全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(7)：1075—1080
Acta Horticulturae Sinica
草原龙胆盐胁迫差减文库的构建及分析
王继刚 ，张 坤 ，徐启江 ，李玉花
( 东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；!西南林学院学报编辑部，昆明650224)
摘 要：为了研究草原龙胆抗盐性机理，初步获得其抗盐性相关基因，分别以400 mmo|·L 的 NaCI
及清水处理的草原龙胆叶片 mRNA为 tester和 driver方，利用抑制差减杂交技术构建了cDNA文库。经过测
序和与 Gene Ontology数据库序列比对，获得了658条单一序列，其中61条序列分子功能未知 ，535条序列
无同源性 ，62条序列有显著同源性。此 62条序列注释按照功能分为21类。获得了活性氧清除系统基因
DHAR、GST、TRX、CAT，转录因子 SMT3，调控基因丝氨酸／苏氨酸激酶基因等。结果说明草原龙胆的盐抗
性相关基因与数据库中的模式植物基因既有一定的共性，同时绝大部分的序列又无法用已知的基因进行解
释。
关键词：草原龙胆；抑制差减杂交；差异基因；盐胁迫
中图分类号：S 682 文献标识码：A 文章编号 ：0513—353X (2008)07—1075-06
Construction and Analysis of Eustoma grandiflorum Subtracted cDNA Library
WANG Ji．gang ，ZHANG Kun ，XU Qi-jiang ，
( Colege ofLife Science，Northeast Forest~"University，
Southwest Forestry University，Kunming 650224，China)
and LI Yu．hua
Harbin 150040，China； Editorial Department of Academic Journal，
Abstract：To research salt tolerance mechanism and get the salt tolerance relative genes Ol Eustoma
grandiflorum，a cDNA library was made by suppression subtractive hybridization technique．The leave mRNA
of Eustoma grandifloHzm treated with 400 mmol·L—NaC1 was tester，and that treated with pure water was
driver．From the library ，we got 658 unique sequences by sequencing and sequence blasting．Sixty—one of the
total sequences are functioning unknown，535 sequences have no homology and 62 sequences have signifcance
homology to the Gene Ontology sequence library．The 62 sequences can be classified into 2 1 function catego-
ries．And we finaly got the reactive oxygen species scavenging genes：DHAR，GST，TRX，CAT，transcription
factor SMT3，and serine／threonine protein kinase gene．The results indicate that there are general characters
between the salt tolerance genes of Eustoma grandiflorum and model plants，and the most of the sequences can
not be explained by the known genes．
Key words：Eustoma grandiflorum；suppression subtractive hybridization；diferently expressed gene；
saIt stress
草原龙胆 (Eustoma grandiflorum)又名洋桔梗，原产北美，为多年生草本，具有一定的抗盐碱能
力 (大川清，1995)，作为重要的观赏植物，已成为国际流行的鲜切花之一。目前对草原龙胆的研究
主要集中在新花色、新花型、长瓶插寿命并可周年生长的优良品种选育上，有关其抗盐胁迫的分子机
制还未见报道。
耐盐性是目前抗性研究中的一个重要方面，但多集中在耐盐植物和模式植物上 (Qiu et a1．
2004；曾幼玲 等，2007)。植物通过膜以及细胞内的感受器感应离子以及脱水胁迫，并且通过次级信
收稿日期：2008—04—21；修回日期：2008—06一l1
基金项目：国家高技术研究发展计划项目 (2006AA10Z129)
通讯作者Author for correspondence(E·mail：lyhshen@126．con)
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园 艺 学 报
号因子 (如 Ca¨ ，ROS)调控转录因子的表达，精调 Na 通道及 Na 的区隔化，从而调整 Na ／K
的平衡；合成 LEA蛋白和渗透调节物质以维持细胞的渗透平衡；同时，启动 ROS清除系统以控制细
胞内的氧化胁迫。Takahashi等从耐盐的芦苇中克隆了高亲和 K 转运子 (PhaHKT1)，并将其转人参
与Na 外排的钾转运子缺失及P类 ATP酶缺失的酵母中，其转化子可以在 100 mmol·L 的 NaC1条
件下生长 (Takahashi et a1．，2007)。Xiang等 (2007)将水稻钙调 B类蛋白互作激酶 OsCIPK15转入
水稻中过量表达，提高了水稻的耐盐性。Karaba等 (2007)从拟南芥中克隆了 AP2／ERF类转录因
子的 HRD基因，其过量表达可以使拟南芥耐受300 mmol·L 的NaC1胁迫，并完成其生长发育周
期。
耐盐性是一个多基因控制的性状。虽然目前许多研究者通过提高单个基因的表达水平可以提高植
物的抗盐能力，但这并不能展示盐抗性涉及的基因的复杂性。本试验中用抑制差减杂交 (suppressi’on
subtractive hybridization，ssH)技术 (许志茹和李玉花，2006；谢吉容 等，2007)，研究了在 NaC1胁
迫条件下和正常栽培条件下的草原龙胆耐盐相关差异基因，为寻找草原龙胆抗性基因以及揭示盐抗性
机理提供依据。
1 材料与方法
1．1 试材及其 RNA的提取
采用的植物材料为东北林业大学花卉生物工程研究所从 日本引进的黄色重瓣草原龙胆栽培品系
50号，2006年至2008年于东北林业大学花卉生物工程研究所资源圃的13光温室内种植，常规栽培管
理20周龄。以400 mmol·L 的 NaC1处理 1、3和6 h的叶片为处理，清水处理的叶片为对照。
利用 TRlzol Reagent试剂盒 (购自Invitrogen Life Technologies公司)提取总 RNA，利用分光光度
计测定其浓度，1、3和6 h盐处理的总 RNA以 1：1：1的比例混合。混合的总 RNA经过 mRNA纯化
(纯化试剂盒购自Amersham Biosciences公司)，获得 poly(A) mRNA。
1．2 文库构建与分析
利用 Clontech PCR．Select cDNA Subtraction Kit(购自BD Biosciences Clontech公司)构建草原龙
胆盐胁迫与对照的 cDNA抑制差减文库，以盐处理为 tester方，以对照为driver方。具体操作方法见
操作手册。
将获得的文库 PCR产物利用 PCR产物纯化试剂盒 DNA Fragment Purification kit MagExtractor~一
PCR and Gel Clean up(购自TOYOBO公司)对 PCR产物进行纯化。将获得的纯化产物连接 pGEM．T-,
Vector载体 (购自Promega公司)，转化大肠杆菌 JM109感受态细胞，通过蓝白斑筛选 、随机挑选选
阳性克隆，提取质粒。以文库试剂盒提供的嵌套引物 Nested primer 1和 Nested primer 2R进行 PCR扩
增，鉴定文库插入片段，并进行测序。
将获得的序列提交 GO核酸序列数据库 (htp：／／amigo．geneontology．o~g／egi．bin／amigo／go．egi)进
行序列分析。
2 结果与分析
2．1 总 RNA以及 mRNA的质量
将提取的总RNA利用 0．8％ 甲醛变性琼脂糖凝胶进行电泳 (图 1)，可看出28 s和 18 s两条亮
带，亮度比约为2：1，边缘清晰，没有弥散现象，表明提取的 RNA未发生降解，从而保证了 RNA具
有较好的完整性。将 1、3和6 h的NaC1盐处理的总RNA以 1：1：1的比例混合做为 tester方，清水处
理做为driver方，纯化出 mRNA (图2)。tester和 driver的总 RNA经紫外分光光度计测定，两者的
OD26o／OD 分别为 1．92和 1．89。
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7 期 王 继 刚等 ： 草原龙胆盐胁迫差减文库的构建及分析
对照 盐 处理 S alttreatm ent
C ontrol 可■
—
了r
—
1 __h
图 1 对 照 和 不 同盐处 理 时 间 的总 R N A 电泳 图
F ig． 1 E lectrophoresis ofthe control
and the salttreated totalR N A
28S —
18 S — —
图 2 tester 和 driver 纯化后的 m R N A 电泳 图
tester： 混 合 了 1 、 3 、 6 h的 N aC I 处理 的 m R N A ；
driver： 以 清水处 理 的 m R N A 。
F ig． 2 E lectrophoresis ofpurified tester and driver m R N A
tester： P urified m R N A treated w ith NaC I for 1 ， 3 and6 hours ；
driver ： m R NA treated w ith pure w ater．
2． 2 消减 杂交结果 以及 插入 片段鉴定
将纯 化后 的 tester 和 driver 的 m R N A ， 经 过反转录 ， 合成 了双链 cD N A ， 长度 为 0． 5 ～ 10 kh， 不适
于分子 杂交 。 用 R sa I 酶切 为较短 的片段 ， 可 防止 长链 片段 形 成复杂结构对 消减 杂交造成干 扰 ， 既减
少 了表达谱 cD N A 的复杂性 ， 又 提高了每个基 因的代表性 ， 有利于差别表达基 因的检 出 。
未经 过消化的 tester cD N A 和 driver eD N A ， 大多呈 弥散状分布在 100 ～ 2 000 bp 之 间 ， 经 过 R sa I
酶切 后 ， 产生 eD N A 片段 多在 500 bp 以下 (图 3 )。
hI 1 2 3 4 5, 1 1
250 — —
lO O — —
图 3 cD N A 经 R sa I 消化前 后 对 比
M ： 分子量 标准 ； 1 ： 消化前试 验 方 ； 2 ： 消化前 消减 方 ；
3 ： 消化后 试验 方 ； 4 ： 消化后 消减方 。
F ig． 3 C om parison ofeD N A before and after R sa ldigested
M ： M arker； I ： T ester cD N A before R sa I digested：
2 ： D river eD N A before R sa I digested：
3 ： T ester cD N A after R sa I digested：
4 ： D river eD N A after R sa I digested．
bp
2 000 — — — —
lO O O — —
750 — —
500 — —
250 - - — —
lO O — —
图 4 文 库 P C R 产物 电泳 图
M ： 分 子量 标准 ； 1 ： 文 库第 2 次 P C R 产 物
F ig． 4 E lectrophoresis ofthe library P C R product
M ： M arker； 1 ： T he P C R product ofthe library．
将经 R sa I 酶切产生 的带有粘性末端 cD N A 片段 ， 分别与 adaptor 1 和 adaptor 2R 接头连接 ， 将过
量 的 driver cD N A 分别加入 到连有接头 的两 份 tester cD NA 中 ， 在第 l步差减杂交反应 中 ， 实现 有丰度
差别的 teste r cD N A 达 到均 一 化 ， 使得检测群体中差 异表达 的基 因得到第 1 次富集 。
用新 的变性单链 driver eD N A 同时与两 份杂交产物混 合退 火进行第 2 轮消减杂交 ， 进 一 步富集 了
差异表达 的 cD N A ， 完成 了文库的构建 。
将 文库 P C R 产物 (图 4 ) 纯化 ， 连接到 pG E M - T 载体上 ， 转化感受态大肠杆菌 J M l09 ， 通过氨苄
抗性 和蓝 白斑筛选 ， 随机 挑 取 了 2 013 个 阳性 克 隆 。 利用 P C R 检测 出 1 15 3 个 含有 插入 片段 的 克 隆
二
～ 一
p O O O O
b ∞ ∞；2 如
2
1
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1078 艺 学 报 35 卷
(图 5 )， 测序 ， 利用 V ecS c reen 去除载体序 列 ， S eqC lu st2． 1 去 除冗 余序列 ， 获得 65 8 条单 一 序列 ， 平
均序列长度为 375 bp， 文库的冗 余度 为 4 2． 9％ 。
bp
2 000 — —
1 000 — —
750 — —
500 - — —
250 一
M L 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 5 16 17 18 19 20
图 5 P C R 检测 cD N A 抑制 差减 文 库 克隆插入 片段
M ： 分子 量标 准 ； l一 20 ： 消减 文 库 的 P C R 产 物 。
F ig． 5 Identification ofthe inserted cD N A fragm ents in the subtractive cD N A library by P C R
M ： M arker； 1 — 20 ： P C R product oftile S S H library．
2． 3 序 列注释
对所 有获得的基 因进 行 了 G ene O ntology 分析 ， 除 去 分子 功 能未 知 的 6 l条序 列 以 及 无 同源 性 的
5 35 条序列 ， 其余按照 获得序列 的分子 功 能分类 ， 共 获得 了 21 类 (表 1 )。 其 中 D N A 结 合 蛋 白基 因
表 1 部分 盐胁 迫 相 关 基 因
T able 1 P artofthe stress relative genes
B 055 B
Ix】4 37B
A 04 7B
H )35 B
F 0236 A
G 3 12B
F U 20 lA
H 064 A
A 06 13 B
F D 217 A
G 0620B
B 059 A
推测 的环 氧 化物水解 酶
P u tative epoxide hydrolase(E H )
过 氧化氢同功 酶 A
C atalase iso zym e A (C A T )
细胞色素 P 4 50 单加 氧酶
C ytochrom e P 4 50 m onooxygenase (P 4 50 )
丝 氨酸／苏氨酸 蛋 白激酶
S efine／threon ine protein kinase
泛醌 链接酶
U biquitin — conjugating enzym e (S U M O )
脱氢抗坏血 酸还 原酶
D ehydroaseorbate reduetase (D H A R )
丝 氨酸蛋 白酶抑制剂
S erine protease inhibitox
硝酸根转运 子
Nitrate transporter
类 泛醌 蛋 白 S M T 3 ， 焦磷酸 酶 活性
U biquitin - like protein S M T 3 ，
pyrophosphatase activity(S M T 3 )
叶绿体硫 氧还 蛋 白
C hloroplastthioredoxin (T R X )
类似推测 的羟 基邻氨基 苯 甲酸羟基 肉硅 酸转移酶
S im ilar to pu tative hydroxyanthranilate
hydroxycin nam oyltransferase
谷胱 甘肽 s转移酶
G lutathione S ． transferase (G S T )
水稻 O oza satitⅥ 3 ． 2E 一 14 上 调 B ray， 2002
水稻 O ryza sa tiva 5 E 一 03 上 调 Y u et a1． ， 2007
拟 南 芥 A ra bidopsis thalia na 1 ． 9 E — 18 上 调 W alia eta1． ， 2005
拟南 芥 A rabidopsis thalia na 9 ． 3 E 一 09
水稻 O r)za sa ti~ z 9 ． 5 E 一 08
小麦 T ritieum a eslivltra 2． 0E 一 39 上 调 C onklin ， 1996
拟南 芥 A rabidopsis tha lia na 4 ． 6E 一 08 L 调 M a et a1． ， 2006
拟 南芥 A rabidopsis thaliana 9 ． 8E 一 08 上 调 K reps eta1． ， 2002
水稻 O oza sa tiva 2． 1E 一 06 上 调 T hibaud— Nissen
e￡ a1． ． 2003
拟 南芥 A rabidopsis thaliana 9 ． 4 E — 04 上 调 D ietz eta1． ， 2006
拟 南芥 A rabidopsis thaliana 6． 9 E 一 02
拟 南芥 A rabidopsis thalia na 1 ． 5 E 一 10 上 调 T ajiet a1． ， 2004
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7期 王继刚等：草原龙胆盐胁迫差减文库的构建及分析
24．20％，核糖体结构组成基因 1．61％，催化活性基因1．61％，过氧化氢酶活性基因 1．61％，环氧化
物酶活性基因4．84％，单氧化酶活性基因1．61％，激酶活性基因3．23％，泛素蛋白连接酶活性基因
1．61％，丝氨酸肽链内切酶抑制活性基因 1．61％，转运活性基因 3．23％，氨基酸聚胺转运活性基因
1．61％，结合活性基因9．68％，铜离子结合活性基因3．23％，蛋白结合基因3．23％，电子载体活性基因
6．45％，焦磷酸酶活性基因6．45％，转移酶活性基因1．61％，氧结合活性基因9．68％，硫醇一二硫键交
换活性基因6．45％，谷胱甘肽脱氢酶活性基因4．84％，低浓度脂蛋白受体结合活性基因1．61％。
此文库中获得了与细胞解毒有关的基因 (表 1)，如推测的环氧化物水解酶 (Epoxide hydrolase，
EH)基因 (Kiyosue et a1．，1994)、硫氧还蛋白 (Thioredoxin，TRX)基因 (Meyer et a1．，2005)、脱氢
抗坏血酸还原酶 (dehydroascorhate reductase，DHAR)基因 (Conklin，1996)、过氧化氢酶 (catalase，
CAT)基因 (Wilekens et a1．，1997)、谷胱甘肽 s转移酶 (glutathione S-transferase，GST)基因，转
录因子SMT3(Kurepa et a1．，2003)，细胞色素P450基因 (Narusaka et a1．，2004)，泛醌连接酶 (SU—
MO)基因 (Kurepa et a1．，2003)，泛肽交联酶基因 (Feussner et a1．，1997)等。
3 讨论
从获得的基因序列与已知基因的相关性上看，90．6％ (596／658)序列无功能注释或无同源性序
列，说明获得的草原龙胆盐胁迫抑制差减文库序列与模式植物已知的基因库相似程度不高。但在获得
的62条序列中，又包含了过氧化氢酶活性基因、环氧化物酶活性基因、泛素蛋白连接酶活性基因、
谷胱甘肽脱氢酶活性基因等，涉及到了在模式植物中同样存在的活性氧清除、逆境胁迫保护等盐胁迫
响应基因，说明草原龙胆在盐胁迫条件下的基因表达和模式植物之问还有一定的共性。
从获得的基因功能分类上看，DNA结合蛋白基因占了注释序列的24％，说明获得了一定数量的
调控功能序列，但是大部分序列的具体功能未知，因而是否草原龙胆的调控机制不同于模式植物还有
待于进一步通过试验验证。本试验只进行了盐处理叶片对清水处理的叶片的差减杂交，目的是获得盐
胁迫下的大量表达基因。而没有进行反向杂交，即清水处理的叶片对盐处理的叶片的杂交，从而获得
在盐处理条件下减少表达的基因，可能导致了表 l中获得的基因大多为上调表达类型。
从此文库中并未发现类似SOS1(Shi et a1．，2000)和DREB (Maruyama et a1．，2004)等在拟南
芥、水稻中普遍存在的盐胁迫离子转运和调控基因。鉴于草原龙胆具有一定的耐盐性，是否 400
mmol·L 的 NaC1盐处理对于草原龙胆离子泵的调控作用不明显，是否存在 DREB调控因子或者对
其表达影响不显著，同样需要进一步的试验进行验证。但获得的24％DNA结合蛋白基因中应该存在
类似 DREB的调控基因。下一步的工作可以通过克隆此类基因全长，序列比对，转基因研究等步骤获
得更多的关于草原龙胆的调控基因的信息
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