全 文 ：表 4　扁藻多糖对小鼠肿瘤的抑制作用
Table 4　The inhibition of polysaccharide from P.subcordigoramis (Will)
Hanzen on melanoma in mice
组别 体重(g) 平均体重(g) 瘤重(g)
平均瘤重
(g)
抑瘤率
(%)
对照组 21.3 , 22 ,20 ,16 ,
21 ,20.8 ,18 ,18.7 ,
20 ,19.4
19.72 0.8 ,1.5 ,1.3 ,
1.0 ,1.5 ,1.5 ,
1.0 ,1.4 ,1.3 , 1.4
1.27
实验组 26.5 , 24 ,26 ,
23.5 , 20 ,21 ,20 ,
20.2 , 25 ,23
22.92 1.5 ,1.0 ,0.9 , 0.1 ,
0.5 ,1.0 ,0.6 , 0.6 ,
1.1 ,1.0
0.83 34.2
3　讨论
本实验利用乙醇沉淀和葡聚糖凝胶层析从亚心型扁藻细
胞内分离纯化出一级扁藻多糖。对其进行性质和结构特征分
析的结果表明 ,此扁藻多糖与文献报道的某些已知微藻多糖
只含有硫酸基不同 ,其同时含有硫酸基和氨基特征峰 ,此外还
含有多种已知及未知的单糖糖基和糖醛酸 , 说明扁藻多糖的
结构和组成更复杂 , 因此需要进一步分离纯化获得更纯的扁
藻多糖纯品以进行更好的结构研究。将其初步用于小鼠体内
的肿瘤抑制作用实验 ,结果表明接种肿瘤后的小鼠在培养至
11 的 d 时 ,此多糖对肿瘤的抑制率为 34.2%, 说明其对小鼠体
内黑色素瘤具有一定的抑制作用 , 同时对小鼠的生长无毒性
及副作用 ,对此应进一步进行深入的 、系统的 、完整的实验研
究 , 为扁藻多糖在医疗方面作为抗肿瘤药物的可能应用提供
实验数据和科学依据。
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不同因素对岩黄连悬浮细胞生长的影响
程华1 , 2 ,余龙江3
(1.武汉科技大学医学院 ,湖北 武汉 430065;2.武汉烟草(集团)有限公司技术中心 ,湖北 武汉 430051;
3.华中科技大学生命科学与技术学院 ,湖北 武汉 430074)
摘要:目的:建立一个快速生长的岩黄连悬浮细胞培养体系。方法:研究了接种量 、基本培养基 、初始 pH值 、不同碳源对岩黄
连悬浮细胞生长的影响。结果:合适的接种量是 7.5～ 10%(FW), 接种量过少会抑制细胞生长;B5 和 MS 基本培养基均适合岩黄
连细胞的生长;最佳初始培养基 pH 值为 6.0 ,此时获得的细胞生物量最高;岩黄连悬浮细胞培养的生长周期为 24d , 最大生物量
出现在第 18d , 达到 14.1g l(DW);蔗糖比葡萄糖更有利于岩黄连细胞的生长 , 添加 60g l蔗糖所获得的生物量最高 , 达到 18.5g l
(DW)。
关键词:悬浮细胞培养;岩黄连;接种量
中图分类号:Q282.13　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2007)03-0056-04
Effects of Different Factors on Cell Growth of Corydalis
saxicola Bunting Suspension Cultures
CHENG Hua
1 ,2 , YU Long-jiang3
(1.Medical College , Wuhan University of Science and Technology , Wuhan 430065, China;2.Center of Technology , Wuhan Tobacco
Co.Ltd , Wuhan 430051 , China;3.College of Life Science and Technology , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430074 , China)
Abstract:Objective:Cell suspension cultures were established through selection of inoculum size.Methods:Basal medium , initial pH value , and
carbon resource.Results:An inoculum size of 7.5-10%(FW)was suitable for cell growth and small inoculum size could impress biomass accu-
mulation.The B5 and MS basal medium were fit to cell growth , and the favorable initial pH value of medium was 6.0.The growth period of C.
saxicola cell cultures was around 24d with highest biomass on day 18.Sucrose was much better than glucose for cell growth;the addition of 60g
l sucrose produced the most biomass with 18.5g l(DW).
Key words:cell suspension culture;Corydalis saxicola Bunting;inoculum size
收稿日期:2006-12-21;修回日期:2007-03-09
作者简介:程华(1978-),男 ,湖北应城人 ,博士 ,从事药用植物资源研
究与开发 , E-mail:hbchh2008@163.com;余龙江(1966-)男 ,湖北黄梅
人 ,教授 ,博士生导师 ,从事资源生物学研究。
　　岩黄连(Corydalis saxicola Bunting), 紫堇科紫堇属植物 , 多
年生草本[1 ,2] 。全草含脱氢卡维丁(dehydrocavidine)、小檗碱
(berberine)等多种活性生物碱成分[ 3-5] ;是桂西北山区常用于
消炎 、止痛 、排毒 , 治疗急慢性肝炎和肝硬化等疾病的一种中
草药[ 5] 。岩黄连野生资源少[ 2 , 6] , 被列入中国南部石灰岩濒危
植物名录[ 1] 。目前制成岩黄连总生物碱的注射液和片剂 , 临
床主治肝炎[ 7-10] , 疗效较佳 ,特别是对乙型肝炎[11 , 12] 。由于岩
黄连巨大的经济价值 ,引起人们大量采挖和收购 , 导致岩黄连
资源进一步匮乏。因此 ,有必要考虑开发其他途径来获得更
多的岩黄连资源 ,维持其可持续开发利用。
植物悬浮细胞培养是利用现代生物技术开发植物资源的
重要手段之一[13 , 14] , 是一种可持续开发利用植物资源的重要
措施[13] , 为大规模反应器培养和工业化生产提供依据 , 同时也
是一种缓解资源危机的潜在有效方法。我们已经获得岩黄连
离体培养的细胞 , 并确定其中含有活性生物碱成分[ 15] 。由于
培养细胞的生长速度慢 , 生物量低 , 导致利用岩黄连细胞培养
生产岩黄连生物碱的研究进展缓慢。在植物悬浮细胞培养的
过程中 , 通常有许多因素决定细胞的生长速率和生物量。 为
了提高岩黄连细胞的生长速率 , 获得较高的生物量 , 本文对岩
黄连悬浮细胞培养的条件进行优化 ,研究接种量 、基本培养基
和碳源等不同因素对岩黄连悬浮细胞生长的影响 , 以建立一
个快速生长的岩黄连悬浮细胞培养体系。目前 , 有关此方面
的研究未见报道。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
第 17卷第 3 期:56
2007 年 6 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.17 , No.3:56
Jun.2007
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2007.03.022
岩黄连细胞从岩黄连叶片(植株采自广西东兰县)中诱导
获得[ 15] ,稳定继代培养 1 年多。
1.1.2　仪器与试剂
PHS-2C 酸度计(上海雷磁仪器厂);AE100S 型分析天平
(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);蒸馏水器(上海申安医
疗器械厂);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);烘箱(常州市
豪龙干燥设备有限公司)。所用试剂均为国产分析纯。
1.1.3　培养基
悬浮培养采用 B5 基本培养基 , 添加 0.5 mg l 2 , 4-D、2
mg l 6-BA 和 3%蔗糖 , 无琼脂 ,液体培养。
1.2　方法
1.2.1　细胞生长测定
摇瓶培养 ,每 3d 收集一次 , 培养物经布式漏斗抽滤 , 用蒸
馏水将残留的培养液冲洗干净 ,再次抽滤得到细胞鲜重(FW),
然后将所得细胞置 50℃烘箱干燥至恒重(约 48h),称重得到细
胞干重(DW)。
1.2.2　不同因素对岩黄连细胞生长的影响
分别调节接种量 、基本培养基 、初始 pH 值以及碳源 , 测定
细胞生物量。岩黄连细胞的接种量为 8g 每 80ml , 培养 21d 后
收集。培养条件:采用 250ml三角瓶 ,装液量 80ml , 摇瓶培养 ,
转速为(130±5)r min。温度(25±1)℃, 暗培养。
1.2.3　数据分析
重复三次实验 ,结果取 3 次实验的平均值 , 以 mean±S.D.
表示 , 采用 SPSS 软件包处理 , 进行方差分析 , t 检验 , P<0.05
表示有显著性差异。
2　结果与分析
2.1　接种量对悬浮培养的影响
接种 2 ～ 8g鲜重细胞到 80ml B5 培养液中进行培养 , 培养
液添加 0.5mg l 2 , 4-D、2mg l 6-BA 和 3%蔗糖 , 结果见图 1。
从图中可以看出 , 接种量对细胞生长有显著影响。其中接种
8g 鲜细胞生长最快 ,到第 21d达到最高 , 生物量提高了 4 倍左
右。接种 6g时 , 其细胞生长曲线与接种 8g 相似 , 在开始 12d
缓慢生长 , 15d 后生物量迅速升高 , 21d后进入生长稳定期。接
种4g时 ,细胞生长缓慢 , 12d 后才出现明显的增长。对于接种
2g ,在整个培养过程中 , 生物量没有明显增加 , 随着时间延长 ,
可见培养液中细胞残骸逐渐增多。
图 1　接种量对岩黄连悬浮细胞生长的影响
Fig.1　Effects of various inoculum sizes on cell growth in C.saxicola cell sus-
pension cultures
The suspension cells were grown in liquid B5 medium containing 0.5mg L 2 , 4
-D and 2.0mg L BA , and incubated on a rotary shaker at (25±1)℃ in
dark.□=2g callus;○=4g callus;△=6g cal lus; =8g callus.Values
are means of three independent cultures.Error bars represent±S.D.
2.2　基本培养基对悬浮细胞生长的影响
分别以 MS 、B5 、White 为基本培养基 , 添加 0.5mg l 2 , 4-
D、2mg l 6-BA和 3%蔗糖 , 接种 8g岩黄连鲜细胞到 80ml培养
液中 ,暗培养 21d 后收集 ,烘干称重 , 不同基本培养基对岩黄连
细胞生长的影响见图 2。 B5 培养基所得到细胞干重最高 , 达
到 13.6g l , 其次是MS 培养基 , 方差分析显示 B5 和 MS 培养基
收获的细胞量没有显著差别(P>0.05)。White 培养基所得细
胞量低 , 与 B5 和MS 培养基差异显著(P<0.05), 只占 B5 培养
基所得生物量的 50%。
图 2　基本培养基对岩黄连细胞生长的影响
Fig.2　Effects of basic medium on cell growth of C.saxicola
Data indicate means of three independent experiments(means±S.D.).
2.3　初始 pH值对岩黄连悬浮培养细胞的影响
以 B5 为基本培养基 , 添加0.5mg l 2 , 4-D、2mg l 6-BA 和
3%蔗糖 , 并分别调节培养液初始 pH 值为 4.5、5.0 、5.5 、6.0 、6.
5 , 以 10%的接种量接入岩黄连鲜细胞 , 暗培养 21d 后收集 , 烘
干称重。培养液的初始 pH 值对岩黄连细胞生长的影响如图
3。当 pH 值位于4.5到 6.0 之间时 , 随着pH 值的增加 ,收获的
细胞干重增加 , 至 pH 值为 6.0 时达到最大值。当 pH 值位于
6.0 到 6.5 之间 , 随着 pH 的增加 , 收获的细胞干重逐渐降低。
图 3　培养基初始 pH 值对岩黄连细胞生长的影响
Fig.3　Effects of initial pH values of medium on the cell growth
Data indicate means of three independent experiments(means±S.D.).
2.4　悬浮细胞继代培养
将得到的岩黄连悬浮培养细胞转接到新鲜培养基中进行
继代培养 , 接种量为 10%, 经过多次继代培养 , 得到稳定生长
的岩黄连悬浮细胞。如图 4 所示 , 悬浮培养中细胞生长周期
为 24d 左右。悬浮培养细胞在培养的前 6d 生长缓慢 , 出现明
显的延迟期 , 6d之后 , 生物量快速增长 , 最大生物量出现在第
18d ,细胞干重和鲜重分别为 14.1g l、388.3g l。
2.5　不同碳源对悬浮细胞生长的影响
B5 培养基中添加不同浓度的蔗糖或葡萄糖与细胞生长的
关系见图 5。从图中可以看出 ,以蔗糖作为碳源时收获的细胞
干重高于以相同葡萄糖作为碳源时收获的细胞干重 , 80g l 时
两者无显著差异(P>0.05)。蔗糖浓度对细胞生物量的也有显
著影响。随着蔗糖浓度从 10g l提高到 60g l ,细胞生物量(干
重)随着升高 ,从 8.1g l提高到 18.5g l。当蔗糖浓度进一步增
加到 80g l ,生物量反而下降。以葡萄糖为碳源时 , 随着葡萄糖
浓度的增大 , 细胞干重也随着逐渐增加。
572007 年 6 月　　　　　　　　　　　　　　　　不同因素对岩黄连悬浮细胞生长的影响　　　　　　　　　　　　　　　　
图 4　岩黄连悬浮细胞生长曲线
Fig.4　Time course of biomass accumulation in suspension cell cultures of C.
saxicola
DW , dry weight of biomass;FW , f resh weight of biomass.Values represent
means±S.D.(n=3).
图 5　糖浓度对岩黄连细胞生长的影响
Fig.5　Effect s of sugar concent rations on cell suspension cultures of C.saxico-
la
Data indicate means of three independent experiments(means±S.D.).□
glucose;◆ sucrose.
3　讨论
在植物悬浮细胞培养中 ,细胞生长需要一定密度的细胞 ,
密度过低 ,不利于悬浮细胞的生长。 Akalezi C.O.报道在 Pan-
ax gingeng 悬浮培养中 , 接种量为 1.5 g l时细胞生长缓慢[ 16] 。
在 Coleus forskohlii 悬浮细胞培养中也观察到类似的现象[ 17] 。
Sakano K.等报道低接种量严重抑制了 Catharanthus roseus 细胞
的增殖[ 18] 。在 Marchantia polymorpha 细胞培养中 , 最佳接种量
是 8～ 12%(FW)[19] 。本实验表明 , 在岩黄连悬浮细胞培养中 ,
接种量为2g 时严重抑制细胞生长 ,这与前人研究结果相似;接
种量为 6～ 8g时收获的生物量较高 ,表明合适的接种量为 7.5
～ 10%(FW)。Gorret N.等[ 20]认为合适的接种量对悬浮细胞培
养中生物量的积累起着积极作用。
对基本培养基进行选择优化 , 发现 B5 培养基和 MS 均适
合岩黄连细胞的生长 , 收获的细胞量没有显著差别 , 而White
不适合岩黄连细胞生长。尽管植物细胞对周围环境的 pH 有
自适应机制 ,但培养基过高或过低的 pH 均不利于植物细胞的
生长 ,通常在植物细胞培养中初始 pH 值保持在5.5～ 6.0 之间
较为适宜。通过实验研究发现最佳初始培养基 pH 值为 6.0 ,
此时获得的细胞生物量最高。通过将岩黄连悬浮培养细胞连
续转接到新鲜培养基中的方法 , 进行多次继代培养 , 得到生长
稳定快速的悬浮细胞培养体系。悬浮细胞生长周期为 24d 左
右 ,最大生物量出现在第 18d , 表明该液体培养基能适合岩黄
连细胞的生长 ,可用于进一步放大培养或代谢调控研究。
蔗糖或葡萄糖是植物细胞培养中常用的碳源 , 本实验研
究表明相同浓度的蔗糖比葡萄糖更有利于岩黄连细胞的生
长 ,结果存在明显差异。在植物细胞培养中 , 高浓度的糖源可
以提高细胞的生物量和次生代谢产物的含量[ 16 ,21] 。 Kim M.
H.等[ 22] 报导调控蔗糖浓度可以提高 Micrococcus sp.悬浮培养
中的细胞生物量。 Pasquali G.等[ 21]研究发现高浓度蔗糖也有
利于 Camptotheca acuminata Decaisne细胞的生长。Zhao J.等[ 23]
研究发现在长春花细胞培养中 , 5 ～ 6%的蔗糖含量有助于生
物量的提高。蔗糖浓度对不同植物悬浮细胞培养的影响不尽
相同 , 本实验中发现 60g L蔗糖所获得的生物量最高 ,比 30g L
蔗糖所获得的生物量高 15%左右 , 而更高的蔗糖浓度却显示
抑制岩黄连细胞的生长。在 Panax ginseng [16] 和 Camptotheca
acuminata [21]细胞培养中也发现相似的现象。 这可能时由于蔗
糖浓度过高导致培养液渗透压升高 ,从而不利于植物细胞生
长。
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微生物絮凝剂产生菌的选育及絮凝特性研究
费文砚 ,吴涓＊(安徽大学生命科学学院 ,安徽 合肥 230039)
摘要:目的:从土壤中筛选具有良好絮凝活性的菌株进行优化培养并研究其絮凝特性。方法:采用平板划线法分离纯化获得
目的菌株 ,通过单因素和正交实验确定最适培养 、絮凝条件 ,考察该菌的生长及产絮凝剂的周期和絮凝活性分布等特征 , 及其对
次甲基兰的脱色能力。结果:得到絮凝活性较高的菌株 C5 , 其最适产絮条件为:初始 pH 值 7.5 ,温度 36℃, 培养时间 48h;最适培
养基为:葡萄糖 10g , KH2PO4 2g , K2HPO4 5g ,(NH4)2 SO4 0.2g ,尿素 0.5g , 酵母膏 0.5g , NaCl 0.1g ,MgSO4·7H2O 0.2g , 絮凝率可达 92.
0%;最适絮凝条件为:2.5mL发酵液 , pH 6.0 , 5mL CaCl2 溶液;絮凝活性成分主要为多糖和蛋白质 , 多分布于胞外上清液中;发酵
液的絮凝活性与细胞生长量均在培养 48h 时达最大;对次甲基兰的脱色能力优于硫酸铝和聚丙烯酰胺 , 2min内脱色率可达 97%。
结论:菌株 C5 可产高絮凝活性的絮凝剂 , 具有良好的应用前景。
关键词:微生物絮凝剂;筛选;絮凝活性;絮凝率;脱色
中图分类号:X172　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2007)03-0059-05
Screening of Bioflocculant-producing Strain and Study on
Flocculating Characteristics
FEI Wen-yan , WU Juan＊
(Institute of Life Sciences , Anhui University , Hefei 230039, China)
Abstract:Objectives:A bioflocculant-producing strain with high flocculating activity was isolated from soil , and its flocculating characteristics
were investigated.Methods:The target strain was obtained by plate thread separate method , purify and screen paths.Optimal culture-flocculat-
ing conditions were found by single fact and multi factors orthogonal experiments.The growth period , flocculant-producing period and activity
distribution were investigated.The decolorization experiments of methy lene blue by bioflocculant , Al2(SO4)3 and polyacrylamide were carried out ,
respectively.Results:A bioflocculant-producing strain named C5 with high flocculating activity was obtained.The optimum culture conditions
were:pH7.5 of initial pH , 36℃ of culture temperature , and 48h of culture period , and the optimum culture medium were glucose 10g , KH2PO4
2g , K2HPO4 5g ,(NH4)2 SO4 0.2g , urea 0.5g , yeast 0.5g , NaCl 0.1g ,MgSO4·7H2O 0.2g , and 92.0% of flocculating rate was reached.Through
orthogonal test , the optimal flocculating conditions were found to be:2.5mL of microbial flocculant dosage , pH 6.0 and 5mL of 1% CaCl2.Most
of the bioflocculants were concentrated in the supernatant , and were mainly composed of polysaccharide and protein.Both the highest growth of
cells and the highest flocculating activity were obtained at 48h of culture.The decolorizing rate of methylene blue by bioflocculant was better than
that of Al2(SO4)3 and polyacrylamide , and 97% of decolorizing rate was reached in 2 minutes.Conclusion:High flocculating activity was found
in bioflocculant-producing strain C5 which had a good potential in application.
Key words:bioflocculant;screening;distribution of bioflocculant;flocculating rate;decolorization
收稿日期:2007-03-28;修回日期:2007-04-14
基金项目:安徽省自然科学基金项目资助(编号:070413132)
作者简介:费文砚(1981-),女 ,安徽人 ,硕士生 ,研究方向:环境生物
技术 , E-mail:feiwenyan@sina.com;＊通讯作者:吴涓(1969-),女 ,
博士 ,副教授 ,从事水污染控制工程 、环境微生物技术研究 ,发表论文
12篇 ,SCI收录 5篇 ,Tel:0551-5107341 , E-mail:wujuan@ustc.edu。
　　传统的无机絮凝剂及人工合成的有机絮凝剂的大量使
用 ,造成了环境二次污染 , 危害人类健康。而微生物絮凝剂是
微生物菌体产生的生物高分子物质 , 是一种新型的天然有机
高分子絮凝剂 ,它具有生物可降解性 , 且有高效 、安全 、无毒 、
不会造成二次污染等特点 ,因此研究和应用高效低耗 、安全无
害 、无二次污染的絮凝剂是目前提高水环境质量和水污染控
制科学技术水平的重要途径。近年来 , 国外对微生物絮凝剂
作了大量研究 ,筛选得到了细菌 、真菌等几十种具有良好产絮
能力的微生物[1 ,2] , 其中最典型的是利用红平红球菌(Rhodo-
coccus erythropolis)研制成功的微生物絮凝剂 NOC-1[3] ,它对泥
浆水 、河水 、粉煤灰水 、膨胀污泥及纸浆废水等均具有极好的
絮凝和脱色效果。此外比较有代表性的还有 Nakamuara Junji
等人以酱油曲霉(Aspergillus)为原料生产的 AJ7002微生物絮凝
剂[ 4] , 以及 Takaji Hiroaki等人以拟青霉素(Paecilomyces sp.Ⅰ -
1)为原料生产的 PF101 絮凝剂[ 5] 。我国的微生物絮凝剂的研
究起步较晚 , 大多还处于菌种筛选和培养条件的优化等方
面[ 6] 。山东大学的王曙光等从土壤中筛选得到一株土壤杆
菌 ,并得到了以酱油酿造废水为培养基生产微生物絮凝剂 GIL
-1 的最佳条件[ 7] 。四川大学的周李等从活性污泥中筛选出
一株活性高 、用量少的微生物絮凝剂产生菌MBF-33[ 8] 。
虽然目前已发现多种微生物能够产生絮凝剂 , 但目前微
生物絮凝剂研究面临的主要问题是新型微生物絮凝剂产生菌
的筛选 、培养成本的降低 、絮凝活性的提高和絮凝剂用量的减
少。本研究拟从土壤中筛选出絮凝活性较高的微生物絮凝剂
产生菌 , 并对其培养条件和絮凝条件进行优化以期提高絮凝
活性。同时以次甲基兰为受试对象 , 比较所筛选得到的微生
物絮凝剂 、无机絮凝剂和有机絮凝剂对次甲基兰的脱色能力 ,
从而为微生物絮凝剂的应用提供理论依据。本文所筛选得到
的微生物絮凝剂产生菌对次甲基兰的高效 、快速的脱色能力
在国内鲜见报道。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
安徽大学生化大楼前的花房土壤。
1.1.2　试剂
NaCl;KH2PO4;K2HPO4;MgSO4·7H2O;CaCl2;(NH4)2SO4;
NH4NO3;NH4Cl;CuSO4·5H2O;FeSO4·7H2O;MnSO4·H2O;AlCl3;
尿素;HCl;NaOH;95%的乙醇;Al2(SO4)3·18H2O;聚丙烯酰胺;
亚甲基兰;以上试剂均为分析纯 ,购自国药集团化学试剂有限
公司。牛肉膏;蛋白胨;酵母膏;L-谷氨酸;葡萄糖;D-果糖;
麦芽糖;D-木糖;蔗糖;可溶性淀粉;乳糖;琼脂;以上生化试剂
大多为分析纯 , 购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。 200
目过筛高岭土(化学纯 ,购自国药集团化学试剂有限公司)。
1.1.3　仪器
第 17卷第 3 期:59
2007 年 6 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.17 , No.3:59
Jun.2007