全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (3) : 329 - 336
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 09 - 01; 修回日期 : 2008 - 01 - 12
基金项目 : 辽宁省重点实验室专题项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhangz@ syau1edu1cn)
甜樱桃品种 SSR指纹检索系统的开发及遗传多样
性分析
张琪静 1, 2 , 张新忠 3 , 代红艳 1 , 谷大军 2 , 闫桂军 4 , 李春敏 3 , 张志宏 13
(1 沈阳农业大学园艺学院 , 沈阳 110161; 2 辽宁省果树科学研究所 , 辽宁熊岳 115214; 3 河北省农林科学院昌黎果树
研究所 , 河北昌黎 066600; 4 西澳大学 , 珀斯 6009, 澳大利亚 )
摘 　要 : 应用 SSR技术开发了甜樱桃 ( Prunus avium ) 指纹检索系统并进行遗传多样性分析。18对樱
桃、桃和杏的引物在 19份甜樱桃及 2份草原樱桃 ( P. fruticosa) 品种中共扩增出 83个等位位点 , 每个
SSR位点的等位位点数 2～8个 , 平均 416个 , 多态性信息量 ( P IC) 变化范围为 0138～0180, 平均为
0164。7个甜樱桃品种具有特殊位点或特殊带型。利用 UDP982414、UDP982406、UDP962001及 PMS40等 4
对引物开发的指纹检索系统 , 可以区分 18个甜樱桃品种。根据遗传距离进行聚类分析 , 19个甜樱桃品种
分成 2组 , 甜樱桃品种间的聚类结果基本反映了供试材料之间的亲缘关系。
关键词 : 甜樱桃 ; SSR; 遗传多样性 ; 品种鉴定 ; 指纹检索系统
中图分类号 : S 66215　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0320329208
D evelopm en t of F ingerpr in ting Key and Ana lysis of Genetic D iversity w ith
SSR M arker for Sweet Cherry Cultivars
ZHANG Q i2jing1, 2 , ZHANG Xin2zhong3 , DA I Hong2yan1 , GU Da2jun2 , YAN Gui2jun4 , L I Chun2m in3 , and
ZHANG Zhi2hong13
(1 College of Horticu lture, Shenyang A gricultural U niversity, Shenyang 110161, China; 2L iaon ing Institu te of Pom ology,
X iongyue, L iaon ing 115214, China; 3 Changli Fru it Research Institu te, Hebei A cadem y of A griculture and Forestry Sciences,
Changli, Hebei 066600, Ch ina; 4 The U niversity of W estern A ustralia, Perth 6009, A ustra lia)
Abstract: SSR technique was used to develop fingerp rinting key and study the genetic diversity on sweet
cherry. Eighteen pairs of p rimers cloned from cherry, peach and ap ricot amp lified a total of 83 alleles among
the 19 cultivars of sweet cherry ( P runus avium ) and 2 cultivars of ground cherry ( P. fru ticosa). The number
of alleles amp lified per p rimer pair ranged from 2 to 8, with a mean of 416. The polymorphic information
content values ( P IC) ranged from 0138 to 0180, with a mean of 0164. Seven sweet cherry cultivars showed
unique bands or banding patterns. A fingerp rinting key developed by 4 pairs of p rimers: UDP982414, UDP982
406, UDP962001 and PMS40 could discrim inate 18 sweet cherry cultivars. UPGMA cluster analysis of genetic
distance separated the 19 cultivars of sweet cherry into two group s. The phylogeny of sweet cherry cultivars
revealed the closed relationship s among cultivars tested.
Key words: sweet cherry; SSR; genetic diversity; cultivar identification; fingerp rinting key
甜樱桃 ( P runus avium L. , 2n = 16) 起源于里海和黑海地区 , 16世纪在欧洲开始经济栽培 , 目前
在欧洲及西亚地区大面积栽植 (W ebster, 1996) , 生产上应用的主要栽培品种大部分来自几个古老的
野生品种 , 遗传背景较窄 ( Iezzoni et al. , 1990)。
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
　　甜樱桃引入中国已有 100多年的历史 , 由于中国樱桃的育种工作开展较晚 , 基础薄弱 , 选育出的
品种较少 , 主栽品种多引自国外 , 不能很好地适应中国的环境条件。此外 , 由于早期对甜樱桃品种缺
乏可靠的鉴定方法 , 致使出现同物异名和同名异物现象 , 品种混乱问题对甜樱桃生产造成很大的损
失。因此 , 通过选配良好的亲本组合来选育新品种及快速准确鉴别甜樱桃良种 , 已成为当前樱桃生产
及科研中急需解决的问题。
SSR ( Simp le sequence repeat简单序列重复 ) 标记在基因组间广泛分布 , 具有信息量高、呈共显
性遗传、重复性好、易于分析、检测较为简单等优点 , 近年来迅速应用于人类遗传和许多动物研究中
(W eissenbach et al. , 1992) , 同时也广泛应用于植物基因组的研究 ( Gup ta & Varshney, 2000)。虽然
已有利用 SSR分子标记研究樱桃遗传多样性的报道 (Wünsch & Hormaza, 2004; 艾呈祥 等 , 2007) ,
但对甜樱桃商业品种 SSR指纹检索系统的开发尚未见报道。
本研究中应用来自樱桃、桃及杏的引物对目前生产上来自不同国家和地区的甜樱桃主栽品种进行
DNA水平的遗传多样性分析 , 构建了 UPGMA聚类树 , 并首次开发了甜樱桃品种的 SSR指纹检索系
统 , 为甜樱桃栽培品种的快速准确鉴定及资源创新和育种实践提供分子依据。
1　材料与方法
111　植物材料
供试樱桃品种由辽宁省果树科学研究所樱桃课题组及沈阳农业大学园艺系樱桃课题组提供 , 包括
19个甜樱桃 ( P. avium ) 品种和 2个草原樱桃 ( P. fru ticosa ) 品种 , 其中草原樱桃作为验证聚类分
析结果的外类群 (表 1)。
表 1　供试樱桃品种、来源及主要农艺性状
Table 1　Cherry cultivars used in the research, the ir‘or ig in and ma in agronom ic character istics
种类
Species
编号
Code
品种
Cultivar
来源
O rigin
种类
Species
编号
Code
品种
Cultivar
来源
O rigin
甜樱桃 1 佳红 J iahong 中国 China 12 黑兰特 Heilante 美国 America
P. avium 2 红蜜 Hongm i 中国 China 13 顽童 W antong 乌克兰 Ukraine
3 红灯 Hongdeng 中国 China 14 早大果 Zaodaguo 乌克兰 Ukraine
4 82129 中国 China 15 极佳 J ijia 乌克兰 Ukraine
5 岱红 Daihong 中国 China 16 乌梅极早 W umei J izao 乌克兰 Ukraine
6 那翁 Napoleon 欧洲 Europe 17 抉择 Juega 乌克兰 Ukraine
7 沙蜜豆 Summ it 加拿大 Canada 18 宾库 B ing 美国 America
8 拉宾斯 Lap ins 加拿大 Canada 19 早红宝石 Early Ruby 乌克兰 Ukraine
9 美早 Tieton 美国 America 草原樱桃 20 新星 Xinxing 俄罗斯 Russia
10 小紫 Xiaozi 法国 France P. fru ticosa 21 阿斯卡亚 A sikaya 俄罗斯 Russia
11 帝王 Royalton 美国 America
112　D NA提取和 PCR扩增
采用改良 CTAB法从健康的樱桃冬芽中提取基因组 DNA (张琪静 等 , 2007)。通过琼脂糖凝胶电
泳和紫外分光光度计测定来检测 DNA质量和浓度。将提取的 DNA样品稀释到 50 ng·μL - 1后 , 置于
- 20 ℃保存。
根据参考文献 (Cip riani et al. , 1999; Testolin et al. , 2000; Cantini et al. , 2001; A ranzana et al. ,
2002; Decroocq et al. , 2003; Struss et al. , 2003) , 选择了来自樱桃、桃及杏的 SSR引物 70对 , 由北
京赛百盛基因技术有限公司合成。引物的退火温度经筛选试验获得。反应在 MJ Research PTC2100型
PCR仪上进行。SSR扩增热循环参数 : 94 ℃预变性 4 m in, 然后 94 ℃变性 45 s, 56～63 ℃退火 45 s,
72 ℃延伸 45 s, 共 28～31个循环 , 最后 72 ℃延伸 8 m in。SSR反应条件经过优化确定为 : 20μL体
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　3期 张琪静等 : 甜樱桃品种 SSR指纹检索系统的开发及遗传多样性分析 　
系含 Mg2 + 115 mmol· L - 1 , dNTPs 0120 mmol· L - 1 , 引物浓度 014μmol· L - 1 , TaqDNA聚合酶 1 U ,
模板 DNA浓度为 10～40 ng。扩增产物用 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 银染检测 (Bassam et al. ,
1991)。
113　数据分析
电泳图谱的每条带均为一个分子标记 , 代表一对 SSR引物的结合位点。根据条带的有无统计所
有的二元数据 , 有带记作 1, 无带记为 0, 根据二元数据计算多态性位点百分数 , 统计相关 SSR 引物
不同等位位点数 , 计算每个 SSR位点的多态信息含量 ( P IC) (Botstein et al. , 1980) , P IC = 1 -ΣP i2 ,
其中 P i为某个 SSR位点的第 i个等位变异出现频率占该位点全部等位变异出现频率。采用 PAUP410
软件 ( Swofford, 1998) 计算遗传距离 , 然后采用类平均法 (UPGMA) 对遗传距离矩阵进行聚类 , 并
建立树状图。
2　结果与分析
211　SSR标记多态性分析
经预备试验从 70对樱桃、桃及杏的 SSR引物中筛选出 18对多态性较高、稳定性较好、分辨率较
高的引物 , 对 21份樱桃材料进行扩增 , 在 83个等位位点上扩增出的产物片段大小在 65～300 bp之间
(表 2)。
每对引物可以检测到等位位点 2～8个 , 平均每对引物有 416个等位位点 (甜樱桃种内品种为
317) ; 在 83个位点中 , 80个 (9613% ) 为多态性位点 , 只有 3个 (316% ) 为单位点 , 其中甜樱桃
种内扩增出 68个位点 , 草原樱桃种内增出 29个位点 , 14个位点为甜樱桃和草原樱桃共有。
在检测的所有位点上 , 引物 UDP982414检测到的位点最多 , 达 8个 , 引物 PacB35检测等位位点
数最少 , 为 2个。
表 2　SSR引物基本信息及在甜樱桃和草原樱桃上的扩增结果
Table 2　D escr iption of SSR pr im ers used and the am plif ica tion results in sweet cherry and ground cherry
引物
Primers
来源
Source
退火温度
/℃
Annealing
temperature
片段长度
/ bp
Size range
甜樱桃
Sweet cherry
等位位点数
Number of alleles
多态信息指数
P IC
甜樱桃和草原樱桃
Sweet cherry and ground cherry
等位位点数
Number of alleles
多态信息指数
P IC
PacA10 杏 Ap ricot 5618 85～170 3 0145 4 0153
PacB35 杏 Ap ricot 6210 220～230 2 0130 2 0140
PceGA59 樱桃 Cherry 5710 180～300 2 0149 2 0148
PMS2 樱桃 Cherry 6115 180～215 3 0160 4 0162
PMS30 樱桃 Cherry 6012 130～185 5 0178 6 0180
PMS40 樱桃 Cherry 5616 90～105 4 0159 5 0162
UCD2CH 11 樱桃 Cherry 6210 115～165 5 0171 6 0174
UCD2CH 12 樱桃 Cherry 6110 170～200 4 0172 5 0175
UCD2CH 17 樱桃 Cherry 6115 185～200 2 0136 3 0138
UCD2CH 18 樱桃 Cherry 6118 185～200 4 0161 4 0170
UCD2CH 31 樱桃 Cherry 6210 125～150 5 0172 6 0173
UDP962001 桃 Peach 5712 100～200 4 0153 5 0172
UDP972403 桃 Peach 6015 100～150 4 0169 5 0172
UDP982021 桃 Peach 6218 95～125 3 0158 3 0157
UDP982022 桃 Peach 6110 90～110 4 0163 5 0165
UDP982024 桃 Peach 6015 65～80 2 0149 4 0156
UDP982406 桃 Peach 5510 85～125 5 0172 6 0174
UDP982414 桃 Peach 6112 160～185 6 0175 8 0176
平均值 Mean 317 0160 416 0164
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
　　如图 1所示 , 引物 UDP982024在甜樱桃和草原樱桃上共扩出 4个位点 (A～D) , 其中 A、B为甜
樱桃特有的位点 , C、D为草原樱桃特有的位点。
图 1　引物 UD P982024在 21个樱桃品种上的扩增结果
M. 50 bp DNA marker; 1～21代表材料 , 见表 1。
A、B: 甜樱桃位点 ; C、D: 草原樱桃位点。
F ig. 1　Am plif ica tion of pr im er UD P982024 in 21 cherry cultivars
M. 50 bp DNA marker; The same code as shown in Table 1.
A, B: A lleles of P. auium ; C, D: A lleles of P. fru ticasa.
212　多态性信息量分析
P IC是衡量微卫星引物多态性高低的一个较好指标。Botstein等 (1980) 首先提出了衡量基因变
异程度高低的多态性信息量指标 , 当 P IC > 015 时 , 该引物为高度多态性信息引物 , 当 0125 < P IC <
015时为中度多态性信息引物 , 当 P IC < 0125时为低度多态性信息引物。由表 2可知 , 21个樱桃材料
中 , 除 UCD2CH 17、PceGA59、PacB35等 3对引物为中度多态性引物外 , 其余 15对引物均为高度多
态性引物 , 引物 P IC值幅度由 0138 ( PacB35) 到 0180 ( PMS30) , 平均值为 0164。19份甜樱桃种内
扩增 , 中度多态性引物对数量增加 2个 , 即引物 UDP982024和 PacA10也为中度多态性引物 , 其余 13
对引物为高度多态性引物 , 引物 P IC值幅度 013 ( PacB35) ～0178 ( PMS30) , 平均值为 0160, 表明供
试引物能较高信息量地反映甜樱桃及其近缘种草原樱桃的基因多样性水平 , 可以作为樱桃种内资源及
种间种质资源遗传多样性分析的有效分子标记。
213　品种鉴别及指纹检索系统开发
除红灯与岱红的扩增图谱完全相同外 , 18对 SSR引物可将其他的甜樱桃品种全部区分开。引物
UDP982414、UDP982406、UDP982022、UCD2CH 11、UCD2CH 12、UCD2CH 18、UCD2CH 31、 PMS30
及 PMS40具有较高的品种鉴别力 , 根据品种独有的特殊位点和特殊带型 , 可以直接鉴定出 82129、黑
兰特、小紫、抉择、早大果、乌梅极早及早红宝石 7个品种 (表 3)。
表 3　甜樱桃品种 SSR引物扩增特殊位点及特殊带型
Table 3　Pr im ers genera ting un ique bands and un ique band pa ttern s in seven sweet cherry cultivars
样品名
Cultivar name
特殊位点
Unique bands
特殊带型
Unique banding patterns
82129 UDP982406 UCD2CH 12 PMS2
黑兰特 Heilante UCD2CH 31 (130 bp) UCD2CH 11 UCD2CH 31 UDP982414
小紫 Xiaozi UDP982414
抉择 Juega PMS40 (140 bp) PMS40 UCD2CH 18 UDP982022 UDP982414
早大果 Zaodaguo PMS40 (190 bp)
乌梅极早 W umei J izao PMS30 (185 bp) UCD2CH 31
早红宝石 Early Ruby PMS40
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　3期 张琪静等 : 甜樱桃品种 SSR指纹检索系统的开发及遗传多样性分析 　
　　黑兰特、抉择、乌梅极早等 3个品种具有特殊位点 , 还具有特殊带型 , 早大果具有特殊位点 ,
82129、小紫和早红宝石则具有特殊带型。具有特殊位点和特殊带型最多的品种为抉择 , 其次为黑兰
特和 82129。这说明上述 7个品种有不同的遗传背景 , 遗传多样性相对较高 , 作为亲本可以拓展甜樱
桃育种的遗传基础。
此外 , 利用 UDP982414、UDP982406、UDP962001及 PMS40等 4对引物 , 根据扩增条带的不同位
点及各个品种间的不同带型开发了 18个甜樱桃品种的指纹检索系统 (图 2) , 根据检索系统 , 可逐步
鉴别区分这些品种。
图 2　应用引物 UD P982414、UD P982406、UD P962001和 PM S40扩增 18个甜樱桃品种形成的 SSR指纹检索系统
用引物名称命名 SSR谱带 (例如 : UDP982414) , 下角标为片段长度 ( bp) , SB和 DB分别表示品种间
具有相同的带型和不同的带型。黑体表示鉴别出的品种。
F ig. 2　SSR marker f ingerpr in ting key for 18 sweet cherry cultivars genera ted from am plif ica tion products of pr im ers
UD P982414, UD P982406, UD P962001 and PM S40
SSR bands are designed by the p rimer name ( i. e. UDP982414) followed by the fragment size in bp.
SB and DB respectively indicate the same and different banding pattern shared by the cultivars.
Identified cultivars are shown with bold text.
214　遗传距离分析及聚类分析
21个樱桃品种的遗传距离在 0～0151之间 , 最小值为 0 (红灯和岱红之间 ) , 最大值出现在甜樱
桃与草原樱桃之间 , 为 0151 (美早、小紫、红蜜、顽童、抉择、早大果等 6个品种与阿斯卡亚之间
及红蜜与新星之间 )。在甜樱桃种内 , 宾库与抉择、黑兰特与抉择亲缘关系最远 , 遗传距离均为
0146。草原樱桃阿斯卡亚与其它品种之间遗传距离最大 , 平均值为 0146, 其次为草原樱桃新星 , 与其
它品种之间的遗传距离的平均值为 0143。
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对 21份樱桃材料的 SSR聚类分析结果如图 3所示。21个品种可分为 A和 B两大类 , 所有的甜樱
桃品种聚在一起形成类群 A, 草原樱桃两个品种以 100%自展支持率单独形成 1个外类群 B, 与植物
分类学上的划分是相吻合的。A类甜樱桃种群内可以分为两个组 (自展支持率 96% ) , 组群 Ⅰ包括 11
个品种 , 组群 Ⅱ包括 8个品种。组群 Ⅰ又可进一步分为 3个小组 , Ⅰ - 1组内 , 小紫、红密、那翁先
聚合然后和佳红、沙蜜豆一组聚合。Ⅰ - 2组 (自展支持率 58% ) 内 , 帝王与宾库先聚在一起 , 然
后与拉宾斯聚在一起。Ⅰ - 3组包括黑兰特、极佳及乌梅极早等 3个品种。组群 Ⅱ也进一步分为 3个
小组 , Ⅱ - 1组 (自展支持率 64% ) 内红灯和岱红聚到一起后先与美早相聚然后与 82129聚到一起。
Ⅱ - 2组 (自展支持率 100% ) 只有顽童和早红宝石两个品种。Ⅱ - 3组 (自展支持率 82% ) 内也只
有早大果、抉择两个品种。
图 3　21个樱桃品种的 SSR引物扩增 UPGM A聚类图
编号 1～21代表材料 , 见表 1。线上的数字为分枝长度 , 线下的数字为自展支持率 (1 000次重复的平均数 )。
图上只记录了自展度数值超过 50%的数据。
F ig. 3　D endrogram of 21 cherry cultivars ba sed on UPGM A ana lysis of SSR polym orph ism s
1 - 21. The number of materials shown in Table 1. Numbers above the lines indicate branch length.
Numbers below the lines indicate bootstrap values (percentage of 1 000 rep licates) .
Bootstrap values greater than 50% are shown.
3　讨论
植物间 SSR引物通用在某种程度上反映出一定的亲缘关系 , 核果类不同种间 SSR引物通用较普
遍。本研究中 , 18对引物在 19个甜樱桃品种上的扩增结果表明 , 平均每个位点的等位基因和遗传多
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　3期 张琪静等 : 甜樱桃品种 SSR指纹检索系统的开发及遗传多样性分析 　
态信息量分别为 317及 0160。其中 , 等位位点数与 Wünsch和 Hormazae (2002) 用 9对桃 SSR引物
扩增 76份甜樱桃得到的结果相同 , 略高于 25个桃品种的 314 (A ranzana et al. , 2002) 及略低于 27
个桃品种的 412 (D irlewanger et al. , 2002)。P IC值高于 76个甜樱桃品种的 0149 (Wünsch & Horma2
za, 2002) , 但远远低于 96个桃品种 0180 (Jaeho et al. , 2006)。桃树具有自花结实性 , 遗传基础相
对较窄 , 从而表现遗传多样性相对较小 , 樱桃与之相比 , 有自花不育性 , 需接受外来花粉 , 理论上讲
种群遗传多样性应高于桃树 , 但从等位位点数和遗传多态信息量分析 , 与桃树相差不明显 , 整个甜樱
桃种群也表现出遗传多样性相对较小。
19个甜樱桃品种扩增结果表明 , 只有 82129、黑兰特、小紫、抉择、早大果、乌梅极早及早红宝
石等 7个品种 (占总数 37% ) 具有特殊带型或特殊位点 , 说明现有的栽培品种尽管遗传距离不同 ,
但基因组 DNA多态性位点差异不明显 , 反应出品种的遗传基础相对狭窄。杂种优势的强弱取决于双
亲性状间的互相补充 , 在一定范围内 , 双亲的基因差异越大 , 亲缘关系越远 , 杂种优势就越强
( Singh, 2004) , 因此 , 可以根据品种 (系 ) 间遗传距离选配强优势杂交组合 , 以减少亲本选配的盲
目性 , 提高育种效率。
陈晓流等 (2004) 曾应用 RAPD技术分析樱桃品种 , 发现特异性扩增带的数量少甚至无 , 使得指
纹鉴定品种较为困难。使用具有共显性特点的 SSR标记对其进行品种鉴定有着明显优势。近年国外
报道用 RAPD (A starini et al. , 2006)、AFLP ( Shan et al. , 2004) 及 ISSR ( Phapmawati et al. , 2005)
等分子标记在蔬菜、作物及花卉上开发的指纹检索系统 , 分别用来鉴定花椰菜品种、鹰嘴豆品种及银
叶树品种 , 国内外尚未见用 SSR分子标记开发指纹检索系统的报道 , 且在果树上应用也是空白。用 4
对 SSR引物标记开发的指纹检索系统能使 18个甜樱桃品种相互区分 , 与传统的应用形态指标区分鉴
定品种 , 具有准确、周期短、方法直观易行且不受环境及人为因素影响等优点。本研究采用的甜樱桃
SSR指纹检索系统开发技术 , 不仅可以在核果类树种上应用 , 也可以在其它果树上应用 , 对引进品种
的鉴定 , 辨别品种的真伪 , 品种的早期选择及商业品种的知识产权注册 , 具有长远的应用前景。
通过聚类图和系谱分析可以看出 , 樱桃种内之间较种间之间的遗传距离小 , 证明了种内之间的亲
缘关系较种间之间的亲缘关系近。同时也可以看出 , 甜樱桃种内聚类结果基本反映了材料之间的亲缘
关系 , 如红蜜 (那翁 ×黄玉 ) 与那翁相互为系统选择关系 , 较早聚在一起。佳红 (宾库 ×香蕉 ) 与
宾库之间、沙蜜豆 (先锋 ×萨姆 ) 与拉宾斯 (先锋 ×斯坦勒 ) 之间血缘关系较近 , 也聚在一组。一
些近年引进的品种黑兰特、帝王、早大果、早红宝石、极佳、乌梅极早和抉择等品种 , 虽然父母本不
详 , 与已知亲本品种聚在一起 , 可以通过与已知亲本品种的遗传距离分析了解他们一些遗传背景信
息。本研究用 18对引物未能将红灯与岱红两个甜樱桃品种分开 , 说明它们之间在遗传上没有差异或
差异不在所检测的 SSR位点之内。本项研究中聚类结果基本反应了品种的地理来源 , 与艾呈祥等
(2007) 的研究结论一致。少数品种没有聚到一起 , 形成了地区间的重叠 , 表明较近的亲缘关系和在
起源上的相关性 , 也反映了进化过程的连续性 , 同时由于环境的变化和人工选择的不同 , 随着时间的
推移 , 逐渐形成了不同的地区类型。
References
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