全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (1) : 39～43
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 03 - 11; 修回日期 : 2004 - 08 - 12
基金项目 : 国家高技术研究发展计划 ‘863’项目 (2001AA241131)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wangdi@public1 lz1gs1cn)
马铃薯脱外壁花粉的制备与人工萌发
吴旺泽　王　蒂 3 　王　清　彭晓莉
(甘肃农业大学农学院 , 兰州 730070)
摘 　要 : 将 3个马铃薯普通栽培种 (Solanum tuberosum L. ) ‘陇薯 3号 ’、‘Favorita’和 ‘Shapody’
的花粉先经低温饥饿处理 , 再低温水合、高温热激和渗激 , 分离出大量具有活力的脱外壁花粉 , 花粉最
高脱壁率达 3415%。脱外壁花粉在 K3 培养基 + 15% PEG + 5%蔗糖 + 0101% H3BO3 + 0101% LH + 100
mg/L PVP的萌发液中萌发率高达 3813%。试验建立了三步冲击法制备马铃薯脱外壁花粉的方法 , 并讨
论了外壁在花粉萌发与受粉中的生物学意义。
关键词 : 马铃薯 ; 花粉 ; 脱外壁花粉 ; 人工萌发
中图分类号 : S 533　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0120039205
Prepara tion and Artif ic ia l Germ ina tion of D e2ex ined Pollen in Pota to ( Sola2
num tuberosum L. )
W u W angze, W ang D i3 , W ang Q ing, and Peng Xiaoli
(College of A gronom y , Gansu A griculture U niversity, L anzhou 730070, Ch ina)
Abstract: Pollen grains of three cultivars‘Longshu 3’, ‘Favorita’and ‘Shapody’of potato were
treated following a three2step p rocedure: 1. Starvation treatment at 4 - 7℃ for 3 - 5 d; 2. Hydration at 4℃
for 20 h; 3. Heat shock at 36℃ for 20 - 100 m in and osmotic shock for 40 m in. After the three2step treat2
ment the exine could be detached along the germ ination furrows with the detachment rate of 3415%. The ger2
m ination rate of the nake pollen of cultivars potato could reach 3813% in a modified medium containing 15%
PEG (MW 8000) , 5% sucrose, 0101% H3BO3 , 0101% LH, 100 mg/L PVP and K3 pisalts ( pH 815).
The results showed the three2step p rocedure established in this experiment was a useful tool for detaching the
exine of potato pollen and understanding the biological role of exine in pollen germ ination and pollination.
Key words: Potato; Pollen; De2exined pollen; A rtificial pollen germ ination
脱外壁花粉指介乎完整花粉与花粉原生质体之间的一种结构单位〔1〕, 是一种独特的花粉形态与
生理学材料 ; 可以用于研究内壁的表面结构、剥离的外壁结构与成分、内壁的沉积、新壁的合成
等〔2〕; 脱外壁花粉由于排除了外壁对生物大分子的屏障作用 , 有利于外源基因的导入。施华中等〔3〕在
烟草中的试验已证明 : 脱外壁花粉的外源 GUS基因瞬间表达水平约为萌发花粉的 5倍、花粉粒的 30
倍 ; 同样王劲等〔4〕在用基因枪法将 GUS基因导入脱外壁花粉及其瞬间表达的试验也证明 , 脱外壁花
粉的瞬间表达频率达最高 , 约为 0145% , 为完整花粉的 6倍。这些结果表明 , 脱外壁花粉在今后将
可能成为一种极有潜力的遗传转化受体。研究马铃薯脱外壁花粉的制备、脱外壁花粉萌发的最适条
件 , 为建立脱外壁花粉离体授粉试验体系 , 以及利用这一试验体系开拓基因转移等技术奠定基础。同
时 , 还可研究外壁在花粉萌发与授粉中的生物学意义 , 并为马铃薯花粉原生质体制备提供基础。
1　材料和方法
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
111　材料
供试材料为马铃薯普通栽培种 ‘陇薯 3号 ’、‘Favorita’和 ‘Shapody’, 2003年 8月采于甘肃天
祝马铃薯试验基地 , 晴天上午采摘幼嫩花蕾 (开花前 3～5 d) , 并用冰盒带回实验室备用。
112　脱外壁花粉的制备
将采摘的幼嫩的花蕾 , 经 4～7℃低温处理 3～5 d后 , 镜检花粉发育时期 , 将处于二核中期的
花药投入到 013 mol/L的甘露醇中用注射器内径轻轻压出花粉 , 过滤、离心、收集接种于不含蔗糖
仅含甘露醇和无机盐的 Roberts〔5〕培养基中饥饿处理 36 h, 然后离心收集花粉 , 悬浮于含 20%蔗
糖、8%甘露醇、0105%水解乳蛋白 (LH ) 的 K3 培养基盐成分的水合液中 ( pH 815 ) , 在 4℃下
水合 8～36 h, 转入 28℃、36℃、40℃水浴 20～100 m in, 弃去水合液并加入 20%蔗糖的 K3 培养
基 (pH 815) , 在 25℃ 100 r /m in黑暗下振荡渗激 40 m in。水合液与渗激液的渗透压值用 M icro2
O smometerModel 3MO测定仪测定。
113　脱外壁花粉人工萌发
将脱外壁的花粉离心收集后转移到含有不同有机成分的 K3 培养基的萌发液中 ( pH 815 ) , 在
25℃ 40 r/m in下黑暗振荡培养 , 以完整花粉作为对照 , 统计萌发率。脱壁与萌发的检测均用 O lympus
显微镜 (AH22) 进行 , 按 10个视野平均数计算。
2　结果与分析
211　脱外壁花粉制备的关键因素
21111　花粉饥饿处理 　经低温处理后的花药 , 刚
分离出的花粉呈近圆球形 (图版 , 1) , 经 36 h饥
饿处理后 , 转入到高渗的水合液中 , 花粉很快收
缩成椭圆形 , 有极少部分发生严重皱缩 , 接着给
予高温热激和渗激 , 能显著提高花粉脱壁率 , 脱
壁率最高达 2615% , 明显高于非饥饿处理的花粉
(表 1)。
21112　低温水合 　低温水合是马铃薯花粉能否脱
外壁的关键。不冷浸和冷浸 8 h以下 , 热激后脱外
壁率极低 , 不到 10%。20 h冷浸后 , 脱外壁率提
高到 1814% (图 1)。冷浸时间继续延长 , 到 28 h
后 , 花粉粒大多破裂 , 脱外壁率又呈下降趋势。经
FDA测验表明 , 此时花粉粒生活力大多丧失。
21113　热激 　长时间低温水合后 , 再给予短时间
热激能削弱内外壁之间的联系 , 此时花粉粒呈明
显的质壁分离 (图版 , 2 ) , 有利于外壁的开裂。
花粉经 20 h冷浸后 , 在 28℃、36℃、40℃条件下
热激处理 40 m in后 , 发现 36℃的热激处理所获得
的脱壁率最高 , 达 2816% , 3种处理之间差异显
著 (表 2)。进一步研究发现 , 热激温度过高和时
间过长花粉大多褐化死亡 , 温度过低和时间过短
外壁又不能裂开 , 一般将热激温度控制在 36℃左
右 , 时间控制在 1 h以内。
表 1　饥饿处理对花粉脱外壁的影响
Table 1　Effects of starvation treatment on ex ine detachment of pollen
品系
B reeding lines
饥饿处理
Starvation treatment
A B C
非饥饿处理
Non2starvation treatment
A B C
陇薯 3号 Longshu 3 290 66 2218 210 26 1214
Favorita 275 73 2615 190 30 1518
Shapody 298 72 2412 238 34 1413
平均 Average 28717 7013 2415 a 21217 30 1412 b
注 : A、B、C分别表示完整花粉数、脱外壁花粉数、脱外壁花粉
频率 ( % ) ; t测验表明两处理间差异达 5%显著水平。
Note: The different letters A, B, C indicated the No. of the intact
pollen observed, No. of the de2exined pollen observed and frequency of
de2exined pollen; The t2test showed the significant difference between
two treatment at 5% level.
表 2　热激温度对花粉脱外壁的影响
Table 2　Effects of tem pera ture of hea t2shock on ex ine
detachm en t of pollen
品系
B reeding lines
花粉脱外壁率
Percentage of different temperature on de2ex2
ined pollen ( % )
28 ℃ 36 ℃ 40℃
陇薯 3号 Longshu 3 411 2618 1112
Favorita 414 2816 1018
Shapody 318 2513 910
平均 Average 411a 2619b 1013c
注 : Duncanpis新复极差测验表明 ,处理间差异达 5%显著水平。
Note: The Duncanpis multip le range test showed the significant
difference between three treatment at 5% level.
21114　渗激 　将热激后的花粉转入到渗透压约 1050 mO sm /kg的 20%蔗糖的 K3 培养基低渗溶液中进
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　1期 吴旺泽等 : 马铃薯脱外壁花粉的制备与人工萌发 　
行 40 m in的低渗处理 , 可显著提高其脱外壁率 ,
和非经此处理的花粉脱壁率相比差异极显著 (表
3)。经此过程后花粉外壁逐渐开裂 , 并逐步脱开 ,
少部分与花粉一侧相连内壁大部分暴露 , 绝大部分
外壁完全脱离 (图版 , 3～5) , 经过滤、离心纯化
得较纯净的脱外壁花粉粒 , 大多具有活力 (经
FDA检测 ) , 且经低渗处理后 , 将脱外壁花粉转入
到花粉原生质体的酶解液或更为低渗的脱外壁花粉
萌发液中不易破裂。
212　脱外壁花粉人工萌发 表 3　渗激对花粉脱外壁的影响Table 3　Effects of osm otic shock on ex ine detachm en t of pollen品系B reeding lines 脱外壁花粉百分率Percentage of de2exined pollen ( % )渗激 O smotic shock 不渗激 Non2osmotic shock陇薯 3号 Longshu 3 3112 1814Favorita 3415 2016Shapody 3214 1918平均 Average 3217 A 1916 B注 : t测验表明两处理间差异达 1%极显著水平。Note: The t2test showed the significant difference between two treat2ment at 1% level.
21211　脱壁过程中热激和渗激时间对脱外壁花粉萌发的影响 　脱外壁花粉制备过程中 , 水合液成分、
温度和渗透压、热激时间、渗激渗透压等各个环节均影响脱壁花粉的离体萌发。试验发现 , 36℃下热
激 40 m in有较好的脱壁效果 , 但萌发率较 20 m in差。40 m in的渗激取得了较好的萌发效果 , 脱外壁
花粉最高萌发率达 3618% , 随着渗激时间的延长萌发率又开始下降 (图 2)。
图 1　低温水合时间对花粉脱外壁的影响
F ig. 1　Effects of d ifferen length of tim e of cold hydra tion
on ex ine detachm en t of pollen
图 2　热激和渗激时间对脱外壁花粉萌发率的影响
F ig. 2　Effects of d ifferen t length of tim e of hea t2shock and
osm otic2shock on germ ina tion ra te of de2ex ined pollen
21212　聚乙二醇 ( PEG) 和硼酸对脱外壁花粉萌发的影响 　芸薹属脱外壁花粉在含 15%蔗糖的 Ro2
berts培养基中几乎不能萌发 , 只有在 15% ～20% PEG + 0105% LH的萌发液中才能萌发 , 青菜脱外
壁花粉萌发率达 41%〔6〕。我们以 K3 为基本萌发培养基 , 用 5%、10%、15%、20%的 PEG代替蔗
糖 , 有较好的萌发效果 , 在 15% PEG + 0101% H3BO3 的 K3 培养基中完整花粉萌发率达 8417% , 脱
外壁花粉达 3213% , 附加 5%的蔗糖萌发效果有所提高 (表 4) ; 培养 15 h后 , 花粉管生长仍然正常 ,
能观察到微弱的胞质流动 (图版 , 6)。
表 4　PEG和 H3 BO 3 对脱外壁花粉萌发的影响
Table 4　Effects of PEG and H3 BO 3 on germ ina tion of the de2ex ined pollen
处理
Treatment
脱外壁花粉数
No. of the de2exined
pollen observed
萌发的脱外壁花粉数
No. of the de2exined pollen germinated
数量 No. 频率 Frequency(% )
完整壁花粉数
No. of the intact
pollen observed
萌发的完整壁花粉数
No. of the intact pollen germinated
数量 No. 频率 Frequency( % )
PEG 10% 274 28 1012 232 134 5718
PEG 10% + 0101% H3BO3 212 30 1412 240 168 7010
PEG 15% 222 41 1815 252 185 7314
PEG 15% + 0101% H3BO3 238 77 3213 248 210 8417
PEG 20% 234 58 2418 254 186 7312
PEG 20% + 0101% H3BO3 230 68 2916 262 206 7817
PEG 15% + 0101% H3BO3
+ 5% Sucrose
242
　
82
　
3319
　
251
　
218
　
8619
　
14
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
21213　水解乳蛋白 (LH ) 和聚乙烯吡咯烷酮
( PVP) 对脱外壁花粉萌发的影响 　在脱外壁花粉
的萌发液中不添加 LH或仅加 LH均不能起到良好
的萌发效果 (表 5) , 只有添加 PVP和 LH才能更
好的促使脱外壁花粉萌发 , PVP可能起到了一种
保护内壁和花粉管尖的作用 , 而 LH促进了花粉
管的伸长。
3　讨论
311　脱外壁花粉的制备
脱外壁花粉是近年来建立的介于花粉与原生
表 5　L H和 PVP对脱外壁花粉萌发的影响
Table 5　Effects of L H and PVP on germ ina tion of
the de2ex ined pollen
处理
Treatment
脱外壁花粉数
No. of the
de2exined
pollen observed
萌发的脱外壁花粉数
No. of the de2exined
pollen germ inated
数量
No.
频率
Frequency(% )
PVP 100 mg/L 334 42 1216
0101% LH 330 110 3313
PVP 100 mg/L + 0101% LH 321 123 3813
0102% LH 328 98 2919
PVP 100 mg/L + 0102% LH 320 118 3619
质体间的独特体系 , 迄今 , 脱外壁花粉的分离仅在极少数植物中获得成功 , 在最初只有烟草是有目的
研究〔7〕, 其余多为分离花粉原生质体中的附带发现〔8, 9〕, 后来才相继在芸薹属等植物中展开深入的研
究〔6〕。就目前的报道来说 , 脱外壁花粉的制备大体上分为 : 低温水合、水合 —酶解、多步冲击 3种方
法〔1〕。低温水合适用于外壁薄而内壁厚的花粉 , 花粉在水溶液中浸泡一段时间后 , 外壁即可开裂 ,
像南美扁柏 (Cupressus arizon ica )、萱草 ( Hem eroca llis fu lva L. )、风雨花 ( Zephyran thes grand if lora )
等〔6〕。茄科的马铃薯 , 它的花粉萌发孔呈对称结构 , 花粉外壁坚厚 , 不像其他作物花粉那样易于脱
去外壁〔10〕。本研究采用先将花粉饥饿处理 , 造成花粉营养饥饿 , 对外界呈感受态 , 再经长时间低温
水合 , 使水合液能够透过花粉萌发孔而渗透外壁 , 然后进行高温热激和渗激 , 通过前后温度和渗透压
的变化 , 改变了内、外壁和原生质体三者之间的关系 , 使花粉外壁开裂最终脱去外壁。
312　脱外壁花粉的萌发
脱外壁花粉与花粉粒相比对萌发有更高的要求〔6〕。马铃薯花粉粒在仅含有蔗糖、Ca2 +和 BO3 -3 的
萌发液中就能萌发 , 但马铃薯脱外壁花粉只有在适用于马铃薯花粉原生质体的 K3培养基的基础上 ,
添加 PEG、高浓度的 H3 BO3、LH和 PVP等添加物方可萌发 , 且萌发需时较长。Zhang等〔11〕报道高浓
度的蔗糖对花粉管生长有害 , 原因在于蔗糖能改变细胞膜透性 , 促使花粉管活性物质外泄 , 部分蔗糖
水解导致渗透压和 pH值的改变而影响花粉管生长。但 PEG不易被分解 , 可以保持培养基稳定的渗透
压 , Jahnen等〔12〕在烟草上的试验也证实这一结论 , 我们的试验也同样证明 , PEG能保持培养基稳定
的渗透压 , 对马铃薯脱外壁花粉萌发至关重要。另外 , Xu等〔2〕证明 Ca2 +在细胞膜中极性分布决定着
脱外壁花粉的萌发位点 , 从而影响萌发效果。试验说明从完整花粉到脱外壁花粉 , 再到原生质体对萌
发培养的要求越来越严格。据王劲等〔13〕的研究可能的原因是外壁与内壁在花粉萌发的生理过程中各
自起着不同的作用。Feijó等〔14〕报道 , 外壁束缚造成的花粉膨压在花粉的萌发过程中也起着不可忽视
的作用 , 且外壁在萌发处的不连续性对花粉萌发所需要的极性建立具有重要意义。马铃薯脱外壁花粉
难以萌发可能是缺少外壁束缚以及外壁、含油层中的类黄酮素所致 ; 另外 , 在萌发前制备脱外壁花粉
的过程中 , 饥饿处理的时间 , 以及水合液的浓度等均影响脱外壁花粉的萌发。因此在今后的研究中应
该设计更严密的试验 , 找出脱外壁花粉萌发的营养条件 , 并进一步探索其萌发、授粉的生物学意义。
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图版说明 : 1. 从花药中释放的花粉粒群体 ( ×70) ; 2. 热激后花粉粒质壁分离 ( ×600) ; 3. 外壁大部分脱开 ( ×600) ; 4. 外壁和
花粉粒一侧相连 ( ×600) ; 5. 外壁完全脱离 ( ×600) ; 6. 脱外壁花粉萌发花粉管群体 ( ×260)。
Explana tion of pla tes: 1. A population of pollen that from anthers ( ×70) ; 2. Pollen p lasmolysis after heat2shock ( ×600) ; 3. A large part
of exine detached ( ×600) ; 4. Exine associate with a site of pollen ( ×600) ; 5. Exine of pollen comp letely detached ( ×600) ; 6. A popu2
lation of pollen tubers germ ination from the de2exined pollen ( ×260) .
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