全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (3) : 313 - 318
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 10 - 26; 修回日期 : 2008 - 01 - 10
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671437) ; 国家 ‘863’计划项目 (2006AA100108222324A)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: nnzsl@njau1edu1cn)
梨 20个品种 S基因型的鉴定及新 S2RN ases基因的
克隆
衡　伟 1 , 张绍铃 13 , 方成泉 2 , 吴华清 1 , 吴　俊 1
(1 南京农业大学园艺学院 , 南京 210095; 2 中国农业科学院果树研究所 , 辽宁兴城 125100)
摘 　要 : 为了鉴定我国梨品种和一些野生类型个体的 S基因型 , 应用 S 2RN ases特异 PCR扩增、克隆和
测序 , 对其 S2RN ases基因核苷酸序列进行分析 , 鉴定了 20个梨品种和野生类型个体的 S基因型。起源于我
国的 ‘奥连 ’ (Sp S32 )、‘吊蛋 ’ (Sd Se )、‘沙疙瘩 ’ (S36 Sd ) 品种和杏叶梨的一个类型 (S22 Sc ) 个体中存
在西洋梨的 S2RN ases基因 , 证明 S2RN ases基因分化是在东方梨种群和西方梨种群的各个种形成之前。在秋
子梨 ‘麦梨 ’、‘内蒙古山梨 ’中发现了 2 个新 S 2RN ases 基因 , 命名为 S40 2、 S41 2RN ase ( DQ903313、
DQ988687)。S40 2和 S41 2RN ase基因推导的部分氨基酸序列分别与苹果属 S11 2和 S6 2RN ase的同源性为 100%和
9414% , 这表明 S 2RN ases的存在可能在梨属和苹果属形成之前。
关键词 : 梨 ; 自交不亲和性 ; S基因型 ; S2RN ases基因
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0320313206
Iden tif ica tion of 20 S 2genotypes and C lon ing Novel S 2RN ases in Pyrus
HENG W ei1 , ZHANG Shao2ling13 , FANG Cheng2quan2 , WU Hua2qing1 , and WU Jun1
( 1 College of Horticulture, N anjing A gricultural U niversity, N an jing 210095, Ch ina; 2 Fru it Research Institu te of Chinese A cadem y
of A gricultural Sciences, X ingcheng, L iaoning 125100, Ch ina)
Abstract: To identify S 2genotypes of pear cultivars or a few types of wild species native to China,
S 2RN ase specific PCR s were used. After cloning and sequencing of PCR p roducts, the S 2genotypes of 20 culti2
vars or wild species individuals were determ ined. Subsequent sequence analysis showed that‘Aolian’
(Sp S32 ) from Pyrus sink iangensis Yü, ‘D iaodan’ (Sd Se ) from P. phaeocarpa Rehd. , ‘Shageda’ (S36 Sd )
from P. xeroph ila Yüand one type of Xingyeli (S22 Sc ) originated from China shared some S 2RN ases with spe2
cies from P. comm unis, which p rovided with evidence that S 2RN ase alleles occurred before the divergence of
oriental and occidental pear. Two novel S 2RN ases were also discovered in‘Maili’and‘Neimenggu Shanli’
in P. ussuriensis, and deposited as S40 2, S41 2RN ase under the accession numbers of DQ903313 and
DQ988687, respectively, whose deduced am ino acid sequences showed high sim ilarities to S11 2RN ase
(100% ) and S6 2RN ase (9414% ) in M a lus, respectively. The high sim ilar score between S 2RN ase in Pyrus
and M alus indicated that S 2RN ase existence p redated the speciation between Pyrus and M alus.
Key words: Pyrus; self2incompatibility; S 2genotype; S 2RN ase gene
蔷薇科果树属于配子体自交不亲和 ( gametophytic self2incompatibility, GSI) 类型 , 其 SI反应由单
一 S位点 (S 2locus) 的复等位基因控制。迄今已知花柱中 S位点产物为一类具有核酸酶 (RNase) 活
性的 S糖蛋白 , 即 S核酸酶 ( S2RNase) (McClure et al. , 1989)。基于蔷薇科植物中 S 2RN ase基因的
保守区域设计引物 , 用来鉴定不同物种中 S 2RN ase基因序列和 S基因型 , 以及研究 S 2RN ase基因的多
态性和进化特点等 (Ma & O liveira, 2002)。
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
梨 S单元型及 S1 2～S7 2RN ase等 7个 S 2RN ase基因首先在日本梨中得到了鉴定 ( Ishim izu et al. ,
1996b, 1999; Takasaki et al. , 2004)。Castillo等 ( 2001) 和 Sawamura等 ( 2002) 分别在 ‘Meiget2
su’(‘明月 ’) 和 ‘Shinsei’(‘新星 ’) 品种中鉴定出 S8 2、S9 2RN ase两个新 S 2RN ases基因。Kim 等
(2006) 利用 PCR2RFLP又在梨品种 ‘Chengsilri’中鉴定出 S10 2RN ase新基因。在西洋梨中 , 利用特
异引物和基因克隆的方法已经鉴定出 Sa ～S t ( Sa , Sb , Sc , Sd , Se /S j , Sh , S i , Sk , S l , Sm , Sn , So , Sp ,
Sq , S r , Ss , S t ) 等 17个 S 2RN ases基因 ( Zisovich et al. , 2004; Takasaki et al. , 2006; Mota et al. ,
2007)。我国学者利用 PCR2RFLP检测技术和核苷酸序列分析等 , 分别鉴定出一些我国育成的梨品种
的 S基因型及新的 S 2RN ase基因 (谭晓风 等 , 2005; 张妤艳 等 , 2006) , 并鉴定出 S11 2～S39 2RN ases
等 29个 S 2RN ases基因。
我国是梨属植物的发祥地 , 资源丰富 , 品种繁多。迄今为止 , 我国梨属植物中仍有大量古老的地
方品种 S基因型信息尚未得知。本研究利用 PCR技术对我国 9个种内的 20个地方品种或野生类型个
体梨种质资源的 S基因型进行鉴定 , 为研究梨属不同种间 S 2RN ase基因的进化、田间授粉树的配置和
新品种的选育等提供参考。
1　材料与方法
111　试验材料
供试梨品种及野生类型有新疆梨 ( Pyrus sink iangensis Yü) : ‘新疆黄梨 ’、‘奥连 ’、‘花长把 ’、
‘黄麻 ’、‘色尔克甫 ’、‘红那禾 ’; 秋子梨 ( P. ussuriensis Maxim. ) : ‘麦梨 ’、‘内蒙古山梨 ’、野生
山梨 ; 西洋梨 ( P. comm unis L. ) : ‘奎甜 ’、‘顺香 ’、‘昆切克 ’; 褐梨 ( P. phaeocarpa Rehd. ) : ‘吊
蛋’、野生褐梨 ; 木梨 ( P. xeroph ila Yü) : ‘沙疙瘩 ’; 杜梨 ( P. betu laefolia Bge) : 野生灵武杜梨 ;
杏叶梨 ( P. a rm en iacaefolia Yü) ; 白梨 ( P. bretschneideri Rehd. ) :‘茌梨 ’; 砂梨 [ P. pyrifolia (Burm;
Nakai) ]: ‘满天红 ’; ‘兴城 2223’。
2006年春季从中国农业科学院兴城果树研究所梨品种资源圃采集各品种幼嫩叶片 , 保存于液氮
中备用。
112　试验方法
利用改良的 CTAB法 (张妤艳 等 , 2006) 提取各品种及各野生类型个体基因组 DNA。80 V电压
下 , 取 2μL基因组 DNA在 018%琼脂糖凝胶上电泳 , 紫外检测 DNA的纯度和完整性 , 并于 - 20 ℃
保存备用。
利用正向引物 ( 5′2TTTAC GCAGC AATAT CAG23′) 和反向引物 ( 5′2ACA /G TT CGGCC AAATA
ATT23′) ( Ishim izu et al. , 1999) 进行 PCR扩增。PCR反应所用 TaqDNA聚合酶购自宝生物工程 (大
连 ) 有限公司。PCR反应程序和体系参考 Ishim izu等 ( 1999) 的方法 , 应用 PTC2200 (B IO2RAD )
扩增仪进行扩增。
取 PCR产物 5μL, 112%琼脂糖凝胶电泳检测扩增图谱。
将含有 S 2RN ase基因目的片段的 PCR扩增产物克隆到 pGEM 2T载体 ( Promega, USA ) , 其核苷酸
序列由上海英骏公司测定。测序结果利用 BLASTN与 GenBank中已知 S 2RN ase基因序列比较 , 进而确
定其 S基因型。
2　结果与分析
211　S基因型鉴定
利用引物对各个梨品种和野生类型个体的基因组 DNA进行 PCR扩增 , 其 PCR产物片段大小在
300～1 000 bp之间 (图 1)。
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　3期 衡 　伟等 : 梨 20个品种 S基因型的鉴定及新 S 2RN ases基因的克隆 　
PCR扩增产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离 , 除 ‘红那禾 ’含有 3个条带之外 , 其它均含
有 2个条带。通过对各个条带的核苷酸序列分析 , 与 GenBank中已知 S 2RN ase基因的核苷酸序列进行
比较 , 结果表明 : 在 19个不同 S 2RN ase基因核苷酸序列中 , 17个为已知的 S 2RN ase基因。根据各个
品种和野生类型个体包含的已知 S 2RN ase基因确定其 S 基因型 : ‘新疆黄梨 ’和 ‘色尔克甫 ’为
S22 S28 , ‘奎甜 ’、‘吊蛋 ’和 ‘顺香 ’均为 Sd Se ; ‘花长把 ’、‘昆切克 ’、‘茌梨 ’和野生褐梨个体含
有一个相同的 S19 2RN ase基因 , 分别为 S19 S22、S19 S28、S1 S19和 S19 S29 ; ‘沙疙瘩 ’、‘满天红 ’和野生灵
武杜梨个体含有相同的 S36 2RN ase基因 , 分别为 S36 Sd、S4 S36和 S27 S36 ; ‘奥连 ’S基因型为 Sp S32 , ‘兴
城 2223’为 S1 S8 , 杏叶梨类型个体为 S22 Sc , 野生山梨个体为 S13 S34。
图 1　S2RN ase基因特异性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
M: Marker; 1. ‘新疆黄梨’; 2. ‘奥连’; 3. ‘花长把’; 4. ‘黄麻’; 5. ‘色尔克甫’; 6. ‘红那禾’; 7. ‘麦梨’;
8. ‘内蒙古山梨’; 9. 山梨 ; 10. ‘奎甜’; 11. ‘顺香’; 12. ‘昆切克’; 13. ‘吊蛋’;
14. 褐梨 ; 15. ‘沙疙瘩’; 16. 灵武杜梨 ; 17. 杏叶梨 ; 18. ‘满天红’;
19. ‘茌梨’; 20. ‘兴城 2223’。
F ig. 1　The PAGE pa ttern s of the S 2RN ase gene products am plif ied spec if ica lly
M: Marker; 1. ‘Xinjiang Huangli’; 2. ‘Aolian’; 3. ‘Huachangba’; 4. ‘Huangma’; 5. ‘Seerkefu’; 6. ‘Hongnahe’; 7. ‘Maili’;
8. ‘Neimenggu Shanli’; 9. Shanli; 10. ‘Kuitian’; 11. ‘Shunxiang’; 12. ‘Kunqieke’; 13. ‘D iaodan’;
14. Heli; 15. ‘Shageda’; 16. L ingwu Duli; 17. Xingyeli; 18. ‘Mantianhong’;
19. ‘Chili’; 20. ‘Xingcheng 2223’.
进行核苷酸序列分析时 , ‘麦梨 ’中一个 S 2RN ase基因与 GenBank中苹果属 S11 2RN ase基因的核苷
酸序列同源性为 9519% , 与梨属中 S5 2RN ase基因核苷酸序列同源性为 9510% ; ‘内蒙古山梨 ’中一
个 S 2RN ase基因与苹果属中 S19 2RN ase的同源性为 8515% , 与梨属中 S6 2RN ase基因核苷酸序列同源性
为 8412% ; ‘麦梨 ’和 ‘内蒙古山梨 ’两个 S基因之间的同源性为 6111% , 表现出高度的多态性 ,
证明它们均为新的 S 2RN ase基因 , 命名为 S40 2、S41 2RN ase基因 , 并在 GenBank中登录 , 登录号为
DQ903313和 DQ988687。
因此 , 确定了 ‘内蒙古山梨 ’的 S基因型为 S29 S41 ,‘麦梨 ’和黄麻 ’为 S31 S40 , 多倍体品种 ‘红
那禾 ’为 S22 S28 S40 (表 1)。
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
表 1　梨 S基因型、PCR片段长度、内含子大小及其种名
Table 1　The S2genotypes, PCR fragm en t size and spec ies of pear
种名
Species
品种或野生类型个体
Cultivars or wild
species individuals
S基因型
S2genotypes PCR片段大小 / bpThe PCRfragment sizes 内含子大小 / bpThe sizesof intron
新疆梨 P. sinkiangensis Yü 新疆黄梨 Xinjiang Huangli S22 S28 345 /427 148 /227
奥连 Aolian SpS32 338 /349 138 /134
花长把 Huachangba S19 S22 465 /345 251 /148
黄麻 Huangma S31 S40 345 /373 145 /176
色尔克甫 Seerkefu S22 S28 345 /427 148 /227
红那禾 Hongnahe S22 S28 S40 345 /427 /373 148 /227 /176
秋子梨 P. ussuriensis Maxim. 麦梨 Maili S31 S40 345 /373 145 /176
内蒙古山梨 Neimenggu Shanli S29 S41 347 /333 147 /133
山梨 Shanli S13 S34 350 /341 150 /141
西洋梨 P. comm unis L. 奎甜 Kuitian Sd S e 369 /998 169 /786
顺香 Shunxiang Sd S e 369 /998 169 /786
昆切克 Kunqieke S19 S28 465 /427 251 /227
褐梨 P. phaeocarpa Rehd. 吊蛋 D iaodan Sd S e 369 /998 169 /786
褐梨 Heli S19 S29 465 /347 251 /147
木梨 P. xerophila Yü 沙疙瘩 Shageda S36 Sd 536 /369 342 /169
杜梨 P. betulaefolia Bge 灵武杜梨 L ingwu Duli S27 S36 352 /536 152 /342
杏叶梨 P. arm eniacaefolia Yü 杏叶梨 Xingyeli S22 S c 345 /334 148 /134
白梨 P. bretschneideri Rehd 茌梨 Chili S1 S19 367 /465 167 /251
砂梨 P. pyrifolia (Burm; Nakai) 满天红 Mantianhong S4 S36 368 /536 168 /342
未知 Unknown 兴城 2223 Xingcheng 2223 S1 S8 367 /434 167 /234
212　新 S 2RN ase基因的鉴定及核苷酸序列比较
S40 2、S41 2RN ase基因的核苷酸序列分析的结果表明 : 在核苷酸序列高变区 (HV ) 存在一个内含
子 , 通过内含子 ‘GT/AG’剪接法则 , 推算出 S40 2、S41 2RN ase基因的内含子大小分别为 176、133
bp, 外显子分别为 197、200 bp, 推导的氨基酸分别为 65、66个残基 (图 2)。S40 2、S41 2RN ase基因的
内含子序列之间的同源性为 4215% , 外显子序列之间同源性为 7713% , 推导氨基酸序列之间同源性
为 6211%。
图 2　S40 2与 S41 2RN ase基因的核苷酸序列比较
F ig. 2　Com par ison of D NA sequences of S40 2and S41 2RN ase genes
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　3期 衡 　伟等 : 梨 20个品种 S基因型的鉴定及新 S 2RN ases基因的克隆 　
3　讨论
本研究鉴定出梨属植物 9个种的 20个品种或野生类型个体的 S基因型 , 包含了 GenBank中 17个
已知的 S 2RN ases基因和 2个新 S 2RN ases基因。迄今为止 , 已经明确的梨属植物 S 2RN ase基因 , 西洋梨
中有 Sa 2、Sb 2、Sc 2、Sd 2、Se 2/S j 2、Sh 2、S i 2、Sk 2、S l 2、Sm 2、Sn 2、So 2、Sp 2、Sq 2、S r 2、Ss 2、S t 2等 17个以英文
字母表示以及本文在中国栽培的西洋梨品种中鉴定的 2个以数字表示的 S19 2、S28 2等 S 2RN ases基因
( Zisovich et al. , 2004; Takasaki et al. , 2006; Mota et al. , 2007 ) ; 秋子梨中有 S13 2、 S29 2、 S31 2、
S34 2、S40 2、S41 2等 S 2RN ases基因 ; 新疆梨中有 S19 2、S22 2、S28 2、S31 2、S32 2、S40 2、Sp 2等 S 2RN ases基因 ;
木梨中有 S36 2RN ase、Sd 2RN ase; 褐梨中有 S19 2、S29 2、Sd 2、Se 2等 S 2RN ases基因 ; 杏叶梨有 S22 2RN ase、
Sc 2RN ase基因。一些 S 2RN ases基因同时存在于中国古老的品种或野生类型个体和西洋梨品种中 , 为
S 2RN ase基因分化是在东方梨种群和西方梨种群的各个种形成之前提供了证据。Teng等 ( 2002) 和
Bao等 (2007) 分别利用 AFLP和 SSR等分子标记对东方梨种群和西方梨种群进行了分类和系统关系
研究 , 并基于这些研究结果构建了梨属植物的系统关系树 , 其中东方梨种群和西方梨种群是截然分开
的 (鲍露 等 , 2006)。本研究中梨属的不同种内可以出现多个相同的 S 2RN ase基因 , 说明 S 2RN ase基
因与梨属各个种的演化以各自独立的系统进行。
为了更好的理解梨属与苹果属中 S 2RN ase基因的亲缘关系 , 我们用 B ioEdit软件比较分析了梨属
S40 2、S41 2两个新 S 2RN ases基因与已知梨属 S1 2～S10 2RN ase基因和苹果属 S3 2、S4 2、S6 2、S10 2、S11 2、
S21 2、S26 2、S29 2、S31 2、S32 2RN ase等 10个 S 2RN ases基因部分氨基酸序列。结果表明 : 梨属和苹果属氨
基酸序列包含 3个保守区域 (C1、C2、C3) 和 1个高度变化区域 (HV )。所有的 S 2RN ase都包含日
本梨 S 2RN ase特有的 3个半胱氨酸 (C) ( Ishim izu et al. , 1996a) 和 1个 RN ase活性所必需的组氨酸
(H) 残基 ( Kawata et al. , 1990)。S40 2、S41 2RN ase基因与梨属其它已知 S 2RN ases基因比较表现出高
度多态性 : S40 2RN ase基因和已知 S 2RN ase基因的同源性为 6016% (S9 2RN ase) ～9515% ( S5 2RN ase) ;
S41 2RN ase基因和已知 S 2RN ase基因的同源性为 6019% (S21 2RN ase) ～9410% (S1 2RN ase)。梨属 12个
S 2RN ases基因与苹果属 10个 S 2RN ase基因同源性为 5317% ～100% , 其中梨属 S40 2、S9 2、S41 2RN ase分
别与苹果属 S11 2、S3 2、S6 2RN ase的同源性为 100%、9617%和 9414%。因此可以说明 , 梨属与苹果属
S 2RN ase基因存在较近的亲缘关系 , S 2RN ase基因的分化可能在梨属、苹果属形成以前。苹果属
S 2RN ase基因包含日本梨特有的 3个保守的半胱氨酸残基也支持了这一观点 ( Ishim izu et al. , 1996)。
S12 2RN ase登录号为 AY249427, 是 2003年 3月在中国梨品种 ‘懋功梨 ’中发现的新 S 2RN ase基
因 , 在 GenBank中登录的片段大小为 401 bp。由于其核苷酸序列有误 , 不能正常翻译成氨基酸。张
妤艳等 2006年 3月在梨品种 ‘火把 ’中鉴定出一个新 S 2RN ase基因并按照 GenBank中梨属 S 2RN ase
基因顺序登录为 S36 2RN ase (DQ417607) , 其片段大小为 537 bp。本研究供试品种之一的 ‘满天红 ’
是 ‘幸水 ’ (S4 S5 ) 与 ‘火把 ’ (Sx S36 ) 的杂交后代 , 基于核苷酸序列分析 , ‘满天红 ’品种中一个
S 2RN ase基因与 S36 2RN ase核苷酸序列完全一致 , 因此确定为 S36 2RN ase基因。随后 2006年 7月最初登
录 S12 2RN ase (AY249427) 基因的作者对 S12 2RN ase基因进行了更新修改 , 片段大小为 535 bp, 登录号
不变 , 但与 S36 2RN ase基因还存在 9 bp的差异。2007年 9月 , S12 2RN ase基因 (AY249427) 被再次更
新修改 , 片段大小为 1 030 bp, 登录号为 EU117115, 与 2006年 3月登录的 S36 2RN ase基因相对应的
537 bp核苷酸序列完全相同 , 应该为同一 S 2RN ase基因 , 所以梨品种 ‘满天红 ’的 S基因型为 S4 S36
或 S4 S12。
References
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