诱导时 , 其
表达活性大大提高 ( Schneider & U lrich, 1994; 陈崇顺 等 , 2001)。水杨酸也可以诱导几丁质酶的表
达 (L i & L iu, 2003) , 特别是在β21, 3葡聚糖酶的协同作用下 , 可明显抑制真菌的生长 ( Shinshi,
1997; Pieterse & van Loon, 1999)。植物几丁质酶基因的研究最早见于菜豆 , B roglie等 (1989) 以菜
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豆 mRNA为模板经逆转录构建 cDNA文库 , 通过原位差异杂交法获得了菜豆几丁质酶基因 , 并对其中
一个全长为 1 146 bp的片段 pCH18进行了序列测定。N ishizawa和 H ibi (1991) 采用胁迫诱导成功地
从水稻 cDNA中扩增出编码几丁质酶的基因。
作者通过诱导和克隆大白菜的几丁质酶基因 , 与其他物种 ClassⅣ类几丁质酶基因的比较分析 ,
探讨大白菜与其他物种的几丁质酶基因的关系 , 为进一步研究该基因的功能及其利用提供依据。
1　材料与方法
111　材料
大白菜 (B rassica rapa subsp. pek inensis) ‘四季王 ’购自合肥益群种子有限公司。大肠杆菌 DH5α
由本实验室提供 , Trizol试剂购于上海生工生物工程有限公司 , 其它生化试剂购自宝生物工程 (大
连 ) 有限公司 , 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
112　方法
采用 CTAB法 (王关林和方宏筠 , 1989) 提取大白菜叶片基因组 DNA。根据 GenBank中十字花
科植物几丁质酶基因保守序列和本试验过程中扩增得到的序列片段设计引物 (表 1)。
对苗龄 7 d的大白菜植株 , 分别以水杨酸 1、215 、5 、715 mmol·L - 1处理 , 未处理的作为对照。
分别在处理后 8、12、16、20 h提粗酶液 , 参照 Boller等 (1983) 的方法测定几丁质酶的活力。
采用 Trizol试剂法提取大白菜总 RNA , 3′端采用 3′RACE技术按试剂盒进行。PCR产物的回收
按华舜试剂盒进行 , 回收产物与 pMD182T载体连接。连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 , 经
蓝白斑筛选及酶切验证鉴定阳性克隆。由上海生工生物工程技术服务有限公司完成双向测序。测序结
果在 GenBank中进行检索分析。利用 DNAMAN软件进行多序列比对及系统进化树分析。
表 1　大白菜几丁质酶 CHB 4基因 PCR及 RT2PCR扩增的引物序列及其参数
Table 1　Am plif ica tion pr im ers and param eters of CHB 4 by PCR and RT2PCR in Ch inese cabbage
引物
Primer
引物序列
Primer sequence
长度
Length ( bp)
复性温度
Annealing temperature (℃)
作用
Function
p1 GGGGAATTCGAAACCGTCAAGTCTCA 1 096 55 扩增几丁质酶基因特异片段
p2 GGCCTGCAGCTTACGCTATTCATCCA For m iddle fragment amp lification
p3 CGGCTGCAGAACATGGCTCTCACAA 150 55 扩增几丁质酶基因 5′端
p4 GGGGAATTCACCACAATAAGCGTCG For 5′2 end amp lification
p11 GTGACTACTGCGACGAGAACAACA 436 50 扩增几丁质酶基因 3′端
p12 CTAGTGAGTAGCAACCCAACTGTC For 3′2 end amp lification
p5 CGGCTGCAGAACATGGCTCTCACAAAATTATCC 1 517 62 扩增几丁质酶全基因
p6 GCGCTCGAGTTTCTCCATCACTTCCCACGTC For full gene amp lification
p7 GCGCGCCATATGATGCAAAACTGCGGTTGTG 811 62 扩增几丁质酶成熟肽基因
p8 GCGCTCGAGTTTCTCCATCACTTCCCACGTC For mature pep tide gene amp lification
2　结果与分析
211　水杨酸诱导大白菜几丁质酶活性测定及几丁质酶成熟肽基因的克隆
试验发现 110 mmol·L - 1水杨酸诱导效果最佳 , 处理后约 12 h几丁质酶的活力达到最高 , 为
818 U。表明几丁质酶是一种诱导酶 , 在正常情况下不表达或表达量很低 , 当受到外源因子诱导时 ,
其表达量会大大提高。水杨酸诱导的试验组 RT2PCR反应有特异性条带 , 而未经处理的植株没有特异
性条带。提取经 110 mmol·L - 1水杨酸处理的大白菜叶片 RNA, 由引物对 p7 /p8扩增出 1条 811 bp的
条带 (图 1, A) , 为编码 ClassⅣ类几丁质酶的成熟肽基因序列。
212　大白菜几丁质酶 CHB 4基因全长的克隆
CHB 4基因中间特异性片段的 PCR扩增 , 以大白菜基因组 DNA为模板 , 由引物对 p1 /p2扩增出
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　1期 甘德芳等 : 大白菜几丁质酶基因 CHB 4的克隆及序列分析 　
约 1 kb的特异性片段 (图 1, B) , 连接到 TaKaRa的 pMD182T Vector上 , 对目的片段和重组质粒分别
同时进行 EcoR I和 Pst I双酶切 , 电泳结果发现 , 重组质粒中不仅切出一条与目的片段大小相同的条
带 , 而且目的片段中无 EcoR I、Pst I酶切位点。测序分析表明 , 该片段长度为 1 096 bp, 同源性分析
显示该片段与十字花科油菜 ClassⅣ类几丁质酶基因的核苷酸序列一致性达 90%以上。
CHB 4基因 5′端的 PCR扩增 , 以大白菜基因组 DNA为模板 , 由 p3、p4引物扩增出大白菜几丁
质酶基因 5′端的特异片段 (图 1, C) , 再将该片段连接到载体 pUC19上 , 经酶切验证及测序分析表
明 , 该片段长度为 150 bp, 是编码 ClassⅣ类几丁质酶 N端部分氨基酸的序列。
CHB 4基因的 3′RACE反应 , 以 110 mmol·L - 1水杨酸处理的大白菜叶片 RNA为模板进行 , 将所
获产物电泳 , 结果出现 smearing大片段 , 说明存在着显著的非特异性扩增 , 再重新合成巢式引物
p11、p12进行巢式 PCR反应 , 结果扩增出一条明显的约 500 bp条带 , 另外在距 300 bp左右处隐约有
一条带 (图 1, D) ; 在序列比较的基础上 , 将回收的大片段连接到 T载体上 , 经测序分析显示 , 该
片段长度为 436 bp, 恰为编码 ClassⅣ类几丁质酶 C端部分氨基酸的序列。
检测内含子的 PCR和 RT2PCR反应 , 提取经 110 mmol·L - 1水杨酸处理的大白菜叶片 RNA , 以
p1、p2为引物进行 RT2PCR反应 , 扩增出一条约 600 bp的特异条带 ; 而同样的引物从基因组中却扩
增出长度为 1 096 bp的片段 (图 1, B ) , 这表明前面扩增得到的 1 096 bp片段中应包含有内含子 , 大
小约 500 bp。进一步对其测序 , 结果表明 1 096 bp片段中含有 1个内含子 , 长度为 508 bp, 且内含子
剪切遵循 GT2AG原则。
CHB 4基因全长 PCR扩增以大白菜基因组 DNA为模板 , 引物对 p5 /p6扩增出大白菜几丁质酶
CHB 4基因全长 , 约 115 kb (图 1, E)。测序结果表明 , 该基因序列长度 1 517 bp, 与前面几丁质酶
特异性片段 1 096 bp序列相比 , 在多聚 A (543～555, 695～711) 的位置上分别多出 2个及 3个 A。
图 1 　大白菜几丁质酶 CHB 4基因的 PCR及几丁质酶成熟肽基因的 RT2PCR扩增结果
a: 几丁质酶成熟肽基因 ; b: CHB 4特异片段 ; c: CHB 4 5′端 ; d: CHB 4 3′端 ; e: CHB 4全长 ; M: DL 2000。
F ig. 1　Am plif ica tion pr im ers and param eters of CHB 4 by PCR and RT2PCR product of ma ture peptide gene in Ch inese cabbage
a: Mature pep tide gene; b: Special sequence of CHB 4 gene; c: 5′2 end fragment of CHB 4 gene; d: 3′2 end fragment
of CHB 4 gene; e: The full lenth of CHB 4 gene; M: DL 2000.
213　大白菜几丁质酶 CHB 4基因的核苷酸序列及其推断的氨基酸序列分析
CHB 4基因包含一个长度为 508 bp (407～914) 的内含子序列 , 全长 1 517 bp, 其外显子 (1～
406, 915～1517) , 编码区 (4～406, 915～1318) , 编码的蛋白质由 268个氨基酸残基组成。该蛋白
质含有一个长度为 72 bp (4～75) 组成的导肽区 , 其氨基酸组成为 MALTKLSLVLFLCFLGLYSETVKS。
另外 , 在 1 174 bp处 , 以基因组 DNA为模板进行 PCR扩增 , 所获得产物经测序为核苷酸 C; 而以
cDNA为模板的 RT2PCR反应 , 测序结果却突变成了 T, 而它们的三联体密码子所编码的氨基酸却都
是天冬酰胺 (图 2) , 表明在此过程中发生了同义突变 , 编码氨基酸的三联体密码子具有简并特性。
与油菜 ClassⅣ类几丁质酶基因 (X61488) 的核苷酸序列比较 , 结果表明 : 大白菜几丁质酶基因
376位置的核苷酸是 G, 则三联体密码子 GTG所编码的氨基酸是 Val, 而油菜的是 A, 三联体密码子
ATG编码的氨基酸是 Met; 大白菜几丁质酶基因在 ORF框外的 1 428～1 429, 1 436～1 437位置上都
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是 TA, 而油菜却是 AT。另外 , 在 3′端下游 , 二者也存在差异。
图 2　大白菜几丁质酶 CHB 4基因的核苷酸序列及其推断的氨基酸序列
其中小写字母表示内含子序列 , 引物 1和 3扩增大白菜几丁质酶全基因 , 引物 2和 3扩增大白菜几丁质酶成熟肽基因 ,
下划线部分为导肽序列 , * 表示从基因组扩增全基因与从 cDNA扩增成熟肽基因测序结果的差异 ,
↑表示该位置的核苷酸与已知的油菜 ClassⅣ类几丁质酶基因 (X61488) 的核苷酸差异。
F ig. 2　Nucleotide and deduced am ino ac id sequences of CHB 4 gene of Ch inese cabbage
Lowercase letters for the intron, p rimer 1 and 3 shown as numbered arrows for amp lification of full CHB 4 gene, p rimer 2 and 3 for
amp lification of mature pep tide gene, the underline for signal pep tide, * for differences between the mature pep tide gene and the
full gene, ↑ for differences of nucleotide sequences between the position from ClassⅣ chitinase (X61488) of B rassica napus.
214　大白菜几丁质酶与其它植物的 C la ss IV Ch itina se ( CH IV) 氨基酸序列的比较分析
　　将试验组几丁质酶与其他植物几丁质酶氨基酸
序列进行分析比较 , 结果表明 : ClassⅣ类几丁质酶
氨基酸序列中含有两个高度保守区 FAHF ( /V )
THETGHF ( /M) CY及 QGFGATIRA IN, 而且 ClassⅣ
类几丁质酶的 3′端较 5′端保守性高。大白菜几丁
质酶 CHB 4基因编码了一个由 268个氨基酸残基组
成的蛋白质 , 其氨基酸序列与油菜 ClassⅣ类几丁
质酶的氨基酸序列同源性达 99% , 二者长度相同 ,
只有一个氨基酸差异 , 即在 125位置上油菜是 Met
而大白菜是 Val (图 3)。 进化树分析结果 (图 4)
图 4　大白菜几丁质酶与其它物种的 C la ss IV Ch itina se
( CH IV) 系统进化树
F ig. 4　Phylogenetic tree for ch itina se from Ch inese cabbage
and severa l CH IV from d ifferen t spec ies
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　1期 甘德芳等 : 大白菜几丁质酶基因 CHB 4的克隆及序列分析 　
图 3　大白菜几丁质酶与其它物种的 C la ss IV Ch itina se ( CH IV) 氨基酸序列的多重比较分析
其中黑色表示该位置序列完全一致 ; 红色和蓝色分别表示该位置序列高度相似和相似。
F ig. 3　Ana lysis of am ino ac id sequences of severa l CH IV from d ifferen t spec ies
B lack denote comp letely same; Red and blue denote high reserved and common reserved individually.
表明 , 大白菜 (B rassica rapa subsp. pekinensis) 与油菜 (B rassica napus) 位于一个组群内亲缘关系最
近 , 与其它几种植物的亲缘关系也较近。表明 ClassⅣ类几丁质酶的氨基酸序列具有较高的保守性 ,
同时也表明本试验所克隆的大白菜几丁质酶 CHB 4基因是编码 ClassⅣ类几丁质酶的基因序列。
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3　讨论
试验提取未作诱导处理的大白菜叶片 RNA, 经反转录及 PCR反应未获得特异性的条带。这可能
是因几丁质酶属于一种诱导酶 , 该类酶在正常情况下不表达或表达水平很低 , 当受到外源因子诱导时
其表达活性大大提高。如本试验中水杨酸处理后几丁质酶基因的表达量增加并使酶活力提高。
几丁质酶作为一种诱导酶已众所周知 , 从它降解的目的对象和维持生命进程来看 , 它同保障机体
与环境之间和谐所需能量的物质代谢酶类不同 , 其合成过程与环境因素有关 , 是机体抗御外界环境因
素变化的诱导性酶 , 属于维持生命世代延续的一类酶。
本试验所克隆的大白菜几丁质酶 CHB 4基因是编码 ClassⅣ类几丁质酶的基因 , 含有 1个内含子 ,
该基因编码的蛋白质序列 C端较 N端的保守性高。
References
Boller T, Gehri A , Mauch F. 1983. Chitinase in bean leaves: induction by ethylene, purification, p roperties, and possible function. Planta,
157: 22 - 31.
B roglie K E, B iddle P, Cressman R, B roglie R. 1989. Functional analysis of DNA sequences responsible for ethylene regulation of a bean chiti2
nase gene in transgenic tobacco. The Plant Cell, 1: 599 - 607.
Chen Chong2shun, Zhu Xue2feng, Yu Zhi2fang. 2000. Induction and purification of the chitinase from V igna sesquipedalis. Acta Horticulturae
Sinica, 27 (5) : 351 - 355. ( in Chinese)
陈崇顺 , 朱雪峰 , 郁志芳. 2000. 豇豆几丁质酶的诱导与纯化. 园艺学报 , 27 (5) : 351 - 355.
Chen Chong2shun, Zhu Xue2feng, Yu Zhi2fang. 2001. Determ ination of the N2term inal am ino acid sequence of a chitinase from V igna sesquipedalis
and its comparison with those of the same regions from other p lant chitinase. Guihaia, 21 (2) : 177 - 182. ( in Chinese)
陈崇顺 , 朱雪峰 , 郁志芳. 2001. 豇豆几丁质酶 N端序列测定与其他植物的比较. 广西植物 , 21 (2) : 177 - 182.
Hamel F, Bellemare G. 1995. Characterization of a class I chitinase gene and of wound2inducible, root and flower2specific chitinase exp ression in
B rassica napus. B iochim B iophys Acta, 1263 (3) : 212 - 220.
L i J, L iu J Y. 2003. A novel cotton encoding a new class of chitinase. Acta Botanica Sinica, 45 (12) : 1489 - 1496.
Meng L iang, Cui De2cai. 2004. Plant chitinase and app lication in resisting ep iphyte disease. Letters in B iotechnology, 15 ( 4) : 420 - 422.
( in Chinese)
孟 亮 , 崔德才. 2004. 植物几丁质酶及其在抗真菌病害中的应用. 生物技术通讯 , 15 (4) : 420 - 422.
N ishizawa Y, H ibi T. 1991. R ice chitinase gene: cDNA cloning and stress2induced exp ression. Plant Sci. , 76: 211 - 218.
Park Y S, Jeon M H, Lee S H, Moon J S, Cha J S, Kim H Y, Cho T J. 2005. Activation of defense responses in Chinese cabbage by a nonhost
pathogen, Pseudom onas syringae pv. tomato. J. B iochem. Mol. B iol. , 38 (6) : 748 - 754.
Pieterse C M, van Loon L C. 1999. Salicylic acid2independent p lant defence pathways. Trends Plant Sci. , (4) : 52 - 58.
Rasmussen U, Bojsen K, Collinge D B. 1992. Cloning and characterization of a pathogen2induced chitinase in B rassica napus. PlantMol. B iol. ,
220 (2) : 277 - 287.
Rasmussen U, Bojsen K, Collinge D B. 1993. Cloning and characterization of a pathogen2induced chitinase in B rassica napus. PlantMol. B iol. ,
21 (3) : 581.
Schneider S, U lrich W R. 1994. D ifferential induction of resistance and enhanced enzyme activities in cucumber and tobacco caused by treatment
with various abiotic and abiotic inducers. Physiological and Molecular Plant Pathology, 45 (4) : 291 - 304.
Shinshi H. 1997. Regulation of p lant pathogenesis related enzyme: inhibition of chitinase and chitinase mRNA accumulation in cultured tobacco
tissues by auxin and cytokinin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 89 - 93.
W ang Guan2lin, Fang Hong2jun. 1989. Plant gene engineering. Beijing: Science Press: 742 - 744. ( in Chinese)
王关林 , 方宏筠. 1989. 植物基因工程. 北京 : 科学出版社 : 742 - 744.
011