全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(8)：1199—1204
Acta H0nic-ulturae Sinica
海南椰子栽培品种的 SSR标记分析
柳晓磊 ，汤 华 ，李东栋 ，王 茜 ，林艳青 ，周 蓉
( 海南大学农学院生物技术系，海 口570228； 海南大学理工学院生物工程系， 海口570228)
摘 要：应用简单重复序列 (SSR)标记方法，对海南的 11个椰子 (Cocos n~cifera L．)栽培品种进行
了遗传多样性分析。选取30对引物用于PCR扩增 ，有 23对引物扩增出有效多态性片段 136条，平均多态
性百分率为95．77％，每对引物扩增出的带数 2—12条不等，平均为 6．17条，每个 SSR位点的多态信息量
(PIC)在0．173～0．896之间，平均为0．561。11份材料之间遗传相似系数变化范围0．061—0．861，说明海
南椰子栽培品种之间存在丰富的遗传多样性。UPGMA聚类分析结果表明，1 1个椰子栽培品种分为 4个类
群和两个亚群。SSR标记反映出的品种问亲缘关系与形态学研究的分类结果并不完全吻合。
关键词：椰子；SSR；遗传多样性
中图分类号：S 667．4 文献标识码：A 文章编号：0513-353X(2008)08一l199-06
Genetic Diversity of Coconut Cultivars from Hainan Province Based on SSR
M olecular M arkers
LIU Xiao—lei ，TANG Hua ，LI Dong—dong ，WANG Qian ，LIN Yan—qing ，and ZHOU Rong
(’Department ofBiotechnology，Colege ofAgriculture，Hainan University，Haikou 570228，China； Department ofBioengineer-
ing ，Hainan University，Haikou 570228，China)
Abstract：Genetic diversity and relationship among 1 1 coconut(Cocos nucifera L．)cultivars from Hai—
nan Province were analyzed based on the data of SSR．Among 30 SSR primer pairs，23 primer pairs amplifed
polymorphic fragments．A total of 136 polymorphic segments were produced，with the average polymorphic
bands per SSR primer pair being 6．17 and ranging from 2 to 12．Polymorphic index content(PIC)values var—
ied from 0．173 to 0．896 with an average of 0．561．The genetic similarity coefficients among 1 1 coconut cuhi—
vars ranged from 0．06 1 to 0．86 1．It indicated that there was sufficient genetic diversity among these coconut
cultivars．Cluster analysis was made with unweighted pair group method for arithmetic averages(UPGMA)
using genetic similarity coeficients．Eleven materials were clustered into 4 groups and 2 sub—groups．The den—
erogram revealed that traditional morphological classification system could not completely reflect the genetic re—
lationship among coconut cuhivars native to Hainan．
Key words：coconut；Cocos n ra L．；SSR；genetic diversity
椰子 (Cocos n~cifera L．)为棕榈科椰子属单子叶植物，主要分布在赤道附近北纬20。到南纬20。、
海拔 1 000 m以下的区域范围内。目前研究者主要通过椰子叶片特征、生长地域、果实大小和形状等
将世界范围内的椰子品种分为高种和矮种两种主要类型 (Lebrun et a1．，1998)，矮种椰子类型遗传性
状相对较稳定，而高种类型具有种群的多型性，其不同品种主要来 自异花授粉、品种之间的杂交、实
生选种和自然演化。
我国海南地区种植椰子已有 2000多年的栽培历史，主要分布在文昌、琼海、万宁、陵水、三亚
收稿日期：2008—04—24；修回日期：2008—07—03
基金项目：国家自然科学基金项 目 (30560092)；海南省自然科学基金资助项 目 (80406)；海南省教育厅高校科研资助项 目
(Hjkj200510)
}通讯作者 Author for co~espondence(E-mail：liddfym@hotmail．com)
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园 艺 学 报 35卷
等地区，种植面积约有4．83万 hm ，占我国椰子种植面积的99％ (高和琼 等，2007)。该地区的椰
子栽培品种包括从国外引进的马来红矮、马来绿矮、马来黄矮、马哇、香水椰子和我国惟一鉴定品种
文椰78F1，还有本地黄高、本地红高、本地绿高3个主要栽培类型，但 目前由于缺乏对海南本地高
种椰子资源遗传多样性、遗传背景及其育种价值方面的研究结果，影响了该地区椰子资源的收集评价
和品种选育工作。
在以往对椰子种质资源的收集和评价中，普遍使用了基于农学和形态学分类的考察标准 (易小
平 等，2004)。这些分类标准目前看来已经是一个极耗时、低效的评价方式，只能提供简单的品种特
征 (Daniel et a1．，2005)。在众多的分子标记手段中，SSR (微卫星标记)以其高稳定性、高多态性、
共显性、标记带型简单以及覆盖整个基因组等特点被国际椰子种质资源网 (Coconut Genetic Resources
Network，COGENT)定为在椰子种群遗传多样性分析中首选的分子标记方法，已被广泛应用于全球不
同椰子分布区域 (包括东南亚、非洲和太平洋地区等)之间种群遗传多样性分析和评价 (Teulat et
a1．，2000；Perera et a1．，2000，2003；Meerow et a1．，2003)。本研究利用 SSR分子标记对海南岛11个
椰子栽培品种进行分析，旨在了解海南岛椰子的遗传多样性分布规律，为该地区椰子种质资源的保存
和利用提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 试验材料
本试验中所用的海南省 11个主要椰子栽培品种 (图2)的健康植株嫩叶，分别采自中国热带农
业科学院椰子研究所和兴隆植物园。其中 L1～L9为已鉴定单株，L10和 L11为不同产区种植园中随
机选择的本地高种单株。
1．2 DNA的提取
基因组 DNA的提取采用改良CTAB法 (郑育声 等，2007)，提取的DNA质量和浓度采用0．8％
琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定。样品稀释到所需浓度40 ng· L～，置 一20℃保存。
1．3 SSR标记引物及 PCR扩增
所用 SSR引物是分别从Teulat等 (2000)和Meerow等 (2003)开发的椰子 SSR系列引物中选出
的被证明多态性好、分辨率高的引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 (表 1)。PCR扩
增在 BIO—RAD MyCycler thermal cycler PCR仪上进行，反应体系及扩增程序按照柳晓磊等 (2007)
建立的椰子SSR反应体系进行。
表 1 SSR·PCR引物及其序列
Table 1 SSR·PCR primers and sequence information
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8期 柳晓磊等：海南椰子栽培品种的SSR标记分析 1201
CACll
CACl3
CAC20
CAC2l
CAC23
CAC39
CAC52
CAC56
CAC65
CAC68
CAC7l
CAC72
CAC84
CNllAl0
CNllEl0
CNllE6
CNlC6
CNlG4
CNl}I2
CN2A4
CN2A5
CNZOl
CNZO2
CNZ03
(CA) (TA) 5 GATCTl"CGGCG1TrCCTCA3
5 TCTCCTCAACAATCTGAAGC3
(CA)9(TA)5A (TA)4(CA)6 5 GGGT1TrrrAGATCTTCGGC3
5 CTCAACAATCTGAAGCATCG3
(CA)Iq 5 CTCATGAACCAAACG1TrATA3
5 CATCATATACATACATGCAACA3
(CA)I I 5 AATTGTGTGACACGTAGCC3
5 GCATAACTCTrTCATAAGGGA3
(CA)R 5 TGAAAACAAAAGATAGATGTCAG3
5 GAAGATGCTI ATATGGAAC3
(CA)15 5 AATrGAGATAAGCAGATCAGT3
5 GTCGGTC1TITA ITrCAGAAGG3
(CA)19 5 TTAT几-rCTCCAC ITrC1’GTGG3
5 ATATTACCCATGCACAGTACG3
(CA)14 5 ATTCTIrI GGCTrAAAACATG3
5 TGATIrI ACAGTrACAAGTrrGG3
(CA)15 5 GAAAAGGATGTAATAAGCTGG3
5 1TITGTCCCCAAATATAGGTAG3
(CA)I 5 AATrATIrI CTTGTrACATGCATC3
5 AACAGCCTCTAGCAATCATAG3
(CA)17 5 ATAGCTCAAGTTGTrGCTAGG3
5 ATATrGTCATGATrGAGCCTC3
(CA)lR 5 TCACATTATCAAATAAGTCTCACA3
5 GCTCTC 兀TrCTCATGCACA3
(CA)l1 5 TTGGTT1 rGTATGGAACTC13
5 AAATGCTAACATCTCAACAGC3
(CT) 0 5’G1TIGGAGA1’ITrAArn1rCTrG3’
5 CCCAATAATATrrrATAACAG3
(GT)22(GA)14 5 AGAGAGAGTAAATGGGTAAGT3
5 CCC1TrCA|r兀TTCCTTATTC3
(CT)21 5 TACTTAGGCAACGTICCATrC3
5 TAACCAGAAAGCAAAAAGAm
(CT)．Tl"(GT) 5 AGTATG rGAGTAGGATIATGG3
5 TTCC ITrGGACCC ITrATC rC 兀．3
(CT)． 5 GTCGTCCTATACTCATCATCA3
5 GATGCGTATGAGATGTGAGAG3
(GA)lR 5 TTGATAGGAGAGCTTcATAAC3
5 ATCTTC 兀TrAATGCTCGGAG113
(CT)15Tl"(CT) 5’CAGGATGGTTcAAGcCCTTAA3
5 GGTGGAAGAGGGAGAGATrGA3
(CT)12TI"(CT) 5 AAGGTGAAA rCTATGAACACA3
5 GGCAGTAACACATrACACATG3
(CT)15 (CA)o 5 A1’GA1’GATC11C1 GTTAGGC13
5 AAATGAGGG1 ITGGAAGGAm
(GA)． 5 CTCTl"CCCATCATATACCAGC3
5 ACTGGGGGGATCTrATCTCTG3
(GA) 5 CATCTrTCATCA1TITAGCTC13
5 AAACCAAAAGCAAGGAGAAG113
144～147 Meerow et a1．，2003
151～153 Meerow et a1．，2003
124～133 Meerow et a1．，2003
149～151 Meerow et a1．，2003
t70～179
142 ～l66
142～l60
Meerow et a1．，2003
Meerow et a1．，2003
Meerow et a1．，2003
138—162 Meerow et a1．．2003
150～173 Meerow et a1．，2003
130～146 Meerow et a1．，2003
172～283 Meerow et a1．，2003
124～132 Meerow et a1．，2003
150 ～163 Teulat et a1．，2000
8l～119 Teulat et a1．．2000
99～151 Teulat et a1．．2000
85～128 Teulat et a1．．2000
175～184 Teulat et a1．，2000
112～132 Teulat et a1．，2000
230～321 Teu]at et a1．，2000
87～111 Teu]at et a1．．2000
88～121 Teulat et a1．．2000
109～131 Teu|at et a1．，2000
143～161 Teulat et a1．，2000
9l～97 Teulat et a1．．2000
1．4 凝胶电泳及数据分析
PCR扩增产物经6％聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Sambrook et a1．，1998)，GoldView 核酸染料 (EB替
代物)染色，照相。将重复性好且清晰的条带进行记录，在相同位置有带记为 l，无带记为0，构建
所有引物扩增结果数据库 (0，l矩阵)。每一个 SSR位点的多态性信息量 (PIC)按公式 PIC=l一
∑Pi 计算，其中P 表示 i位点的基因频率。然后根据 Nei和 IJi的方法 (1979)计算 Dice相似系数，
建立相似系数矩阵，采用 NTSYS—pc 2．1程序，以非加权数据分析法 (UPGMA)生成系统树。
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2 结果 与分析
2． 1 引物筛选及 多态性分 析
利用选 用 的 30 对 S S R 引物对 1 1 个椰子 品种进行 P C R 扩增 ， 有 23 对 引物扩增 出清晰稳定 的条带
(图 1 )， 其余 7 对 引物在某些供试材料 中不 能有效启动基 因组 D N A 或扩增 质量差 ， 无 法进行统计分
析 。 23 对引物 对 1 1 份 材 料 共 扩 增 出 14 2 条 带 ， 其 中 136 条 具 有 多 态 性 ， 平 均 多 态 性 百 分 率 为
95 ． 77％ 。 不 同引物扩增 的带数差异较大 ， 从 2 条到 12 条 不 等 ， 平均 为 6． 17 条 。 每个 S S R 位点 的多
态信息量 (P IC ) 在 0． 173 ～ 0． 896 之 间 ， 平均 为 0． 561 (表 2 )。 说 明所 用 微卫 星标记 在椰子 遗传资
源 中具有较高的多态性 ， 适 合对其遗传多样性结构和水平进行检测 。
图 1 引物 C A C 02 和 C A C 71 分别对 1 1 个椰子 品种扩增 电泳图
111 ～ L 1 1 ： 不 同椰 子材 料 ； M ： D N A m arker。
F ig． 1 A m plification ofprhn er C A C 02 and C A C T l in 1 1 coconutcultivars
L 1 一 L 1 1 ： D ifferen t kinds ofcoc on u t (C ocos n ltf。lyem L ) varieties ： M ： D N A m arker
表 2 S S R 扩增 结 果统计
T able 2 T he statistic ofS S R am plifica tion result
250 bp
100 bp
?
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8期 柳晓磊等 ：海南椰子栽培品种的 SSR标记分析
2．2 聚类分析
根据23对引物扩增数据，以Dice相似系数采用 UPGMA法进行聚类得到不同椰子品种之间的系
统进化关系树 (图2)。在所有的供试材料中相似系数最大的是文椰 78F1(L5)和吗哇 (L6)，为
0．861；相似系数最小的是源于文昌地区的本地红高 (L8)和兴隆地区的本地红高 (L11)，为
0．061，二者虽名称相同但进化关系较远。同时，以0．400为阈值可将这 11份供试材料分为 4大类
群，第 1类群为马来红矮 (L1)，第 2类群包括马来黄矮 (L2)、本地绿高 (L3)、马来绿矮 (IA)、
文椰78F1(L5)、吗哇 (L6)、本地黄高 (L7)、香水椰子 (L9)和本地绿高 (L10)，第3类群为源
于文昌地区的本地红高 (L8)，第4类群为源于兴隆地区的本地红高 (LI1)。
在第2类群中，以0．500水平值又可以分为两个亚群，第 1亚群包括马来黄矮 (L2)、本地绿高
(L3)、马来绿矮 (IA)、文椰78F1(L5)、吗哇 (L6)和香水椰子 (L9)，其中文椰 78F1(L5)与
吗哇 (I／5)的材料来源最相似，相似系数最大；第 2亚群包括本地黄高 (L7)和本地绿高 (L10)。
从结果来看，红色类型椰子与其它颜色类型椰子之间的进化关系较远，很难与其他椰子品种 (类型)
聚为一类
3 讨论
L1 马来红矮 Malayan Red Dwarf
L2 马来黄矮 Malayan Yelow Dwarf
L3本地绿高 Bendi Ltigao
L5 文椰 78F1 WY78F1
L6 吗哇 MaWa
L9 香水椰子 Aromatic Green Dwarf
L4 马来绿矮 MalayanGreenOvcarf
L7本地黄高 Bendi Huanggao
L10本地绿高 Bendi Lfigao
L8本地红高(文昌)Bendi Honggao(Wenchang)
L11本地红高(兴隆)Bendi Honggao(Xinglong、
0l70 0 378 0．585 0 792 l 000
遗传相似系数
Genetic similar OOCmcient
图2 采用 UPGMA方法生成的 l1个椰子品种的系统关系树
Fig．2 The phylogenetic tree of 11 coconut cultivars based on UPGMA cluster analysis
从本试验的SSR扩增结果来看，1l份供试材料表现出丰富的多态性，部分供试材料间存在着较
大的遗传差异，这与 Meerow等 (2003)采用 SSR标记研究佛罗里达州椰子的结果相类似。
一 些研究表明，应用分子系统学研究植物分类与应用形态学进行分类的结果并不完全吻合 (盛
红梅 等，2005；何桥 等，2006；何天明 等，2006)，在本研究中也得到了进一步的证实。第 1亚群
中包括了两种椰子栽培类型 (高种和矮种)，马来黄矮 (L2)、本地绿高 (L3)和马来绿矮 (IA)在
形态上差异较大，却分别聚在了一起，可能是它们本身在遗传上存在某种程度的联系，但长期的自然
和人为选择使其在形态特征和生态类型方面产生了变异，从而根据这些形态特征被划分到不同的类群
中；源于文昌的已鉴定单株本地红高 (L8)和兴隆地区种植园中随机选择的单株本地红高 (L11)虽
然在形态学分类上相同，但两者相似系数极小，亲缘关系甚远；另外马来红矮 (L1)、马来黄矮
(L2)、马来绿矮 (IA)聚在两个类群之中，这可能是与不同的分类水平有关。大量的比较研究表明，
形态进化和分子进化是各自独立的，遵循不同的进化规律，因此以形态特征为依据的分类系统与以
DNA水平为依据的分类结果就不完全吻合 (周永红 等，1999)。
另外，产于法国的马哇 (It5)与中国的文椰78F1(L5)相似系数最大，聚为一类群，这可能是
因为两者的母本同为马来矮种，马哇为西非高种与马来矮种的杂交后代，文椰78F1为海南高种与马
来矮种的杂交后代 (高和琼 等，2007)。目前对海南椰子遗传多样性和亲缘关系的研究才刚刚开始，
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进一步的研究结论则需要对来源更广泛的材料进行系统分析后得出。
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