全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(9)：1269—1276
Aeta Hortieulturae Siniea
红肉脐橙番茄红素 I3；一环化酶基因的克隆及其在大
肠杆菌中的功能表达
张建成，陶能国，周文静，徐 娟，潘志勇，邓秀新
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070)
摘 要：以 ‘红肉脐橙’(Citrus sinensis Osbeck‘Cara Cara’)果实中分离的mRNA为模板 ，经 RT—PCR
扩增到约 1．6 kb的番茄红素 B一环化酶 (1yeopene~-eyelase，Lcyb)cDNA片段。序列分析表明，该 eDNA
长 1 654 bp，包含两个转录本 ybl和Lcyb2，最大开放读码框均为 1 512 bp，可编码 504个氨基酸。通过
PCR方法获得红肉脐橙Lcybl和 Leyb2 cDNA编码区全长，构建了 Lcybl和Lcyb2的原核表达载体 pET．CitL-
cybl和 pET—CitLcyb2，并通过颜色互补试验证实表达的融合蛋白6×His．Lcybl和6×His—Lcyb2均可将番茄
红素转化为 B一胡萝 卜素。
关键词：柑橘；番茄红素 B一环化酶；基因；克隆；功能表达
中图分类号：S 666．4 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2008)09—1269-08
Lycopene I3l-cyclase Gene Cloning from C／trus sinensis Osbeck‘Cara Cara’
and Its Functional Expression in E．coli
ZHANG Jian—cheng，TAO Neng-guo，ZHOU Wen—jing，XU Juan，PAN Zhi-yong，and DENG Xiu-xin
(National Key Laboratory of Crop Genetic lmprovemem，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)
Abstract：Using the mRNA from the fruit of Citrus sinensis Osbeck‘Cara Cara’as the template
． w e am ．
plifed and cloned the cDNA of lycopene 13-cyclase gene by reverse transcription polymerse chain reactin (RT．
PCR)．Sequence analysis indicated that the cDNA was 1 654 bp long with two transcripts 6 l and／~yb2，
which had an open reading flame of 1 5 12 bp and encoded a protein of 504 amino acids respectively
． The full—
length coding region of Lcybl and Lcyb2 cDNA were cloned using PCR and further subcloned into pET．28a
(+)，resulting in the prokaryotic expression vector pET—CitLcybl and pET．CitLcyb2．The results of color
complementation demonstrated fusion protein 6×His-Lcybl and 6×His—Lcyb2 could catalyse lycopene to form
3-carotene respectively．
Key words：citrus；lycopene 13-cyclase；gene；clone；functional expresion
类胡萝 卜素是生物体内通过类异戊二烯途径合成而呈现红色、橙红色和黄色的一大类萜类色素物
质的总称 (Fraser&Bramley，2004)。番茄红素 B一环化酶 (1ycopene 13-cyclase，Lcyb)是类胡萝 卜
素生物合成过程中的关键酶，对于番茄红素环化形成 p一胡萝 卜素和含 B一环的胡萝 卜素具有重要调
控作用，其编码基因成为应用植物基因工程技术改善转基因植物中类胡萝 卜素含量的重要靶点 (朱
长甫 等，2004)。目前，已从番茄 (Pecker et a1．，1996)、辣椒 (Hugueney et a1．，1995)、黄花龙胆
(Zhu et a1．，2003)、柑橘 (Kato et a1．，2004)、马铃薯 (Moris et a1．，2004)、金盏花 (Del Vilar．
Martinez et a1．，2005)等多种植物中克隆到编码番茄红素 B一环化酶的完整基因或部分片段。
收稿日期：2008—03—25；修回日期：2008—07—08
基金项目：国家重点基础研究发展计划项目 (2006CB708202)；教育部创新团队专项项 目 (IRT0548)；国家自然科学基金项 目
(NSFC3077 1482)
通讯作者 Author for correspondence(E-mail：xxdeng@mail hzau．edu．cn)
维普资讯 http://www.cqvip.com
园 艺 学 报
近些年来，柑橘果实发育过程中类胡萝 卜素代谢的研究逐步成为热点，但是大多研究集中于甜橙
和温州蜜柑等少数普通柑橘品种 (Ikoma et a1．，2001；Kim et a1．，2001a，2001b；Kita et a1．，2001；
Rodngo et a1．，2004)，很少涉及类胡萝 卜素着色突变体及其突变机理的研究。‘红肉脐橙’是 ‘华盛
顿脐橙’的芽变，果肉主要含有番茄红素和 13一胡萝 卜素，是迄今世界上惟一果肉呈粉红色或红色的
脐橙品种 (Lee，2001；徐娟和邓秀新，2002a，2002b；Tao et a1．，2005)。徐娟 (2002)克隆了
‘红肉脐橙’编码番茄红素 8一环化酶的DNA全长，发现第 50位的氨基酸残基的甲硫氨酸 (M)被
精氨酸 (R)非保守取代，推测可能与积累番茄红素有关，但尚缺乏试验证据。
本研究中运用 RT—PCR技术克隆了 ‘红肉脐橙’果实 切 6基因，并通过颜色互补的方法在大肠
杆菌中验证了该基因的功能，可为研究 ‘红肉脐橙’果实中番茄红素和 B一胡萝 卜素积累的分子机
制奠定基础，也为进一步开展柑橘果实 “色泽育种”提供新的思路和途径。
1 材料与方法
1．1 材料及其 Lcyb eDNA克隆和序列分析
‘红肉脐橙’(Citrus sinensis Osbeck‘Cara Cara’)定植于华中农业大学柑橘育种中心资源圃，以
花后209 d果实为材料。采用改良SDS法 (Tao et a1．，2004)提取总 RNA；mRNA分离采用 PolyAT-
tract mRNA Isolation Systems II Kit(Promega，USA)进行；利用试剂盒 (Clontech SMART Library，
USA)以分离的mRNA为模板逆转录合成cDNA第一链。
根据 GenBank中登录的柑橘 Lcyb(AY094582、AF240787和AY166796)序列设计引物。上游引
物PF：5 一 I rCCCTGAA ITGAcTccTcTGTT一3 ， 下游弓I物 PR：5 ．TGCTTAATAACTCATGCACTAATCG．
3 。以合成的 cDNA第一链为模板进行 PCR扩增：94℃ 3 min；94 oC 1 min，55 oC 40 S，72℃ 2
min，32个循环；72 oC延伸 10 min。PCR产物电泳检测后回收，与 pMD18-T载体连接，构建重组质
粒pMD-CitLcyb，转化大肠杆菌 DH5~x，蓝白斑筛选阳性克隆，PCR检测后扩大培养并测序。
利用 ORF Finder(htp：／www．ncbi．nlm．nih．gov／gorf／gorf．htm1)分析Lcyb的开放读码框；通过
BLAST软件 (htp：／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST)进行序列相似性分析；采用 Clustal W (htp：∥
www．ebi．ae．uk／clustalw／index．htm1)和MEGA4．0进行序列比对和进化树构建，进行进化分析。
1．2 Lcyb原核表达载体构建
根据重组质粒 pMD—CitLcybl、pMD-CitLcyb2核苷酸序列和 pET28a(+)载体上的酶切位点分别
设计引物，上游引物为 CitLcyblL：5 一CG GGATCCATGGATACTGTA一3 ，下游引物为 CitLcyblR：5 ．
CCG cTCGAG1TrAATCTGTAT-3 ；上游引物为 CitLcyb2L：5 ．CG GGATCC ATGGATACTITA．3 ，下游引
物为 CitLcyb2R：5 一CCG cTcGAG1TrAATCTGTAT一3 ，并且在上游引物和下游引物中分别引入了BamH
I和XhoI酶切位点。以稀释的质粒pMD CitLcybl、pMD．CitLcyb2为模板进行 PCR扩增：94℃ 5 rain；
94℃ 1 min，55℃ 40 S，72 oC 2 min，35个循环；72 c【二延伸 10 min。PCR产物经电泳检测回收，然
后用 BamH I和Xho I酶切，回收酶切片段与经 BamH I和Xho I酶切的pET28a(+)载体进行定向
连接，构建原核表达质粒 pET—CitLcybl和pET—CitLcyb2。PCR检测后送测序验证插入的序列及其读码
框准确无误。
1．3 Lcyb诱导表达
将质粒 pET—CitLcyb1、pET—CitLcyb2和空白载体 pET28a(+)分别转化表达菌株 E．coli BL21。挑
取阳性克隆，接种于3 mL LB液体培养基 (含卡那霉素 50 mg·mL )，37℃振荡培养过夜，再按
1：100的比例接种于相同的新鲜 LB液体培养基中，37℃振荡培养至 OD6o为0．6～1．0时加异丙基硫
代半乳糖苷 (IFFG)1．0 mmol·L 诱导0、1、2、4、6 h。其间收集菌液，4℃，12 000×g离心 1
min，弃上清液，沉淀用 100 L SDS凝胶加样缓冲液 (Tris．HCI 50 mmol·L～，pH 6．8；SDS 2％；二
维普资讯 http://www.cqvip.com
9 期 张建成 等 ： 红 肉脐橙番茄红 素 B 一 环 化酶基 因的克隆及其在大肠 杆菌 中的功能表达
硫苏糖醇 100 m m ol? L
～
； 溴酚蓝 0． 1％ ； 甘油 10％ )
m in ， 取 20 斗L 上 清液 于 12％ 的 S D S — P A G E 电泳检测 。
止 。
重 悬 ， 混 匀后 沸 水浴 5 ra in ， 12 000 × g离 一tL, 1
用 考马斯亮蓝 R - 250 染色 ， 脱色至 背景清晰 为
1 ． 4 L cyb 表达蛋 白活性检测
质粒 pA C C R T — E IB 由 M iasw a 的研 究组 惠赠 。 该 质粒 含有类胡萝 卜素生 物合成途 径 上 栊 牛 儿基 栊
牛 儿基焦磷酸合成酶 、 八 氢番茄红 素合成酶和八 氢番茄红 素脱饱 和酶 3 个关键酶基 因 ， 在大肠杆菌 中
可 以合成积 累番茄红 素 。 将质粒 pA C C R T - E IB 分别与质粒 pE T — C itL cybl和 pE T - C itL cyb2 共转化 B k21 ，
在 L B + K a 50 m g ? L
一
+ C m 30 m g ? L
一 平板上 筛选 ， 获得携 带有 双 质粒 的合成 B 一 胡 萝 卜素的工 程
菌 。 按 照 上 述 方 法 ， 分 别 将 pA C C R T — E IB 、 pE T — C itL cybl、 pE T - C itL cyb2 和 pA C C R T — E IB + pE T 28a
( + ) 导入 B L 21 菌株 ， 获得对照菌株 。 在平板上 挑取对 应 的单克隆 ， 在 L B + K a 50 m g ? L
“
+ C m 30
m g ? L
一 平板上 划线 ， 28 ℃ 倒置 暗培养 3 ～ 4 d， 获得颜色互 补平板 。
2 结果与分析
2． 1 ‘ 红 肉脐橙 ’ L cyb cD N A 的克隆和 序 列分析
测序结果表 明 ， 克隆的 ‘ 红 肉脐橙 ’ 研 6 cD N A 长 1 654 bp， 包 含两 个转录本 L cybl和 L cyb2 ， 最
大开放读码框均 为 l5 12 bp， 编码 504 个氨基 酸 ， 5 ’ 端有 92 bp 长 的非 翻译 区 ， 3 ’端包 含 4 7 bp 的非
编码序列 ， 预测 分子量均 为 56． 5 kD ， 等 电点 分别 为 6． 69 和 7 ． 20 。 核酸序列 同源性 比较 发现 ， 两 个
转录本 L cybI 和 鲫 62 与 G en B ank 中已 登 录的甜橙 、 葡萄柚 、 温州蜜柑 和柚等柑橘属植物 C cyb的 同源
性 高达 98． O ％ 以上 ， 与拟南芥 、 烟草 、 番茄 、 辣椒 、 胡萝 卜等 L cyb 的 同源性 在 75 ． 0％ 以 上 。 因此 ，
认 为本研究所 克隆的 cD N A 序列 为 ‘ 红 肉脐橙 ’ L cyb cD N A 序列 。
2． 2 ‘ 红 肉脐橙 ’ L cyb 氨基酸序 列与 系统树 分析
序列分析 (图 1 ) 表 明 ， ‘ 红 肉脐 橙 ’ L cybl 和 t~ yb2 推导 的氨 基 酸 序 列 在第 4 、 23 、 39 、 50 、
164 、 235 、 332 、 4 39 、 4 4 6 、 4 69 、 4 77 位等多处 存在差 异 ， 不 同植物 的 切 6 在氨基 酸序列 的 中 、 后 部
具有很高的功能 区段保守性 ， 克隆的 ‘ 红 肉脐橙 ’ L ~ybl和 L cyb2 的氨基 酸 序列 中包含 一 些 植 物 L cyb
的特征序列 ， 都含有 一 段 “ F L Y A M P ” 序列 ， 都存在 F A D ／N A D (P ) 结合区 等 ， 而 在 L cyb氨基 酸序
列 的 N 末端则差异较大 ， 相 似性是从 ‘ 红 肉脐橙 ’ L 叮 61 和 k ，，62 的第 80 个氨基酸开 始的 ， 推测植物
L cyb的 N 端 区域可能是 一 段转运 肽 ， 不 同植 物 的转运 肽序列不 同 。
蒸鬻奏纛蒸糕
1 2 D 1 4 0
¨¨祁∞如祁”的¨ 一 ¨“ mⅢmⅢmm卅mm" m蟒
维普资讯 http://www.cqvip.com
1272 园 艺 报 35 卷
F L F 吣ⅥP
— p一 一
一 E K S
G T l：N
G S G D
S O O 52 q
gE 0
S 0哇
S 04
S O O
唾9 8
5 00
5 08
S 08
5 01
5 03
辱3 0
哇9 0
q9 3
2 3 S
2 3 5
2 3 l
22 9
23 1
2 3 9
23 8
23 0
23 4
1 S 7
2 lS
21 6
3 1 6
3 1 6
3 1 2
3 lO
3 1 2
3 2 0
3 1 9
3 lj
3 1 S
23 8
29 6
29 7
3 92
3 9 2
3 88
3 86
3 88
3 9 6
3 9 6
3 89
3 9 3
3 1 8
37 7
3 7 8
4 7 3
4 7 3
4 6 9
4 6 7
4 6 9
4 7 7
17 7
4 7 0
哇7 2
3 9 9
4 5 8
4 5 7
图 1 ‘ 红 肉脐橙 ’ L cybl和 L cyb2 与 其 它植 物 L cyb氨基 酸序 列 多重 比较
(1 )、 (5 )、 (7 )、 (10 ) ～ (15 )、 (17 )、 (19 )、 (20 ) 同图 2 。
“ 』” 表示 ‘ 红 肉脐橙 ’ 两 个转 录本 血 拍l和 L cyb2 氨基酸序列 差异位点 。
F ig． 1 A lignm entofam ino acid sequence ofL cybl and L cyb2 of
‘ C ara C ara ’ w itllrelated plantspecies
(1 )， (5 )， (7 )， (10) 一 (15 )， (17 )， (19 )， (20 ) are sam e as the F ig． 2 ．
“ 』” show s diferent sites ofam ino acid sequence deduced from transcript
2删 61 and L cyb2 of ‘ C ara C ara ’ ．
， ，
" 帅 轴∞"
)
” 乃辨∞
n o q q q n o p n q n 岱 ， ，
" 哪斡∞”
，
" 乃∞∞
0 ∞ a q n o n 仃 0 q o 岱
> > ， > ， > ， > )m柳㈣篙 器 品 墨 ∞
， ，
” 啦龄∞”

" ∞ 辨∞
0 岱 雕 0 0 尊 o p o n o 尊 ， ，
" 哪豁∞"
，
羚 乃辨∞
o 岱 n 0 0 n 0 仃 o o n 髂
维普资讯 http://www.cqvip.com
9期 张建成等：红肉脐橙番茄红素 B一环化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的功能表达
进化树分析表明，‘红肉脐橙’／~ybl和 Lcyb2推导的氨基酸序列与温州蜜柑和葡萄柚、柚、甜橙
等柑橘属植物亲缘关系最近，同源性高达97．2％ ～99．6％；与拟南芥、番木瓜、辣椒、番茄、烟草、
胡萝 b等双子叶植物的亲缘关系较近，同源性为82．5％ ～86．9％；与灯笼百合、谷子、黄水仙、水
稻、玉米等单子叶植物的亲缘关系较远，同源性为 72．0％ ～77．4％；与原核生物番茄红素环化酶
(crtY)的同源性则较差，如与噬夏孢欧文细菌的同源性低于30％ (图2)。
一 Citru．s,smensisCaraI(1)
一 — _1 ---温州蜜柑 CitT~s unshiu AY166796(2)
一 一 — — 甜橙Cirus sinensis(,a~F240787)(3)
一 一 柚Cl，1fs m~in]a(AT217103)(4)
一 ，仉 sinensis Cara2(5)
一
— — 葡萄柚 CltT~sparadtsi(AF152246)(6)
拟南芥 4rabidopsis thMiana(AF117256)(7)
番木瓜 Ca1’icapapaya(DQ41 5894)(8)
_ _ - 黄花龙胆 Gentiana lutea(,M3017366)(9)
枸杞L1Ci~ttl barbarum(AY906864)(1o)
— — 一 一
— — 一 — — 胡萝 卜Dmwus “，口 (DQl92l9O)(11)
一 一__1 一--一 一烟草ATcotiana tabacum(X81787)(12)
厂 番茄I4,coper~icon esculentum(X86452)03)
— — 辣椒 Capsicum annuum(X86221)(14)
_ 黄水仙h2vvismspseudonalvtssus(X98796)(1 5)
一 L 一谷子 Setaria itahca(AY337024)(16)
L 一 ——～ -_ — — 万寿菊 Tugetes erecta(AY099484)(17)
一 一 — — — — 一 — — ⋯ — — 灯笼百合Sandersonia aurantiaca(AF489520)(1 8)
一 — — ． _ ． 一 一 — — —
__——玉米Zea” ays(AY206862)09)
一 水稻 O0,za s(3tl，a(N~l 00 1 052686)(20)
r — — 红平红球菌Rhodococvus 8，ythropohs(AY437860)(21)
— — 细长聚球藻 ’IeChOCOCCHS elongatus(X74599)(22)
— — 耐辐射球菌Deinococcus radiodurans(AEO00513)(23)
一 — — 黄杆菌 obactet’iutl sp P99—3(,M309781 3)(24)
一 一 —— 一 一 — — ～—__ — 噬夏孢欧文细菌 Erwima uredo~，D (D90087)(25)
— — 草生欧文细菌Enl inia herbicola(M90698)(26)
图2 ‘红肉脐橙 ’Lcyb1和 Lcyb2与相关物种Lcyb氨基酸序列同源性进化分析
Citrus sinensis Caral和Citrus sinensis Cara2代表 ‘红肉脐橙’的两个转录本 L~ybl和 Lcyb2。
Fig．2 Phylogenetic tree analysis of the deduced amino acid sequences homolog of
Lcybl and Lcyb2 of‘Cara Cara’with related plant species
Citrus sinensis Caral and Citrus sinensis Cara2 stand for
transcripts Le)b1 and Lcyb2 of‘Cara Cara’respectively．
2．3 ‘红肉脐橙’Lcyb原核表达载体构建
以稀释的重组质粒 pMD-CitLcybl和 pMD—CitLcyb2为模板，采用 CitLcyb1L和 CitLcyblR引物、
CitLcyb2L和 CitLcyb2R引物 PCR扩增获得 ‘红肉脐橙’Lcy~l和／~yb2 cDNA编码区全长。PCR纯化
产物经 BamH I和Xho I酶切回收后，定向连接到 BamH I和Xho I酶切的pET28a(+)载体上，获
得原核表达载体 pET—CitLcybl和pET—CitLcyb2。该重组载体在携带的原核表达强启动子 驱动下，可
用于在大肠杆菌中高效表达 ‘红肉脐橙’ y6l和I~yb2。
2．4 ‘红肉脐橙’Lcyb原核表达与 SDS．PAGE分析
重组质粒 pET—CitLcyb 1和pET·CitLeyb2转人大肠杆菌 BI2 1后，经 IPTG诱导，重组质粒能够表达
一 条约59 kD的特异蛋白，与预测的含有六联组氨酸标签的融合蛋白的分子量大小相吻合，而空白对
照 pET一28a(+)质粒表达的蛋白中没有此带，融合蛋白的时间诱导表达模式表明，该融合蛋白在
IPTG诱导6 h后达到较高水平 (图3)。
维普资讯 http://www.cqvip.com
1274 园 艺 学 报 35 卷
kI)
116． 0 —
66-2 —
4 5 ． 0 — — —
3 5 ． 0 —
25 0 一
M 1 2 3 4 5 6
~ - - - 59 0 kD
kD
116 ． O 一
66． 2 —
4 5 ． 0 — — —
3 5 ． 0
25 ．0
M 7 8 9 10 11 12
B
? 一 59 0 kD
图 3 pE T ． C itL cybI (A ) 和 pE T - C itL cycb2 (B ) 在大肠 杆菌 B L 21 中表达 的 S D S - P A G E
M ： P rotein m arker； 1 、 7 ： 转 化 pE T - 28a ( + ) 空 载体的总蛋 白；
2 — 6 ： 转 化 pE T ． C itL cybl经 IP T G 诱导 6 、 4 、 2 、 1 、 0 h的总 蛋 白 ；
8 ～ 12 ： 转化 pE T — C itL cyb2 经 IP T G 诱导 6 、 4 、 2 、 l、 0 h的总 蛋 白 。
F ig． 3 S D S - P A G E ofexpression ofpE T - C itL cybl (A ) 和 pE T - C itL cyb2 IB )in E coliB L 21
M ： P rotein m arker： 1 ， 7 ： T otalproteins ofE ． coliB 12 1 transform ed by pE T - 28a ( + ) "after induction ；
2 — 6 ： T otalprotein s ofE ． coliB L 21 transform ed by pE T — C itL cybl at6 ， 4 ， 2 ， 1 and0 h
after induction respectively；
8 — 12 ： T otal protein s ofE ． coliB 12 1 tran sform edby pE T — C itL cyb2 at6 ， 4 ， 2 ， 1 and0 h
after indu ction respectively．
2． 5 ‘ 红 肉脐橙 ’ L cyb 表达 蛋 白活性检测
pA C C R T ． E IB 导人 B 12 1 后 ， 可 以积 累番茄红 素 。 如果将 pE T — C itL cybl或 pE T - C itL cyb2 转入 上述重
组 菌后 ， 由于 番茄红 素 B ． 环化酶能使番茄红 素环 化生成 p一 胡萝 卜素 ， 推动代谢流 向 B 一 胡萝 卜素合
成的方 向流动 ， 使该工 程 菌能大量积 累 B 一 胡萝 卜素 。
如 图 4 所 示 ， 利用 可合成番茄红 素 的工 程 大肠 杆菌作为酶的底物 ， 通 过
“ 颜 色互 补 ” 方 法 来验
证 酶 活 性 时 ， 作 为 对 照 的 pA C C R T ． E IB 、 pE T - C itL cybI 、 pE T — C itL cyb2 都 不 能 生 长 ； pA C C R T — E IB +
pE T 28a ( + ) 未携带 C itL cybl或 C itL cyb2 ， 不 能将番茄红 素转化 为 p一 胡萝 卜素 ， 菌落仍呈 现 红 色 ；
图 4 融 合蛋 白 6 x H is? L cybl和 6 x H is- L cyb2 的酶活分 析
1 ： 转 化 pA C C R T - E IB ； 2 ： 转化 pA C C R T — E IB + pE T - C itL cybI ； 3 ： 转化 pE T — C itlx ybI ；
4 ： 转化 pA C C R T — E IB ’ pE T 28a ( + )； 5 ： 转化 pE T — C itL c)’b2 ； 6 ： 转化 pA C C R T - E IB ’ pE T ? C itL cyb2。
F ig． 4 D etection ofrec om bin antprotein 6 × H is- L cybl和 6 × Hi s? L cyb2 by color com plem entation plate
1 ： pA C C R T - E IB ； 2 ． 6 ： pA C C R T — E IB + pE T - C itL cybl and pA C C R T - E IB + pE T - C itL cyb2 ；
3 ， 5 ： pE T - C itL cybl an d pE T - C itL cyb2 ； 4 ： pA C C R T — E IB + pE T 28a ( + )．
维普资讯 http://www.cqvip.com
9期 张建成等：红肉脐橙番茄红素 p一环化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的功能表达
只有 pACCRT EIB+pET．CitLcybl或pACCRT-EIB+pET—CitLcyb2，经过3～4 d培养后，菌落呈现 13一
胡萝 卜素特有的黄色，表明融合蛋白6×His．Lcybl和6 XHis—Lcyb2将番茄红素转化为 p一胡萝 卜素。
3 讨论
番茄红素 B一环化酶是植物类胡萝 卜素代谢中控制番茄红素环化的关键酶，抑制该基因的表达能
导致番茄红素的积累，而增强该基因的表达能促进番茄红素向p一胡萝 卜素和含 13一环的胡萝 卜素转
变 (Bramley，2002)。在柑橘果实发育过程中， 6的表达属于上升调控，促使番茄红素向下游的
B一胡萝 卜素和黄色素转变 (Kato et a1．，2004；Rodrigo et a1．，2004)。在番茄果实成熟过程中，随着
番茄红素的积累， y6的表达逐渐下降直至没有表达 (Giuliano et a1．，1993；Pecker et a1．，1996)。
在番茄 Beta突变体中，由于第 2个 y6的表达量增加，导致果实中积累的番茄红素向 13一胡萝 卜素
的转变；而在番茄Old．gold突变体中，由于第2个 y6启动子区域的突变，导致果实中积累番茄红
素，缺乏 B一胡萝 卜素。本研究从 ‘红肉脐橙 ’果实中克隆到完整的Lcyb基因，这将为通过借鉴番
茄模式植物的研究策略，进一步从基因表达、启动子区域或调节因子等方面来阐明 ‘红肉脐橙’突
变体中番茄红素和 8一胡萝 卜素积累的分子机制提供了基础。
植物中番茄红素环化酶基因是一个大家族，不同 6基因家族成员编码的氨基酸序列差异较大，
但仍有一些高度保守的区域存在，这些高度保守的残基与催化功能有关 (Ronen et a1．，1999)。本试
验中克隆的 ‘红肉脐橙’Lcyb1和Ccyb2编码的蛋白质在中、后部与其它植物Lcyb的氨基酸的同源性
很高，且包含植物Lcyb的共同特征 “FLYAMP”序列和 FAD／NAD (P)结合区 (Cunningham et a1．，
1996)。此外，‘红肉脐橙’Lcyb1和Lcyb2的氨基酸序列与双子叶植物同源性明显高于与其他单子叶
植物的同源性，在双子叶植物中也表现出属内同源性很高、属间相对较低的特点，与进化上的观点相
符合 (Cunningham et a1．，1996)。
蛋白质是基因表达的最终产物，要阐明 ‘红肉脐橙’果肉呈粉红色或红色的芽变实质，还需从
蛋白质水平进一步研究。本研究中构建了 ‘红肉脐橙’Ccyb的原核表达载体 pET．CitLcybl和 pET．
CitLcyb2，经 IPTG诱导，在大肠杆菌中均表达了含 His—tag的融合蛋白，为进一步进行蛋白纯化、体
外酶活分析以及位点突变研究奠定了基础。此外，利用 “颜色互补”的方法在大肠杆菌中验证了
‘红肉脐橙’Lcyb1和C~yb2编码蛋白的活性，这有助于探讨 ‘红肉脐橙’中该酶的特殊调控机理，
对于了解 ‘红肉脐橙’中番茄红素和 13一胡萝 卜素的高度积累的分子机制具有重要意义。
References
Bramley P M．2002．Regulation of carotenoid formation during tomato fruit ripening and development．Journal of Experimental Botany．377：
2107—2ll3．
Cunningham F X，Pogson B，Sun Z，McDonald K A，Dallapenna D，Gantt E．1996．Functional analysis of the B and￡一lycopene cyclase enzymes
ofArabidopsis reveals a mechanism for control of cyclic carotenoid formation．The Plant Cell，8：1613—1626．
Del Vilar-Martinez A A，Garcia—Saucedo P A，Carabez—TrejO A，Cruz—Hernrndez A，Paredes—L6pez 0．2005．Carotenogenic gene expression and
uhrastructural changes during development in marigold．Journal of Plant Physiology．162：1046—1056．
Fraser P D，Bramley P M．2004．The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids．Progress in Lipid Research，43：228—265．
Giuliano G，Bartley G E，Scolnik P A．1993．Regulation of carotenoid biosynthesis during tomato development．The Plant Cell，5：379—387．
Hugueney P，Badilo A，Chen H C，Klein A，Hirschberg J，Camara B，Kuntz M．1995．Metabolism of cyclic carotenoids：A model forthe ahera．
tion of this biosynthetic pathway in Capsicum annuum chromoplasts．The Plant Journal，8：417—424．
Ikoma Y。Komatsu A，Kita M，Ogawa K．Omura M，Yano M，Moriguchi T．2001．Expression of a phytoene synthase gene and characteristic
carotenoid accumulation during citrus fruit development．Physiology Plantarum，1 1 1：232—238．
Kato M，Ikoma Y，Matsumoto H，Sugiura M，Hyodo H，Yano M．2004．Accumulation of carotenoids and expression of carotenoid biosynthetic
genes duing maturation in citrus fruit．Plant Physiology ，134：824—837．
维普资讯 http://www.cqvip.com
l276 园 艺 学 报 35卷
Kim I J．Ko K C，Kim C S，Chung W L．2001 a．Isolation and expression paterns of a cDNA encoding ph~oene synthase in Citrus．Journal of
Plant Physiology，158： 795 —800．
Kim 1 J．K0 K C．Kim C S，Chung W I．2001 b．Isolation and characterization of cDNAs encoding 3-carotene hydroxylase in Citrus．Plant Sci—
ence． 161： 1005 —1010
Kita M．Komatsu A，Omura M，Yano M，Ikoma Y，Moriguchi T．2001．Cloning and expression of CitPDSI，a gene encoding phytoene desaturase
in Citrus．Bioscience Biotechnology Biochemistry．65：1424—1428．
Lee H S．2001．Characterization of carotenoids in juice of red navel orange(Cara Cara)．Journal of Agriculture Food Chemistry，49：2563—
2568．
Morris W L，Duereux L，Grifiths D W ，Stewafl D，Davies H V，Taylor M A．2004．Carotenogenesis during tuber development and storage in
potato．Journal of Experimental Botany，55：975—982．
Pecker 1．Gabbay R．Cunningham F J．Hirsehberg J．1996．Cloning and characterization of the cDNA for lycopene cyclase from tomato reveals
decrease in its expression during fruit ripening．Plant Molecular Biology ，30：： 807—819．
Rodrigo M J，Marcos J F．Zacafias L．2004．Biochemical and molecular analysis of carotenoid biosynthesis in flavedo of orange(Citrus sineusis
L．)during fruit development and maturation．Journal of Agriculture Food Chemistry，52：6724—6731．
Ronen G，Cohen M，Zamir D，Hirsehberg J．1999．Regulation of carotenoid biosynthesis during tomato fruit development：Expression of the gene
for lycopene epsilon cyclase is down regulate during ripening and is elevated in the mutant Delta．The Plant Journal，17：341—351．
Tao N G，Cheng Y J．xu J，Xu Q，Deng X X．2004．An efective protocol for the isolation ofRNA frmn the pulp ofripening citrus fruits．Plant
Molecular Biology Reporter，22：305a一305f．
Tao N G，Xu J，Cheng Y J，Deng X X 2005．Lyeopene—e—cyclase pre—mRNA is alternatively spliced in Cara Cara navel orange(Citrus sinensis
Osbeck)．Biotechnology Leters，27：779—782．
Xu Juan 2002．Fruit color evaluation among citrus prod uct areas and preliminary study on the mechanism of pigment accumulation in the flesh of
red flesh navel oranges(Citrus sineusis L．cv．Cara Cara)[Ph．D．Dissertation]．Wuhan：Huazhong Agricultural University．(in Chinese)
徐 娟．2002．儿个柑桔产区果实色泽评价及红肉脐橙 (Citrus sineusis L．cv．Cara Cara)果肉呈色机理初探 [博士论文]．武汉：
华中农业大学．
Xu Juan，Deng Xiu—xin．2002a．Identifcation of main pigments in red flesh navel orange(Citrus sinensis L．)and evaluation of their concentration
changes during fruit development and storage．Acta Horticuhurae Sinica，29 (3)：203～208．(in Chinese)
徐 娟，邓秀新．2002a 红肉脐橙果肉中主要色素的定性及色素含量的变化．园艺学报，29(3)：203—208．
Xu Juan，Deng Xiu—xin．2002b．Red juice sac of citrus and its main pigments．Journal of Fruit Science，19 (5)：307—313．(in Chinese)
徐 娟，邓秀新．2002b．柑橘类果实汁胞的红色现象及其呈色色素．果树学报，19(5)：307—313．
Zhu C，Yamanmra S，Nishihara M，Koiwa H．Sandmann G．2003．cDNAs for the synthesis of cyclic earotenoids in petals of Gentiana lutea and
their regulation during flower dmelopment．Biochimica et Biophysica Acta，1625：305—308．
Zhu Chang·fu，Chen Xing，Wang Ying—dian．2004．Carotenoid biosynthesis in plants and application of its relative genes in gene engineering．
Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，30 (6)：609—618． (in Chinese)
朱长甫，陈 星，王英典．2004．植物类胡萝 h素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用．植物生理与分子生物学学报，30
(6)：609—618．
欢迎订阅2009年 《果树实用技术与信息》
《果树实用技术与信息》是由中华人民共和国农业部主管，中国农业科学院主办的果树类期刊。月刊，l6开本。
集科学性 、实用性、时效性于一体。全方位报导我国果树生产和发展的最新动态 、新技术 、新成果 、新品种、新农药
等。欢迎订阅，欢迎惠登广告，欢迎投稿。
主要栏 目：专家论坛 、果业动态、果树栽培技术、果树医院 、果农顾问、果品贮藏与加工、优新品种 、新农药 、
产销动态、市场行情、果园综合开发、果树珍稀资源、知识角、市场营销等。
国内邮发代号：8—220，每册定价 3．8元，全年45．6元，可到当地邮局 (所)订阅，也可向本刊编辑部订阅。
地址：辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所 《果树实用技术与信息》编辑部。
邮编：125100；电话：0429—3598130；邮箱：gssyjs2007@sohu．com，gssyjs2007@sina．com。
维普资讯 http://www.cqvip.com