全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (5) : 1021～1026
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 01 - 25; 修回日期 : 2006 - 03 - 06
基金项目 : 江苏省科技厅高技术研究项目 (BG2003305、BG2004310) ; 上海市农委重点攻关项目 〔农科攻字 ( 2004) 第 321〕;
江苏省高技术产业化项目 (JH02 - 086) ; 江苏省农业三项工程项目 〔SX (2003) 065〕
小菊悬浮细胞培养与植株再生研究
陈发棣　蒋甲福　郭维明　房伟民　赵宏波
(南京农业大学园艺学院 , 江苏南京 210095)
摘 　要 : 以小菊‘七月红 ’品种为试材 , 进行了细胞悬浮培养及植株再生诱导的探讨。结果表明 , MS +
110 mg·L - 1 2, 42D + 012 mg·L - 1 62BA培养基适合从试管苗茎段有效诱导生长迅速、质地疏松的愈伤组
织。获得的愈伤组织在 MS + 015 mg·L - 1 2, 42D + 012 mg·L - 1 62BA液体培养基中振荡培养 , 建立细胞悬浮
培养体系。悬浮细胞的生长曲线呈上升的半抛物线型 , 细胞生长大致分缓慢生长期 (0～2 d)、对数生长期
(2～10 d) 和停滞期 (10 d以后 ) ; 随着悬浮细胞生长 , 培养液 pH值迅速下降。悬浮细胞固液双层培养表
明 , 在培养基 MS + 012 mg·L - 1 KT + 012 mg·L - 1 2, 42D上植板率最高 ; 4℃低温 2 h处理能促进悬浮细胞
生长 , 提高植板率 ; 随着继代次数增加植板率呈下降趋势。培养 1个月后 , 形成了直径约 012 cm的愈伤组
织 , 将其转到 MS + 2 mg·L - 1 62BA + 011 mg·L - 1 NAA培养基后 , 继代 4次 , 分化后出芽 ; 分化芽在培养
基 MS + 015 mg·L - 1 NAA上诱导生根 , 形成小植株。
关键词 : 小菊 ; 悬浮细胞培养 ; 植株再生
中图分类号 : S 68211 + 1　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0521021206
Stud ies on Cell Suspen sion Culture and Plan t Regenera tion of D endran them a
×grandif lorum w ith Sma ll Inflorescences
Chen Fadi, J iang J iafu, Guo W eim ing, Fang W eim in, and Zhao Hongbo
(College of Horticulture, N an jing A gricu ltura l U niversity, N an jing, J iangsu 210095, Ch ina)
Abstract: Chrysanthemum‘Q iyuehong’with small inflorescence was emp loyed for study of cell suspen2
sion and p lant regeneration. The results showed thatMS (Murashige and Skoog) medium with supp lement of
110 mg·L - 1 2, 42dichlorophenoxyacetic acid ( 2, 42D ) and 012 mg·L - 1 62benzylam ino purine ( 62BA )
could efficiently induce rap id2growing and loose calli. Obtained calli were subsequently cultured in liquid MS
medium with 015 mg·L - 1 2, 42D and 012 mg·L - 1 62BA for establishing cell suspension system. The growth
of suspension cultured cells showed a parabola curve, mainly characterized by lagged growth phase (0 - 2 d) ,
logarithm ic growth phase (2 - 10 d) and stationary growth phase (10 d later) , respectively. In addition, pH
value of medium decreased rap idly during the culture p rocess. H ighest p lant efficiency was obtained on MS
medium with 012 mg·L - 1 kinetin ( KT) and 012 mg·L - 1 2, 42D. Low temperature treatment at 4℃ for 2
hours could enhance the growth of cell, and increase the p lanting efficiency as well. However, the p lant effi2
ciency decreased with increasing of subculture times. Calli with a diameter of 012 cm were obtained in one
month. W hen they were transferred to MS medium containing 210 mg·L - 1 62BA and 011 mg·L - 1 naphtha2
leneacetic (NAA) and subcultured for 4 times, shoots differentiated from the calli. Rooting p lantlets were in2
duced on MS with 015 mg·L - 1 NAA.
Key words: D endran them a ×grand if lorum ; Cell suspension culture; Plant regeneration
悬浮单细胞或小细胞团是进行原生质体分离、体细胞杂交与遗传转化等研究的重要材料或受体。
细胞悬浮培养也是研究植物生理生化过程、器官的发生和分化的理想体系。迄今 , 已在樱草〔1〕、唐
菖蒲〔2〕、猕猴桃〔3〕、韭菜〔4〕等许多园艺植物上建立了细胞悬浮培养与植株再生体系。以单细胞、小
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细胞团或原生质体作为诱变对象是解决嵌合体的一条有效途径。利用细胞悬浮培养与胁迫诱导处理、
辐射诱变等相结合的方法能得到单细胞起源且遗传上稳定的突变体 , 提高抗性突变体的突变率和选择
效率 , 如紫花苜蓿的抗盐植株〔5〕、烟草抗氟苯丙氨酸后代〔6〕的获得等。
菊花 〔D endran them a ×grand if lorum (Ramat. ) Tzvel〕在花卉生产中占有十分重要的地位。组培技
术与辐射诱变已经综合应用于菊花品种改良和新品种选育 , 但诱变处理还局限于个体或组织水平。菊
花悬浮细胞培养及悬浮细胞辐射诱变选择耐低温突变体在国外已有零星报道〔7～9〕, 但细胞悬浮培养的
有关影响因子尚未有系统的研究报道。作者以小菊 ‘七月红 ’为试材 , 建立细胞悬浮培养与植株再
生体系 , 以期为小菊的细胞工程和基因工程等研究与应用奠定基础。
1　材料与方法
供试材料为小菊品种 ‘七月红 ’的试管苗。
用于悬浮培养的愈伤组织诱导 : 取试管苗嫩茎段 (015～017 cm ) 在固体培养基 ①MS + 012 mg·
L - 1 KT + 110 mg·L - 1 NAA + 012 mg·L - 1 2, 42D和 ②MS + 110 mg·L - 1 2, 42D + 012 mg·L - 1 62BA上
诱导愈伤组织。培养基添加 7 g·L - 1琼脂和 30 g·L - 1蔗糖 , pH 612; 培养条件为 (25 ±1) ℃, 弱光
(约 1 000 lx)〔10〕。
细胞悬浮培养 : 愈伤组织接种到液体培养基 MS + 015 mg·L - 1 2, 42D + 012 mg·L - 1 62BA上进行
悬 浮培养。每 100 mL三角瓶中加 25 mL液体培养基 , 接种愈伤组织 2～3 g; 3 d后 , 悬浮液用 300目
(孔径约为 200μm ) 尼龙网过滤 , 收集滤液进行
培养。培养前期 , 每隔 3 d继代 1次 ; 继代 2～3
次后 , 隔 7～10 d再继代并更换培养液。培养条
件为 : 摇床转速 100 r·m in - 1 , ( 25 ±1) ℃, 弱
光。
悬浮细胞诱导愈伤组织 : 采用固液双层培养 ,
即将培养获得的悬浮液用 300目尼龙网过滤 , 滤
液接种到 7种含不同植物生长调节剂的 MS固体
培养基上 (表 1, 琼脂 7 g·L - 1 , 蔗糖 30 g·
L - 1 , pH 612) 进行愈伤组织诱导。每个装有 25
～30 mL固体培养基的 100 mL三角瓶中加 1 mL
滤液 , 在 (25 ±1) ℃、弱光下培养。将悬浮细胞
接种到固体培养基后 , 在 4℃低温冰箱中处理 2、
6、12、24和 48 h。处理后培养条件同上。
愈伤组织分化和植株再生 : 悬浮细胞诱导获得
的愈伤组织转接到 MS分化培养基上 (表 2) 诱导
分化 , 培养条件为 ( 25 ±1 ) ℃, 3 000 lx、 12
h·d - 1光照。分化芽在 MS + 015 mg·L - 1 NAA固
体培养基上诱导生根 , 培养条件为 (25 ±1) ℃, 弱
光。
测量指标 : 以密度积累 (血球记数板记数 )
作为衡量悬浮细胞生长速率的指标。植板率为肉
眼可见的愈伤组织块数与 1 mL过滤液所含细胞总
数的百分比。
表 1　悬浮细胞愈伤组织诱导培养基
Table 1　Culture m ed ia for ca llus induction of suspen sion cells
培养基代号
Medium code
植物生长调节剂 Plant growth regulator(mg·L - 1 )
62BA KT NAA 2, 42D
1 0 0 0 012
2 012 0 0 012
3 012 0 0 015
4 015 0 0 012
5 0 012 012 0
6 0 012 0 012
7 0 012 110 0
表 2　愈伤组织分化培养基
Table 2　Culture m ed ia for ca llus d ifferen tia tion
培养基代号
Medium code
植物生长调节剂 Plant growth regulator(mg·L - 1 )
62BA NAA KT
A1 210 011 0
A2 410 011 0
A3 610 011 0
B1 210 0105 0
B2 410 0105 0
B3 610 0105 0
C1 0 011 210
C2 0 011 410
C3 0 011 610
D1 0 0105 210
D2 0 0105 410
D3 0 0105 610
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　5期 陈发棣等 : 小菊悬浮细胞培养与植株再生研究 　
2　结果与分析
211　细胞悬浮培养
培养基 ①和 ②中均获得了大量颜色浅绿、颗粒细小、外观湿润、生长迅速、质地疏松的适合用于
细胞悬浮培养的愈伤组织。获得的愈伤组织在 MS + 015 mg·L - 1 2, 42D + 012 mg·L - 1 62BA液体培养
基中振荡培养建立悬浮细胞系。悬浮细胞系由不规则细长细胞和椭圆形细胞组成 , 不规则细长细胞的
细胞质密度低 , 液泡大 , 呈透明状 ; 椭圆形细胞的细胞质浓厚 , 有丰富的颗粒状内含物 , 通常由 10
～30个细胞形成细胞团。经过几次继代之后 , 不规则的细长细胞比例减少 , 椭圆形细胞和细胞团比
例增多 (图 1)。
图 1　小菊 ‘七月红’形成的悬浮细胞和细胞团
A. 悬浮细胞 ( I: 不规则细长细胞 ; R: 椭圆形细胞 ; C: 细胞团 ) , ×100; B. 细胞团 , ×200。
F ig. 1　Suspen sion cells and cell aggrega tes of D endran them a ×grandiflorum‘Q iyuehong’
A. Suspension cell ( I: Irregularly shaped and elongated cell; R: Round isodiametric cell;
C: Cell aggregates) , ×100; B. Cell aggregates, ×200.
悬浮细胞开始培养后 , 悬浮液的 pH值从最初的 612缓慢下降 , 前 4 d降幅约为 012; 到第 8天时
迅速降到 513, 4 d降幅达 017; 到第 10天时进一步降为 511 (图 2)。悬浮单细胞在培养 3～5 d内即
可观察到细胞分裂 , 约 6 d可形成小细胞团。培养 12 d后 , 悬浮细胞的密度从 117 ×103 ·mL - 1增加
到约 13 ×103 ·mL - 1 , 整个生长可大致分为缓慢生长期 (0～2 d)、对数生长期 (2～10 d) 和停滞期
(10 d以后 )。pH值的变化与细胞生长速率相关 , 在缓慢生长期 pH值下降很少 , 对数生长期迅速下
降。到 10 d时培养液已过酸 , 细胞分裂和生长进入停滞期 (图 3)。
图 2　细胞悬浮培养过程 pH的变化
F ig. 2　Change of pH dur ing the culture per iod
图 3　悬浮培养过程细胞生长曲线
F ig. 3　Growth curve of suspen sion cells
212　悬浮细胞诱导形成愈伤组织
21211　用于悬浮细胞培养的愈伤组织来源和培养基对植板率的影响 　培养基 ①诱导的愈伤组织
(C1) 和培养基 ②诱导的愈伤组织 (C2) 分别用于悬浮细胞培养 , 并进一步进行愈伤组织诱导 , 发
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现悬浮细胞的愈伤组织诱导在 7种培养基 (表 1)
上反应不同 , 其中以 6号培养基差异最大 , 其它
培养基差异不明显。C1在 6号培养基上植板率最
高 , 为 01092% , 而 C2还不到 0102% , 相差约 5
倍。C1和 C2在 4号培养基上植板率也较高 , 约
为 0102% ; C1和 C2在 1、3和 5号培养基上的植
板率均为零 (图 4)。因此可以得出 , 一定浓度的
2, 42D (012 mg·L - 1 ) 有利于悬浮细胞愈伤组织
诱导 , KT效果好于 62BA; 愈伤组织 C1更适合用
来建立小菊悬浮细胞系。
21212　低温处理对植板率的影响　将愈伤组织 C1 图 4　前期愈伤组织来源和培养基对植板率的影响F ig. 4　Effects of or ig ina l ca lli and d ifferen t culturem ed ia on pla ting eff ic iency
获得的悬浮细胞接种到 4号培养基上 , 进行 4℃低温处理。由图 5可以看出 , 处理 2 h, 植板率由
01020%升高到 01023% , 但处理 6 h时植板率迅速降为 01011% , 处理 12 h时仅为 01002%。
21213　继代次数对植板率的影响 　随着细胞悬浮培养继代次数的增加 , 悬浮细胞在 4号培养基 (表
1) 上的植板率逐渐下降 (图 6)。继代 3次以内 , 植板率下降不明显 ; 继代 6次时植板率由 0102%下
降到 01004% ; 继代 9次时降为 01001% ; 继代 12次时降为 0。
图 5　低温 ( 4℃) 对植板率的影响
F ig. 5　Effects of low tem pera ture ( 4℃) on pla ting eff ic iency
图 6　继代次数对植板率的影响
F ig. 6　Effects of subculture tim es on pla ting eff ic iency
213　愈伤组织分化和植株再生
　　褐化是影响悬浮细胞愈伤组织分化的一个主要
因素。将悬浮细胞诱导获得的愈伤组织 (图 8, A)
转到不同分化培养基 (表 2) 上进行培养 , 在所有
培养基上都观察到了不同程度的愈伤组织褐化现象
(图 7)。在含有 62BA 的培养基 (A1 ～A3 , B1 ～
B3 ) 上 , 愈伤组织褐化率相对较低 ; 62BA或 KT的
浓度由 210 mg·L - 1升高到 610 mg·L - 1时 (A1 ～
A3 , B1 ～B3 , C1 ～C3 , D1 ～D3 ) , 愈伤组织的褐化
率均呈上升趋势 , 当含有 62BA时 , 愈伤组织褐化
率上升幅度较小 ; 而 NAA的浓度以 011 mg·L - 1较
为适宜。A1 培养基的褐化率最低 (图 7)。 图 7　不同分化培养基对愈伤组织褐化率的影响F ig. 7　Effects of d ifferen t m ed ia on the brown ing ra te of ca lli
　　将未褐化的愈伤组织及时转接到 A1 培养基上。愈伤组织迅速生长 , 1个月后由黄绿色转为绿色
(图 8, B )。经过 4次继代后开始分化 (图 8, C) , 分化率达 80%以上。将 1 cm左右的分化芽转接到
生根培养基 MS + 015 mg·L - 1 NAA上诱导生根 , 20 d后形成小植株 (图 8, D )。
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图 8　愈伤组织形成、分化与植株再生
A. 悬浮细胞诱导获得愈伤组织 ; B. 愈伤组织在分化培养基上生长 ; C. 愈伤组织分化 ; D. 分化芽生根形成小植株。
F ig. 8　 Induction, d ifferen tia tion of ca lli and regenera tion of plan tlet
A. Induction of calli from suspension cells; B. Growth of calli on differentiation medium; C. Shoots differentiation from the calli;
D. Regeneration of p lantlet.
3　讨论
用于细胞悬浮培养的愈伤组织来源和状态、悬浮细胞的培养密度、继代次数和周期、培养基的类
型和植物生长调节剂配比等均可能对悬浮细胞的增殖率、愈伤组织的植板率和分化率等产生较大的影
响〔11〕, 因此 , 在建立悬浮细胞系时要综合考虑多因子的影响。悬浮细胞系的获得大多来源于胚性愈
伤组织〔12〕, 我们采用疏松易碎的胚性愈伤组织为材料进行悬浮培养 , 获得了小菊悬浮细胞系。悬浮
培养的单细胞在 3～5 d内即可观察到细胞分裂 , 约 6 d即可形成小细胞团 , 整个生长曲线呈上升的半
抛物线型 , 与紫檀〔11〕、Solanum dulcam ara〔13〕的生长曲线相似。在悬浮细胞培养过程 , 培养基 pH值
随着培养时间的延长而下降 , 下降速率与细胞生长曲线相对应 , 是否是因为生长细胞在吸收营养过程
使自身膨压降低 , 从而刺激质膜 H + 2ATP酶的活性 , 促进 H +分泌 , 值得进一步研究。
悬浮细胞处于对数生长期时收集并进行培养 , 植板率最高 , 如果收集时间错过对数生长期 , 培养
后的植板率将迅速下降〔11〕, 因此 , 在小菊悬浮细胞培养时 , 应收集培养 2～10 d后的细胞。悬浮细
胞随着继代次数的增加 , 植板率下降 , 到继代 12次时植板率降为零 , 对小菊来说 , 继代次数以不超
过 3次为宜。低温预处理能有效提高小麦、水稻等花粉、花药悬浮培养的诱导率〔14〕, 本试验也发现
短期的低温处理可在一定程度上提高小菊悬浮细胞的植板率 , 但随着处理时间的延长 , 植板率迅速下
降。Preil等〔9〕报道 , 悬浮细胞在经过一段时间 (90 d) 低温 (6℃) 培养后 , 由其再生的愈伤组织将
大大减少 ; 而经过不同剂量 X射线辐射后再低温培养一段时间 , 再生的愈伤组织则更少 , 只有未经
辐射处理的 10% ～20%。因此为了提高再生的愈伤组织数量 , 应严格控制低温处理时间。植板率是
衡量悬浮细胞培养过程再生形成愈伤组织能力最重要的指标 , 其统计通常为培养一段时间后悬浮液中多
细胞团与接种的细胞数的百分比。我们认为在菊花的悬浮培养过程中 , 在初始的滤液中既含有单细胞也
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含有多细胞团 , 多细胞团是原先悬浮液中存在还是后来由单细胞分裂生长而来不易区分 , 且多细胞团在
后期的生长过程中有一部分将不能继续生长 , 所以我们认为统计培养一定时间后肉眼可见的愈伤组织与
接种的细胞数目的百分比为植板率更有效 , 也正是由此我们得到的植板率就相对较低。
悬浮细胞愈伤组织诱导培养需要添加不同的生长素和细胞分裂素。生长素 2, 42D在提高小菊悬浮
细胞植板率方面明显好于 NAA , 在添加 2, 42D的培养基上 , 62BA浓度与植板率存在正相关。在分化
培养基上 , 当 NAA浓度不变时 , 随着细胞分裂素 62BA或 KT浓度的升高 , 愈伤组织的褐化率呈上升
趋势 , 细胞分裂素浓度与褐化率也表现为正相关 , 但这种现象在其他植物悬浮细胞培养时并没有发
现〔12〕, 可能不同植物对植物生长调节剂的响应或植物材料本身易褐化程度存在差异。
综上所述 , 我们以小菊 ‘七月红 ’品种为试材建立了菊花悬浮细胞培养再生体系 : 以组培苗茎
段为材料 , 在培养基 MS + 110 mg·L - 1 2, 42D + 012 mg·L - 1 62BA上诱导生长迅速、质地疏松的愈伤
组织 ; 将获得的愈伤组织在 MS + 015 mg·L - 1 2, 42D + 012 mg·L - 1 62BA液体培养基中振荡培养 , 建
立细胞悬浮培养系 ; 悬浮液用 300目尼龙网过滤 , 滤液接种到固体培养基 MS + 012 mg·L - 1 KT + 012
mg·L - 1 2, 42D上进行固液双层培养 ; 培养约 1个月后 , 形成直径约 012 cm的愈伤组织块 , 将其转到
MS + 2 mg·L - 1 62BA + 011 mg·L - 1 NAA培养基后 , 继代 4次 , 分化出芽 ; 分化芽在培养基上诱导生
根 , 形成小植株。
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