全 文 ：园 艺 学 报 2007，34(6)：1405—1410
Acta Horticulturae sinica
低温胁迫对草莓叶片 SOD和 AsA—GSH循环酶系
统的影响
罗 娅，汤浩茹 ，张 勇
(四川农业大学林学园艺学院，四川雅安 625014)
摘 要：以草莓试管苗为试材，研究低温胁迫对草莓离体叶片抗坏血酸、脱氢抗坏血酸含量和 SOD以
及抗坏血酸一谷胱甘肽 (AsA—GSH)循环中 4种酶活性的影响。结果表明，低温胁迫导致超氧化物歧化
酶 、抗坏血酸过氧化物酶和单脱氢抗坏血酸还原酶活性上升 ，脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽还原酶活性
下降；同时使还原态抗坏血酸含量下降而脱氢抗坏血酸含量上升。随着低温处理时间延长，过多活性氧不
能被防御体系有效清除，植物受到伤害。试验结果还表明，抗坏血酸过氧化物酶具有较强的氧化还原抗坏
血酸的能力，单脱氢抗坏血酸还原酶是 AsA—GSH循环再生抗坏血酸的主要酶。
关键词：草莓 ；低温胁迫；抗坏血酸 ；超氧化物岐化酶；抗坏血酸一谷胱甘肽循环
中图分类号：S 668．4 文献标识码：A 文章编号：05l3-353X (2007)06一l405-06
Efect of Low Temperature Stress on Activities of SOD and Enzymes of
Ascorbate—Glutathione Cycle
LUO Ya，TANG Hao—VII ，and ZHANG Yong
(For~try and Horticultural Col&ge，Sichuan Agricultural University，Yaan，Sichuan 625014，China)
Abstract：To investigate the effect of lOW temperature stress on aseorbate content，activities of its relative
oxidative enzymes and superoxide dismutase(SOD)。the ascorbate and dehvdroascorbate content and activities
of SOD and four enzymes involved in the aseorbate—glutathione cycle(AsA—GSH cycle)in strawbery were
studied．The results showed that under low temperature stress the activities of SOD，aseorbate peroxidase
(APX)and monodehvdroascorbate reductase(MDAR)increased，while the acitivities of dehvdroascorbate re—
ductase(DHAR)and glutathione reductase(GR)decreased．Meanwhile，low temperature stress induced de—
crease in aseorbate(AsA)content and inerease in dehvdroascorbate(DHA)content．When lOW temperature
stress continued，more reactive oxygen species(ROS)were produced and could not be removed eficiently by
defense system．The results also indicated that APX had a strong ability to oxidize AsA and MDAR was a main
enzyme to regenerate AsA in AsA —GSH cycle．
Key words：Strawberry；Low temperature stress；Aseorbate；SOD；Aseorbate—glutathione cycle
低温逆境会导致植物体内过多活性氧 (O 、H O 、 ·OH和 O )的产生与积累 (Yong et a1．，
2003)，从而引发或加剧细胞膜脂过氧化，蛋白质变性以及核苷酸损伤等，严重时导致细胞死亡。植
物通过调节 自身的防御体系对低温胁迫作出适应性反应，以保护细胞免受活性氧的伤害，维持膜系统
的稳定。超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)和抗坏血酸一谷胱甘肽 (aseorbate—glutathi—
one，AsA—GSH)循环在清除活性氧过程中发挥着极其重要的作用 (Manisha et a1．，1999)。SOD是
收稿日期：2007—03—27；修回日期：2007—09—05
基金项目：教育部 “新世纪优秀人才支持计划”项 目 (NCET-04~905)；国家自然科学基金项 目 (30671454)；高等学校全国目
篇优秀博士学位论文作者专项 (200253)
}通讯作者 Author for corespondence(E—mail：htang@sicau．edu．cn)
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1406 园 艺 学 报 34卷
植物防御体系中的第一道防线，能催化超氧阴离子 (0 )歧化生成 0 和 H 0 ，H 0 通过 AsA—
GSH循环脱毒生成 H O。在 AsA—GSH循环中，抗坏血酸过氧化物酶 (ascorbate peroxidase，APX)
利用 AsA将 H O 还原成 H2O，同时形成单脱氢抗坏血酸 (mondehydroascorbate，MDHA)，MDHA很
不稳定，一部分被单脱氢抗坏血酸还原酶 (mondehydroascorbate reductase，MDAR)还原为 AsA，另
一 部分进一步氧化生成脱氢抗坏血酸 (dehydroascorbate，DHA)。DHA以还原型谷胱甘肽 (glutathi—
one，GSH)为底物，在脱氢抗坏血酸还原酶 (dehydroascorbate reductase，DHAR)的作用下生成
AsA。此反应产生的氧化型谷胱甘肽 (oxidized glutathione，GSSG)又可在谷胱甘肽还原酶 (glutathi—
one reductase，GR)的催化下被还原成 GSH。
抗坏血酸在植物体内直接参与 O 的清除，维生素 E的再生以及叶黄素循环中紫黄质的还原反应
(Foyer，1993)，与SOD以及 AsA—GSH循环中的相关酶一起在清除活性氧的过程中发挥着极其重要
的作用。目前，不同物种在不同低温胁迫下抗氧化酶活性变化已有相关报道 (李晶 等，2000；陈禅
友 等，2005；孙学成 等，2006)，但对抗坏血酸的氧化还原态以及 AsA—GSH循环中 APX、MDAR、
DHAR和 GR在低温胁迫下的动态变化研究较少。
草莓是目前果树保护地生产中种植面积最大的一个树种，由于南方冬季温度较高，草莓的越冬保
护措施不严格 ，草莓在栽培过程中往往会受到偶发性的短时 (1～2 d)低温伤害，从而给草莓生产带
来巨大损失。据报道，由于受西北干冷气流影响，2005年四川盆地92％的草莓花果受冻，减产 20％
～ 30％ (四川农业厅经作处，2005)。因此，研究草莓抗寒机理在生产上具有重要意义。田间材料本
身以及环境条件的差异，常导致试验结果不明显，而采用试管苗具有取材方便，个体差异小的优点，
在研究植物体内细微变化方面更具有优势 (张建霞 等 ，2005)。
作者以南方主栽草莓品种 ‘章姬 ’试管苗为材料，探讨低温胁迫下叶片活性氧代谢以及 SOD、
抗坏血酸含量和AsA—GSH循环中相关酶在同一短期低温胁迫中的动态变化，以期为揭示植物在低
温胁迫下的响应机制提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
选用培养室继代培养4周左右的草莓栽培品种 ‘章姬 ’(Fragaria ananassa‘Zoji’)试管苗叶片
为试材。继代培养基是 MS+0．5 mg·L BA+0．1 mg·L～IBA，其中蔗糖20．0 g·L～，琼脂粉6．0
g·L～，培养温度 (25±1)℃，光强4 800 lx，光照时间 16 h·d～。
1．2 方法
将试管苗放人0℃的人工气候箱中进行低温处理，分别剪取低温处理 2、4、6、8、l2、24、48
和72 h后的草莓叶片进行各项生理指标的测定，以没有进行低温处理的试管苗叶片为对照。
质膜透性以相对电导率表示，采用电导法测定并计算 (朱广廉 等，1990)。
O ：、H O 、丙二醛 (MDA)含量和 SOD活性分别使用南京建成生物工程研究所提供的 O 和
H，O，试剂盒、MDA试剂盒、SOD试剂盒测定。酶活性采用比活力表示。可溶性蛋白采用考马斯亮蓝
G-250法进行测定 (熊庆娥，2003)。
APX、DHAR、MDAR活性测定分别参考 Nakano和 Asada(1981)，Hosain和 Asada(1984)，
Krivosheeva等 (1996)的方法，GR活性使用 GR测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所)测定。
抗坏血酸和脱氢抗坏血酸含量按 Foyer和 Haliwel(1976)的方法测定。
试验数据使用 DPS7．05数据包，按单因素方差分析的方法在P≤0．05的水平上进行显著性检验。
试验重复 3次，每次3个重复。
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6期 罗 娅等：低温胁迫对草莓叶片 SOD和AsA—GSH循环酶系统的影响
2 结果与分析
2．1 低温处理下叶片相对电导率的变化
本试验结果表明，0℃低温处理期间 (2～72
h)，草莓叶片相对电导率均有升高，且与未经低
温处理的对照呈显著差异 (图 1)，其中低温处理
前期 (0～4 h)较对照明显增大，中期 (4～12
h)增加有所减缓，后期 (24～72 h)增加趋势
越加明显，72 h时相对 电导率 较对照增加 了
101％ 。
上述结果说明草莓在低温胁迫下细胞膜受到
了伤害，且随着低温时间的延长，受害程度越严
重。
2．2 低温处理下 o： 产生速率和 MDA含量的变
化
褥
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虹
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j
蛊
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处理时间
Time oftreatment(h)
图1 低温处理对草莓叶片相对电导率的影响
Fig． 1 Efect of low temperature stre~ on the relative electric
conductivity in leaves of strawberry‘Zoji’
Values are means -l-SD of three replicates．
0 是形成其它活性氧的主要分子，它伤害植
物的机理之一在于参与启动膜脂过氧化或膜脂脱脂作用 (吕庆和郑荣梁，1996)。0℃低温处理初期
(0～4 h)，草莓叶片中0 的产生保持在一个较低的水平，随着处理时间的延长，0 显著增加，8 h
时达到最大值，较对照增加了49％ (图2，A)。随后 02：产生有所下降，但都显著高于对照。
MDA是膜脂过氧化作用的最终产物，是膜系统受害的重要标志之一 (陈少裕，1991)。草莓叶片
受到0℃低温胁迫后，MDA含量迅速提高，并在低温处理4 h时达到最大值，之后随着处理时间的延
长，MDA含量有所下降，但仍显著高于对照 (图2，B)。
0 l0 20 30 40 50 60 70 80
处理时间
Time oftreatment(1I)
蚕詈
0 10 20 30 40 50 60 70 80
处理时间
Time oftreatment(h)
图2 低温处理对草莓叶片02 产生速率和MDA含量的影响
Fig． 2 Efect oflow tempe rature stress ontheO2 productionrates andthe content ofMDA
inleaves of strawberry‘Zoji’
Values are means -l-SD of three replicates．
2．3 低温处理下 SOD活性和 H：o：含量的变化
SOD是植物体内清除活性氧自由基的重要酶之一。低温处理前期 (0-4 h)，草莓 SOD活性迅速
上升 (图3，A)，将产生的0 快速歧化成 H 0 ，致使 H 0 含量也迅速增加 (图3，B)。随着处理时
间的延长 (4～72 h)，低温可能抑制了SOD活性，导致 SOD活性较低温处理前期有所减弱，同时由
于 AsA—GSH清除H 0 系统的启动，H 0 含量下降 (图3，B)。
m 8 6 4 2 O
—I．暑．卜u—g． 口0司一
二L0
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处理时间
Time oftreatment(h)
l00
8O
60
40
20
O
0 l0 20 30 40 5O 6O 70 8O
处理时问
Time oftreatment(h)
图3 低温处理对草莓叶片 SOD活性和 H2 02含量的影响
Fig．3 Efect oflow temperature stress on the activity of SOD and the content of H2O2
inleavesof strawberry‘Zoji’
Values are means ± SD of three replicates．
2．4 低温处理下 AsA—GSH循环中 APX、MDAR、DHAR和 GR酶活性的变化
0℃低温处理后，APX活性逐渐增加，12 h时达到最大值，较对照提高了 129％；之后有所下降，
但仍维持在一个较高的水平 (图4，A)。MDAR和 DHAR的活性在低温处理后逐渐提高，分别在 6 h
和 8 h时达到最大值，随之呈波动式变化，这可能与植株体内 H 0 的产生含量有关。在处理过程中
MDAR活性一直高于 DHAR，说明 MDAR再生 AsA的能力比 DHAR强 (图4，B、C)。GR活性在低
温处理2 h后较对照迅速提高了70％，随后呈波浪性变化，在 72 h时较对照降低了8％ (图4，D)。
0 10 2O 3O 40 50 60 70 80
处理时间
Time oftreatment(h)
处理时间
Time oftreatment(h)
80
图4 低温处理对草莓叶片 APX、MDAR、DHAR和GR活性的影响
Fig．4 Efect oflow temperature stress on the activities of APX，MDAR。DHAR and GR in leaves of strawberry ‘Zoji
Values are means ± SD of three replicates．
2．5 低温处理下 AsA和DHA含量的变化
在0℃的低温处理过程中，除处理 6～8 h外，草莓叶片中AsA的含量呈下降趋势，且显著低于
对照，而 DHA的含量逐渐升高，并在处理 48 h时达到最大值，虽然其后 DHA含量有所降低，但仍
显著高于对照 (图5)。
∞ ∞ 加 m 0 ¨ ¨ 0
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6期 罗 娅等：低温胁迫对草莓叶片 SOD和 AsA—GSH循环酶系统的影响
Fig．5
3 讨论
处理时间 处理时间
Time oftreatment(h) Time oftreatment(h)
图5 低温处理对草莓叶片 AsA和 DHA含量影响
Efect oflow temperature stress on the contents ofAsA and DHA in leaves of strawberry‘Zoji’
Values are means ± SD ofthree replicates．
各种逆境对细胞的伤害始于质膜 (朱素琴，2002)。本试验结果表明，低温使草莓叶片电解质渗
漏率加大和 MDA含量增加，这可能是由于草莓在低温条件下，抗氧化系统不能有效清除过多活性氧
的产生，0 和 H 0 等活性氧含量持续增加，从而诱发膜质过氧化程度加剧和细胞膜透性加大所致。
低温逆境条件不仅会提高细胞活性氧水平，同时也可诱发植物防御体系的建立，从而避免或减轻
活性氧对植物的伤害。本试验研究表明，草莓遭受低温胁迫后，叶片活性氧含量迅速积累，各种抗氧
化酶活性随之迅速提高。在低温处理 72 h时，除了 DHAR和 GR活性较对照有轻微下降外，SOD、
APX以及 MDAR活性分别比对照提高了20％、47％和71％。同时低温处理后，随着 APX活性增加，
更多的AsA被消耗，产物DHA含量不断增加。由此说明，草莓在受到低温胁迫时，抗氧化酶与抗氧
化剂将共同协调作用，以减轻不良环境造成的伤害。在本次试验中，虽然 SOD、APX和 MDAR 3种
抗氧化酶活性在低温处理后都有一定程度的提高，但是叶片活性氧和膜脂化水平在低温处理72 h后
分别比对照提高了62％、56％和67％。说明在低温处理初期 ，各种抗氧化酶活性的提高是植物对外
界环境的一种应激和自我保护反应，并通过调节抗氧化酶与抗氧化剂的水平去适应逆境并再次建立活
性氧产生与清除之间的平衡关系。然而，随着胁迫时问的延长，草莓体内活性氧水平持续增加，一方
面抑制了酶活性，降低了植物对自身的保护能力，另一方面又攻击细胞膜系统，诱发膜脂过氧化水平
加剧，最终导致植物受伤。
APX被认为是植物细胞中有效分解 H 0 的重要酶之一。APX活性增加有助于植物抗性的提高
(Alen et a1．，1997)。本试验研究表明，APX对低温非常敏感，APX活性伴随着 H 0 的升降而升降，
说明APX在清除H 0 的过程中发挥着重要的作用。从试验中还可看出，APX活性一直高于MDAR和
DHAR，说明APX氧化 AsA的活性比MDAR与 DHAR再生 AsA的活性强，这与 Jin等 (2003)的研
究结果相一致。MDAR和 DHAR是 AsA—GSH循环中再生 AsA的两个重要酶，Valentina等 (2000)
通过比较番茄叶与根中叶绿体／质体 ，线粒体和过氧化物酶体等细胞器中DHAR与 MDAR酶活性大小
得出，MDAR活性 明显高于 DHAR，AsA再生主要是通过 MDAR还原 MDHA而来。本研究表明，
MDAR活性远高于 DHAR，说明在草莓叶片中MDAR是再生 AsA的主要酶。
植物在逆境条件下是否受到伤害与植物种类、逆境强度和持续时间有关。在逆境初期，植物有一
个应激保护反应，SOD、APX、MDAR、DHAR、GR活性和 DHA含量增加，AsA含量减少。植物的
自我保护能力有限，随着胁迫时间的延长，过多的活性氧不能被有效清除，最终植物受到逆境伤害。
在抗坏血酸氧化酶体系中APx对环境变化非常敏感，具有较强的氧化 AsA的能力，是清除 H 0 的重
要酶。MDAR还原 MDHAR是 AsA—GSH循环中再生 AsA的主要途径。
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