全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (3) : 539～543
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 07 - 11; 修回日期 : 2005 - 11 - 21
基金项目 : 国家 ‘863’项目 (2003AA207120) ; 国家自然科学基金项目 (30370981) ; 农业部遗传与生理重点实验室项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wangxw@mail1caas1net1cn)
利用 AFL P标记辅助甘蓝显性雄性不育高代回交系
选择
黄和艳　张延国　邓　波　娄　平　王晓武 3
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 以甘蓝显性雄性不育系 DGMS79239923与优良品系 02212回交自交系为材料 , 利用远红外荧光
标记 AFLP技术及 L i2cor基因测序仪对回交自交系不同基因型 (M sM s、M sm s和 m sm s) 材料进行 AFLP连锁
标记快速筛选 , 从 512对引物组合中筛选出 17个差异标记。利用这些差异标记在 02212回交 8代群体中进
行检测 , 其中 11个为与显性核不育基因相连锁的 AFLP标记 , 覆盖 21 cM; 另外 6个标记为与显性核不育
基因不连锁的遗传滞留连锁群 , 跨越 9 cM。通过分析选择了其中 3个单株为理想的雄性不育株 , 可用于进
一步回交。
关键词 : 甘蓝 ; 显性核雄性不育 ; AFLP; 标记辅助选择
中图分类号 : S 63511　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0320539205
Applica tion of AFL P M arkers in A ssisted Selection of Cabbage ( B rassica
o le racea ) D om inan t M a le Ster ility H igh Genera tion Backcrosses
Huang Heyan, Zhang Yanguo, Deng Bo, Lou Ping, and W ang Xiaowu3
( Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricultura l Sciences, B eijing 100081, Ch ina)
Abstract: Three different genotypes (M sM s, M sm s and m sm s) generated by selfing an individual after 8
generation by backcrossing the line 02212 into a dom inant male sterile line DGMS79239923 were rap idly
screened using infrared fluorescence2labeled AFLP technology and L i2cor gene sequencer. In total, 17 AFLP
markers were identified by screening 512 p rimer combinations. 11 markers covering 21 cM linked to the dom i2
nant male sterility gene were found in 95 individuals of BC8 population, while the other 6 markers covering 9
cM were genetic carry2over without linkage to the gene. Three p rom ising male sterile individuals were selected
using the marker information, which had both less genetic drag and carry2over for further backcross.
Key words: B rassica oleracea; Dom inant male sterility; AFLP; Marker2assisted selection
甘蓝 (B rassica oleracea L. var. capita ta) 雄性不育在杂种优势利用中具有重要价值。1979年方智
远等首次在结球甘蓝材料 792399的自然群体中发现显性雄性不育材料〔1, 2〕, 目前虽然已经建立了杂交
制种的技术体系〔2〕, 但利用分子标记辅助雄性不育选择尚处于起步阶段。
在甘蓝显性核不育基因分子标记的研究中 , 王晓武等 1998年首次利用 RAPD技术获得了一个连
锁距离为 718 cM的 OT11900标记 , 并转化成 SCAR和 ERPAD标记 EPT11900〔3, 4〕; 刘玉梅等利用 RFLP
技术获得了与显性核不育基因连锁的 RFLP标记〔5〕, 但这些标记由于数目太少、距离太远或分子标记
技术本身的缺限在实际应用中受到一定的限制。另外 , 以往研究重点是利用分子标记辅助不育基因本
身的转育 , 没有考虑非连锁背景片段的淘汰。本文采用 AFLP标记技术 , 通过对甘蓝回交自交系及回
交 8代群体的分析 , 获得了可用于显性雄性不育基因辅助选择的标记 , 并利用这些标记从不育基因本
身和遗传背景两个方面对甘蓝显性雄性不育进行了辅助选择。
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1　材料与方法
研究使用了甘蓝显性雄性不育系 DGMS79239923与 02212纯合可育系回交 8代的分离群体及 02212
高代回交后的自交系 BC8 S1。甘蓝叶片采用 Q IAGEN公司生产的 M ixerM illMM300研磨 , DNA提取方
法参照改良 CTAB法。
AFLP分析主要参照 Vos等〔6〕发表的方法并略有改动 : 使用远红外荧光 IRD2700和 IRD2800标记
的 EcoR I引物 ; 扩增完毕后加入等体积变性剂 , 95℃变性 5 m in后迅速置于冰上 , 取 015μL用于测
序仪电泳分析 ; 电泳采用 L icor公司 NEN Global Edition IR2 DNA Analyzer (Model 4200 L I2COR B iosci2
ences, L incoln, NE) 自动测序仪系统 , 电泳结束后从测序仪上自动获取图像进行分析。
采用 Joinmap 310软件进行标记连锁分析 , 计算标记与表型性状间连锁距离。交换单株连锁图谱
标记的图形显示使用 GGT32软件。
2　结果与分析
211　田间植株育性调查
田间共种植 95株 02212回交 8代分离群体单株 , 开花后观测植株育性 , 其中花粉育性正常的单
株记为可育株 , 而无花粉、花药短缩干瘪的单株均记为不育株。试验中共观测记录到 93个单株的育
性 , 其中 41株为可育株 , 52株为不育株 , 其分离比符合孟德尔遗传规律 (X20105 = 3184)。
212　D NA的提取
每个样品取 1 cm2 的叶片 , 使用 M ixer M ill MM300在 2～4 m in内研磨所有 95个样品 , 提取出的
DNA样品浓度均匀一致 , 最高浓度为 7515 ng/μL, 最低为 3613 ng/μL, 平均为 5112 ng/μL, 适合用
于 AFLP标记的快速检测图 1。
213　利用 L i2CO R测序仪快速筛选显性核不育基因相连锁 AFL P标记
本试验通过利用 512对引物组合对回交自交系 3种不同基因型材料的筛选 , 共获得 28个只在两
个不育材料中出现的特异性片段 , 初步确定它们可能与雄性不育基因相连锁 (图 2)。利用 95个 BC8
单株对所获得的 28个标记进行群体检测 (图 3) , 根据在 BC8 代分离情况进行标记的取舍并计算标记
与显性雄性不育基因之间的连锁距离。
214　显性雄性不育基因临近区域连锁标记图谱的绘制
利用 Joinmap 310软件计算标记与雄性不育基因间连锁距离并绘制连锁图 (图 4)。试验所得与雄
性不育连锁的标记均位于不育基因的一侧 , 集中在 21 cM的范围内 , 其中 e35m80和 e36m73集中在 5
cM的范围内 ; 11个标记中连锁最近距离为 1 cM , 最远为 21 cM , 其中标记 e37m7523和 e37m31为同
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　3期 黄和艳等 : 利用 AFLP标记辅助甘蓝显性雄性不育高代回交系选择 　
图 3　利用远红外荧光标记引物与自动测序仪结合筛选与甘蓝显性核不育基因连锁 AFL P标记 ( e36m58) 图谱
“F”和 “S”分别代表可育和不育单株。
F ig. 3　Prof iling of AFL P markers e36m58 linked to cabbage dom inan t ma le ster ility gene using near infrared fluorescence
labeled pr im ers and L icor automa ted D NA sequencers
“F”and“S”indicate fertile and sterile p lants respectively.
图 4　根据 95个单株计算的雄性不育标记连锁距离 (右为标记 , 左为 cM )
F ig. 4　M arkers linked to the M S gene, genetic d istance in cen tiM organ s between adjacen t loc i were estima ted ba sed
on the ana lysis of 95 BC8 plan ts
一位点上的两个不同标记。
另外 , 有一个与雄性不育性不连锁的独立的连锁群存在 , 因与雄性不育基因之间不存在连锁关
系 , 属于遗传滞留。在这个独立的连锁群中的遗传标记共有 6个标记 , 分别在 3个不同位点 , 覆盖
816 cM。95个单株中含滞留片段的单株数为 36株 , 达 37189% , 52个不育株中含 816 cM或 3185 cM
的滞留片段的单株数为 17和 6株 , 滞留片段存在百分比分别为 32169%和 11154%。由于该滞留片段
在可育株中同样出现分离 , 推测该片段来源于不育源材料。
用标记辅助育种的正确性评估如表 1所示。由以上标记可以看出 , 标记离雄性不育基因的距离越
近 , 标记辅助选择时检测正确的趋势越高。标记 e36m73与不育基因的距离仅 1 cM , 选择检测正确率
达 9719% ; 标记 e35m80与不育基因的距离为 117 cM , 选择检测正确率却高达 9819% ; 当标记与不
育基因的距离远至 914 cM时 , 选择检测正确率也相应地降到 8812% ; 离不育基因最远 (21 cM ) 的
标记 e37m44, 选择的准确性为 7916%。因此 , 在利用分子标记进行苗期辅助选择时 , 要尽可能地应
用与雄性不育基因距离较近的标记以获得尽可能高的选择效率。
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e36m73和 e35m80两个标记与不育基因遗传距离加大 , 选择准确性反而提高 , 是因为其中一个
可育株恰在 e36m73与雄性不育基因之间发生了交换 , 导致使用 e36m73标记能检测到带而此株却仍
为可育株 , 这种可育株小片段近距离的交换出现的概率极小 , 这也说明精确确定两个近距离位点的遗
传距离需要较大的分离群体。
表 1　显性雄性不育基因相引相标记基因型预测准确性
Table 1　Genotyp ing accuracy using markers linked in
coupling pha se to the dom inan t a llele of M s
标记
Markers
遗传距离 L inkage
distances( cM)
错误株数
Incorrectly p redicted
正确率
Accuracy( % )
e36m73 110 2 9719
e35m80 117 1 9819
e36m75 914 11 8812
e32m67 1014 12 8711
e38m55 1019 12 8711
e32m71 1213 16 8218
e37m31 1318 17 8117
e37m44 2110 19 7916 表 2　交换单株连锁累赘和遗传滞留片段长度Table 2　The length of linkage drag and genetic tak ing over incrossover ind iv idua ls ( cM)单株编号Plant No. 连锁累赘片段D rag 遗传滞留片段Taking over12 516 013 516 81634 516 048 1314 81676 015 81686 516 81688 1314 3185
215　交换单株分析
有一部分的单株发生了交换。41株可育株中有 8株发生了交换 , 交换率达 1915% , 52株不育株
中有 7株发生了交换 , 交换率达 1315% , 95个单株的群体交换率达 1518%。不育交换单株的交换位
点图形显示如图 4所示。
交换单株中部分单株存在遗传滞留。不育交换单株中连锁累赘与遗传滞留片段长度如表 2所示。
76号单株所检测到的连锁累赘片段长度最短 , 仅有 015 cM , 也检测到 816 cM长的遗传滞留片段 ; 相
对而言 , 12与 34号单株所检测到的连锁累赘片段稍长 , 为 516 cM , 但这两株没有检测到遗传滞留片
段的存在。对于这两种情况 , 在实际选择中就需要区分对待。若轮回亲本中供体亲本所滞留下来片段
的对应位点并不是重要的经济性状或不是与抗病抗逆性密切相关的基因或 QTL, 则 76号单株具有较
高的利用价值 ; 相反 , 若轮回亲本中供体亲本所滞留下来遗传片段的对应位点是非常重要的经济性
状、抗病抗逆性状等密切相关的基因或 QTL, 则 12与 34号单株在生产中具有更高的利用价值。
3　讨论
甘蓝是两年生蔬菜作物 , 属低温幼苗春化类型 , 常规育种中进行雄性不育选择必须等到开花后才
能进行 , 而开花必须经过漫长的冬季或在其它季节进行人工低温春化 , 费时费力。利用标记技术则可
以提前在苗期进行辅助选择 , 从而节省大量的人力和物力。
本试验获得的 11个标记均位于核不育基因的一侧 , 没有获得另一侧翼标记 , 可能由于在连续的
回交过程中在非常靠近不育基因的一侧发生了交换 ; 由于双侧翼标记可靠性优于单侧标记 , 可以通过
筛选更多的引物组合或选用低世代的群体来获得双侧翼标记。对标记辅助育种来说 , 由于 AFLP标记
技术难度大和成本较高。在实际应用中通常可以通过测序并重新设计引物进行特异性扩增 , 进而转化
成 SCAR、CAPS和 SNP等易于在育种中应用的标记技术。
通过 M ixerM illMM300与荧光测序仪相结合 , 本研究建立了一套高效的 AFLP系统 , 为分子标记
辅助育种提供一种快速标记鉴定手段 ; 同时在此基础上获得与甘蓝显性雄性不育连锁的 11个标记 ,
目前将标记转化成 SCAR或 SNP应用于标记辅助育种的工作正在进行中。
另外 , 在甘蓝回交转育的过程中 , 转育回交各代均经人工选择 , 在回交 8代后的高代回交群体
中 , 通过分子标记技术 , 在检测到 30 cM的图距中即有 9 cM长的片段为遗传滞留 , 不经过分子标记
辅助选择 , 在甘蓝的高代回交群体中这种滞留现象仍然存在。倘若在雄性不育性的转育过程一开始就
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　3期 黄和艳等 : 利用 AFLP标记辅助甘蓝显性雄性不育高代回交系选择 　
寻找与该不育基因相连锁的分子标记 , 采用分子标记辅助选择 , 就可能较早地剔除遗传滞留 , 缩短育
种年限。
参考文献 :
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