全 文 ：时珍国医国药 2( ) X7 年第 8 1卷第 9 期 U S H IZHE N ME D I CIN E A N D MA TE RI A MED I CA R ES EA R H Z C( ) X7 V O L. 8 N 10. 9
令药理药化令
黑 曲霉诱导子促进岩黄连悬浮细胞中生物碱的合成
程 华 , ,2 , 张玉芹 ’ , 余龙江 , , 敖明章3
、
(l
. 武汉科技大学医学院 ,湖北 武汉 4义。的 ; 2 . 武汉烟章(集团 )有限公司技术中心 ,湖北 武汉 4 30 仍 1 ;
3
. 华中科技大学生命科学与技术学院 ,湖北 武汉 43 X() 74 )
摘要 : 目的 为了提高岩黄连悬浮培养细胞 中生物城的产童 。 方法 以 不 同浓度黑 曲霉诱导子 处理岩黄连愚浮培养细
胞 。 结果 生物城的产量随着诱导时间的延长迅速提高 ,到第 6 天达到最大值 ; 添加 50 m扩L 诱导子时生物碱产童最高 ,
达到 89 . Z m『 L , 比对照组高出 2 . 5 倍 , 当诱导子浓度进一步升高时 , 生物碱产童反而降低 ;随着诱导子浓度从 o m『 L增
大到 巧o m『L , 细胞生物黄反而逐渐减少。 结论 黑曲霉诱导子可促进岩黄连细胞中生物碱的合成 ,最佳诱导子浓度是
50 m了;L 过高浓度的诱导子并不利于细胞生长和生物碱合成 , 细胞生物圣的减少是导致生物碱产童下降的一个重要原
因。 该处理提供了一种简单有效的方 法提高岩黄连细胞培养中生物碱的产童 。
关健词 : 只 曲霉 ; 悬浮细胞培养 ; 岩黄连 ; 诱导子
中图分类号 :甲82 . 13 文献标识码 : A 文章编号 : 10 8刀8 05 ( 20 7 ) o 一 190 习2
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真菌诱导子被广泛用于促进植物细胞中代谢产物的合成 ,在
多种植物的悬浮培养细胞中显示出高效诱导性 ,成为近年来体外
细胞培养生产有用天然产物的研究热点〔’ 一 ’ 〕 。 黑曲霉 . 娜哪￡-
如 叭罗 r )是一种广泛分布在土壤和空气中的真菌 ,由黑曲霉制备
的诱导子被证明能促进多种植物细胞培养物中特定代谢产物的
合成 , Hu an g 等川使用来源于黑曲霉的诱导子 ,提高了红豆杉细
胞培养中抗癌药物一紫杉醇的含量 , aN m d eo 等5[] 利用黑曲霉诱
导子提高了长春花细胞培养物中阿吗碱的产量 。 利用真菌诱导
子激活植物细胞中的代谢途径已经成为提高植物细胞培养中目
标产物产量的有效手段之一 [’] 。
岩黄连 ( co 甲奴 15 5以 ic o勿 Bun it gn ) ,紫荃科紫茧属植物 .l6 , 〕 ,
多年生草本 。 全草含脱氢卡维丁 ( d e hyd cor a v id in e ) 、 小粟碱 ( be -r
be inr
e
)等多种活性成分 s[] ;具有显著的抗菌 、 消炎 、镇痛和强安
定作用 ,在民间作为治疗乙肝的特效药。 我们已经建立岩黄连悬
浮细胞培养体系 [,] , 为了提高培养物中生物碱的产量 , 本文以黑
曲称诱导子处理岩黄连悬浮培养细胞 ,研究其对生物碱合成和细
胞生长的影响 ,发现黑曲霉诱导子能有效促进悬浮细胞中生物碱
的合成 。
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.
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收稿日期 : 2X() 7刁 l刃 8 ; 修订日期 二2X() 7习5 一 19
作者简介 :程 华 ( 19 7 8一 ) , 男 (汉族 ) , 湖北应城人 , 现任武汉科技大学医
学院讲师 ,博士 学位 , 主要从事植物生理与生化研究工作 .
1 材料与方法
1
.
1 材料 岩黄连细胞培养参考文献 [,1 方法 。 悬浮培养采用
25 0 耐 三角瓶培养 ,每瓶装培养基 10 耐 ,接种后 ( 25 土 l) ℃恒温
条件下 ( 13 0 土 5) r/ m in 摇床培养 ,细胞接种密度为 10 留 10 耐
( FW / V )
,暗培养 。 诱导子在岩黄连悬浮细胞培养的中期 (第 12
天 )加人 ,对照组加人等体积蒸馏水 。
1
.
2 诱导子的制备 黑曲霉真菌诱导子的制备参考文献 [’J 方
法 。 以糖浓度作为诱导子的浓度 , 用葱酮法测定糖含量后备用 。
1
.
3 生物碱含 t 测定 生物碱的含量测定参考文献方法 [ ’ 0] 。 称
取鲜细胞 1 9 ,加人 20 inl 75 % 酸性乙醇 ,超声提取 3 次 , l 丫次 ,
抽滤 , 取滤液 l 耐 ,加人 。 , 1 m o F L 柠檬酸 一 柠檬酸钠缓冲液( pH
= 5
.
4) s ml
, 以 2 耐 0 . 05 % 澳甲酚绿作为显色剂 ,加入 10 耐 三
抓甲烷萃取 30 m in , 取有机相 ,加人适量无水 N气 5 0 ; 脱水 ,用分
光光度计在 4 16 lun 处测定其光吸收值 ;量取 l 耐 培养液 ,再以
同样方法处理 , 取有机相测定光密度。 以小粟碱作为标准品标示
生物碱含量 , 所测得的生物碱的含量为细胞和培养液中生物碱含
量之和 。
1
.
4 细胞生长测定 以细胞干重作为细胞生长的指标 ,测定方法
同前。 培养物经布式漏斗抽滤 ,用蒸馏水将残留的培养液冲洗干
净 ,再次抽滤得到细胞鲜重 ( FW ) , 然后将所得细胞置 50 ℃ 烘箱
干燥至恒重 ( 约 48 h ) ,称重得到细胞干重 ( DW ) 。 重复 3 次
实验。
·
2 19 0
·
lH SI ZE E H N MD IC D E I N N AM ATE R IE M AD IC E R ASE ARC H Z印 7VL O . 1 8N 0 . 9时珍国医 国药 2) ( X 7年第 1 8卷第 9期
2结果与分析
2
.
1诱导子对生物碱合成的影响 结果见图l 。
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培养 时间 / d
圈 1 生物碱合成的时间曲线
图 1显示添加 50 m岁 L诱导子时岩黄连细胞培养中生物碱
的合成情况 。 从图中可以看出 , 生物碱的产量随着诱导时间的延
长迅速提高 ,到第 6 天达到最大值 ,此时比对照组高出 2 . 5 倍 ,之
后生物碱产量缓慢降低 。 对照组中生物碱的产量在整个培养过
程中逐渐升高 , 至培养末期 (第 9 天 )达到最高 。
2
.
2 诱导子浓度对生物碱产t 的影响 结果见图 2 。
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5 0 1 0 0
诱导子浓度 / . ` · L一1
图 2 诱导子浓度对生物碱产 , 的影响
2
.
3 诱导子对岩黄连细胞生长的影响 添加诱导子对岩黄连细
胞的生长具有显著影响。 从图 3 可以看到 , 添加诱导子后 , 细胞
生长受到明显抑制。 与对照组相比 ,诱导子处理组降低了细胞生
物量 。 随着诱导子浓度的从 50 m岁 L 增大到 150 m留 L ,细胞生
物量逐渐减少。 诱导子浓度为 50 m岁L 时 ,生物量在处理后的第
3 天达到最高 , 为 12 . 8 岁L 。 而对照组生物量在第 6 天达到最
大 , 比同期添加 50 , 10 , 150 m岁L 诱导子组分别高 巧% , 30 % 和
40 %左右 。
仁丰二
物量 ,没有引起较高的生物碱产量。 表明合适的诱导子浓度对生
物碱的合成和细胞生长是至关重要的 ,过高浓度的诱导子并不利
于细胞生长和生物碱合成 ,细胞生物量的减少是导致生物碱产量
下降的一个重要原因 。 M at su m u ar 等〔” l研究发现 ,用诱导子处理
水稻悬浮培养细胞 ,引起 H Z O : 的大量产生 ,培养基碱化 ,导致细
胞大量死亡 。 anL 等【’ 61 认为诱导子诱导的细胞死亡对红豆杉悬浮培养细胞中紫杉醇的合成没有贡献作用 。 乃压功 el i 等 f ’ , 〕研究
大麦悬浮细胞发现 ,生物和非生物的胁迫作用能激活与防卫反应
和细胞死亡相关的 M L O 调控基因 。 hz an g 等〔” 〕用诱导子处理烟
草悬浮细胞也发现会导致细胞死亡 , 并认为这与诱导子激活
W IKP 途径有关 。 本实验中 ,最佳诱导子浓度是 50 m g/ L ,虽然导
致了岩黄连细胞生物量的部分减少 ,但将培养物中生物碱产量提
高了 2 . 5 倍 ,该处理提供了一种简单有效的方法提高岩黄连细胞
培养中生物碱的产量 ,并为研究诱导子对岩黄连细胞的诱导机制
打下基础 。
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图 3 诱导子对岩黄连细胞生长的影响
3 讨论
在植物细胞培养中 ,诱导子被广泛用于提高次生代谢产物的
产量。 来源于真菌的细胞壁成分 、多糖 、单糖 、 糖蛋白等成分都可
作为诱导子使用 [ ” 〕。 本实验中的诱导子 ,来源于黑曲霉 ,其主要
成分为胞壁多糖 ,该诱导子可刺激岩黄连细胞中生物碱的合成 ,
从而提高其产量 。 该结果与 hz an g 等〔 ” 一 ’们在红豆杉细胞培养中
的结果相一致 。
在岩黄连悬浮细胞培养中 ,高浓度的诱导子导致了较低的生
·
2 19 1
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