全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (11) : 1689 - 1694
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 06 - 12; 修回日期 : 2008 - 08 - 14
基金项目 : 河南省教育厅高校青年骨干教师资助项目 (200733529) ; 河南大学校内基金重点项目 (06ZDZR011)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wzc@henu1edu1cn)
菊花组织培养继代过程中的 DNA甲基化变化
聂丽娟 , 王子成 3 , 何艳霞
(河南大学农业生物技术研究所 , 河南开封 475001)
摘 　要 : 采用 MSAP (甲基敏感扩增多态性 ) 方法对菊花 (D endranthem a ×grand if lorum ) 组织培养继
代过程中的 DNA甲基化情况进行了分析。结果发现 , 3个单芽系的组培苗较田间材料均有 DNA甲基化增
加和减少现象 , 采用 7对引物 , 共扩增出 929条带 , 各单芽系 DNA甲基化变异率分别为 81929%、81902%
和 81986%。继代材料较母体均有甲基化变异发生 , 且变异类型中 DNA甲基化减少的比例高于甲基化增加
的比例 , 随着继代次数的增加 , 两种变异间的差异逐渐减小 , 比例相近。同时在同一单芽系内的不同次继
代个体间有 DNA甲基化变化现象 , 对 5次继代的 180个个体研究发现 , 带型变化中 18138%的带型不一致 ,
2199%为一个或两个个体发生了变化 , 仅有 1172%在发生变化后趋于稳定 , 另外 10168%的带型呈现不稳
定的随机变化。
关键词 : 菊花 ; 继代培养 ; MSAP方法 ; DNA甲基化变化 ; 变异率
中图分类号 : S 68211 + 1　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1121689206
The Var ia tion of D NA M ethyla tion Var ia tion D ur ing Successive Tran sfer
Culture of Chrysan them um ( D endran them a ×grandi f loru m )
N I E L i2juan, WANG Zi2cheng3 , and HE Yan2xia
( The Institu te of A griculture B iotechnology, Henan U niversity, Kaifeng, Henan 475001, Ch ina)
Abstract: This study analysised the DNA methylation statistic during the successive transfer culture of
chrysanthemum (D end ran them a ×grand if lorum ) by MSAP (methylation sensitive amp lified polymorphism )
technique. The results indicated that three single shoot system of the tissue culture seedling had distinct DNA
hypermethylation and hypomethylation variety compared to the field materials. N ine hundred and twenty2nine
fragments were amp lified using 7 pairs of selective p rimers, and the mutation rates were 81929% , 81902%
and 81986% , respectively. A ll the successive transfer materials had DNA methylation variety compared to the
parent materials. During the variation, hypomethylation were more than hypermethylation. A long with the suc2
cessive transfer culture, the diversity between the two variety pattern was smaller, and the p roportion was
almost sim ilar. Meanwhile, the different individual of each single shoot system also existed DNA variation
phenomenon. Among the 180 individuals of quintic successive transfer culture, 18138% bands pattern was not
identical during the variational bands pattern, 2199% was one or two individual variation, 1172% bands
pattern was stabilization after variety, while 10168% showed unstable stochastic variety.
Key words: chrysanthemum; successive transfer culture; MSAP technique; DNA methylation variation;
mutation rate
菊花 (D endran them a ×grand if lorum ) 的繁殖主要靠扦插 , 但扦插需较多的母株材料 , 受季节和外
界环境条件的限制 , 繁殖速度较慢。
植物组织培养技术既可以进行优良品种的快速繁殖 , 又可以进行品种的脱毒、复壮、种质保存等
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研究 , 现已广泛应用于菊花的栽培和育种 (Antequera et al. , 1990; Lund et al. , 1995; Ronemus et
al. , 1996; Ramchandani et al. , 1999 )。但有研究表明组织培养过程中会发生体细胞无性系变异
(Duncan, 1997; Kaepp ler et al. , 2000) , 而组织培养中诱发的 DNA甲基化变化在一定程度上是体细
胞无性系变异的分子机制之一 ( Kaepp ler et al. , 2000)。植物组织培养过程中培养基中一些生长调节
因子 , 如 2, 42D, 奈乙酸等的应用均能使基因发生甲基化 (LoSchiavo et al. , 1989)。胡萝卜体细胞
胚胎发生过程中伴随着 DNA甲基化变化 (LoSchiavo et al. , 1989; Munksgaard et al. , 1995) , 在早期
分化阶段 DNA甲基化变化少于后期体细胞胚胎发生阶段。水稻、马铃薯、番茄等的再生植株均有
DNA甲基化变化发生 ( Kaepp ler & Phillip s, 1993; Harding, 1994; Smulders et al. , 1995)。
本研究以菊花品种 ‘墨麒麟 ’为材料 , 对组织培养继代过程中的 DNA甲基化变化情况进行研究
分析 , 从而在表观遗传方面为菊花组培过程中的体细胞无性系变异提供一定的理论基础。
1　材料与方法
111　材料
分别取 3株 ‘墨麒麟 ’菊花 (材料源于开封市禹王台公园 ) 营养生长阶段的茎段作为外植体 ,
于继代培养基上建立 3个独立的单芽系 , 分别编号为 a、b、 c。所用继代培养基为 MS + 62BA 2 mg·
L - 1 +NAA 011 mg·L - 1。
培养 30 d, 外植体茎段上长出丛生芽时将其进行第 1次继代 , 之后每 40 d继代 1次并连续继代 5
次。前 3代因群体较小 , 选所有个体进行分析 , 后两代则从各代中随机选取 20个个体进行分析。以
其中一个外植体 b为例 , 其流程示意图见图 1。
图 1　建立单芽系材料的示意图
F ig. 1　The sketch map of single shoot system
112　D NA的提取
在每次继代的同时 , 取所要继代个体的丛生芽叶片 , 放置于 - 70 ℃保存以备提取 DNA。DNA提
取采用 CTAB法 (陈昆松 等 , 2004; 肖军 等 , 2005) 并稍加改良。
113　D NA甲基化分析
采用 MSAP (甲基敏感扩增多态性 ) 方法分析所有材料基因组的甲基化情况 (何艳霞 等 ,
2007)。所用接头和引物序列见表 1。
试验将 MSAP方法的带型归结为 4类 : Ⅰ型带 ———HpaⅡ和 M spⅠ扩增产物中都有的带 , Ⅱ型带
———M spⅠ扩增产物中有而 HpaⅡ扩增产物中没有的带 , Ⅲ型带 ———HpaⅡ扩增产物中有而 M spⅠ扩增
产物中没有的带 , Ⅳ型带 ———HpaⅡ和 M spⅠ扩增产物中都没有的带。
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　11期 聂丽娟等 : 菊花组织培养继代过程中的 DNA甲基化变化 　
表 1　M SAP方法的接头和引物序列
Table 1　The adapter sequence and pr im er sequence of M SAP techn ique
接头和引物
Adap ter and p rimer
序列
Sequence (5′- 3′)
EcoRⅠ (接头 Adap ter) CTCGTAGACTGCGTACC　AATTGGTACGCAGTC
EcoRⅠ+ACG ( E01) GACTGCGTACCAATTCACG
EcoRⅠ+ACC ( E02) GACTGCGTACCAATTCACC
EcoRⅠ+AAC ( E03) GACTGCGTACCAATTCAAC
EcoRⅠ+ACT ( E04) GACTGCGTACCAATTCACT
EcoRⅠ+AGG ( E05) GACTGCGTACCAATTCAGG
HpaⅡ2M spⅠ (接头 Adap ter) CGAGCAGGACTCATGA　GATCATGAGTCCTGCT
HpaⅡ2M spⅠ+ TCCA ATCATGAGTCCTGCTCGGTCCA
HpaⅡ2M spⅠ+ TCAA ATCATGAGTCCTGCTCGGTCAA
114　D NA甲基化变异率计算
在两组内切酶消化产物的扩增条带中 , 有一些片段是不同材料共有的片段 (非变异片段 ) , 而有
些材料中发生了部分片段的增加或减少 , 称这些片段为变异片段。DNA甲基化的变异率 ( % ) =产生
变异的片段数 / (产生变异的片段数 +非变异的片段数 ) ×100。
2　结果与分析
211　田间材料与组培苗的甲基化情况比较
在继代 4次后 , 提取 3个单芽系连续继代材料以及未经组培的田间植株的叶片 DNA进行 MSAP
分析。结果表明 , 3个单芽系组织培养材料的一些带型与田间植株的带型不一致 , 继代个体中有新产
生的带也有消失的带。田间植株的 DNA甲基化类型在组织培养继代过程中均有所变化 , 在 7对引物
的 929条带中 , 3个单芽系的 DNA甲基化变异率分别为 81876%、81902%和 81986% (表 2)。
表 2　不同单芽系材料较未组培的田间材料间的带型变异情况
Table 2　Band pa ttern s var ia tiona l sta tus of d ifferen t single shoot system ma ter ia ls com pared to the ma ter ia ls in f ield
材料
Material
非变异带 Non2mutation band
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
变异带
Mutation band
变异率 /%
Mutation rate
a 89 147 72 30 81876
b 89 150 68 30 81902
c 93 149 72 31 81986
　　相比田间材料而言 , 继代个体中有一些条带
的带型发生变化。如表 3所示 : 用 E02 /TCCA引
物对时 , 田间材料的 Ⅰ型带在继代材料 a1a中消
失 , a1b中的带则由 Ⅰ型变为 Ⅱ型 ; 田间材料的 Ⅳ
型带变化为继代材料 a1b , a3a21和 a3b23的 Ⅱ型带 ,
即新增加了条带。这些变化类型在另外两个单芽
系材料 b和 c中也存在。上述带型变化情况反应
了组织培养过程中发生了甲基化增加 (Ⅰ型带 →
Ⅳ型带 , Ⅰ型带 →Ⅱ型带 ) 和甲基化减少 (Ⅲ型
带 →Ⅰ型带 ) , 其中一些变化在外植体长出的丛
生芽上已发生 (表 3)。
表 3　E02 /TCCA引物对扩增的带型情况
Table 3　Band pa ttern s sta tus by E02 / TCCA prim er com b ina tion
材料
Material
带型
The band pattern
a Ⅰ Ⅱ Ⅳ Ⅲ
a’ Ⅰ Ⅰ Ⅳ Ⅲ
a1a Ⅳ Ⅲ Ⅳ Ⅲ
a1b Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅲ
a2a21 Ⅰ Ⅰ Ⅳ Ⅰ
a2b22 Ⅰ Ⅰ Ⅳ Ⅲ
a3a21 Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅰ
a3b23 Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅲ
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　　在各个单芽系的非变异带中 , Ⅱ型带远远多于 Ⅰ型和 Ⅲ型。表 2所示单芽系 c的 314条非变异带
中 , 149条为 Ⅱ型带 , 占 47145%。这些材料均取自营养生长阶段 , Ⅱ型带数量较多 , 表明在营养生
长过程中基因组 DNA的 5′2CCGG23′位点多发生了内胞嘧啶的甲基化修饰 , 即 5′2CmCGG23′; 而半甲
基化 (Ⅲ型带 ) 和非甲基化 (Ⅰ型带 ) 分别只占到 22193%和 29162% (图 2)。
图 2　E01 /TCCA引物对单芽系 c的 M SAP带型图谱
1为田间材料 , 2为外植体上的丛生芽 , 3和 4, 5和 6, 7和 8分别为继代 2次、3次和 4次材料。
M和 H分别代表 EcoRⅠ /M spⅠ和 EcoRⅠ /HpaⅡ酶切产物。
F ig. 2　Am plif ied M SAP band pa ttern s of single shoot system c when the E01 /TCCA pr im er com b ina tion wa s used
1 was the material in field, 2 was the multip le bud in the exp lant, 3 and 4, 5 and 6, 7 and 8 were the materials of the second,
the third and the fourth successive transfer culture, respectively. M and H correspond to two sets of restriction
enzyme combinations, EcoRⅠ /M spⅠand EcoRⅠ /HpaⅡ, respectively.
212　不同继代次数之间的甲基化情况比较
21211　不同继代次数之间甲基化变化情况分析 　3个单芽系的 180个继代个体 , 较田间材料发生
DNA甲基化减少的情况多 , 占变异类型的 6617% (表 4)。综合同一株系各次继代的带型变异 , 子代
较其母代有更多的 DNA甲基化减少现象 , 且前 3次继代间的 DNA甲基化减少比例和 DNA甲基化增
加比例相差较大 , 随着继代次数的增多 , 基因组中这两种情况虽然发生位点有所不同 , 但出现的比例
基本相同 , 其中 DNA甲基化减少类型基本为 Ⅳ型 →Ⅲ型、Ⅱ型 →Ⅰ型 ; 甲基化增加则多为 Ⅰ型 →Ⅱ
型、Ⅰ型 →Ⅲ型 (表 4)。
表 4　同一株系各次继代间的 D NA甲基化变化情况
Table 4　The D NA m ethyla tion var ia tiona l in d ifferen t successive tran sfer culture of the sam e stra in
同一株系各次继代材料
The different successive transfer culture of the same strain
甲基化减少 Hypomethylation
比例 /%
Proportion
主要带型变化
The mainly variational
band pattern
甲基化增加 Hypermethylation
比例 /%
Proportion
主要带型变化
The mainly variational
band pattern
离体材料较田间材料 Materials in vitro compared to field p lanting 66170 Ⅳ→Ⅲ 33130 Ⅰ→Ⅱ
第 2次较第 1次 81125 Ⅲ→Ⅰ 18175 Ⅰ→Ⅲ
The second successive transfer culture compared to the first Ⅱ→Ⅰ
第 3次较第 2次 61190 Ⅲ→Ⅰ 38110 Ⅱ→Ⅳ
The third successive transfer culture compared to the second
第 4次较第 3次 50100 Ⅳ→Ⅲ 50100 Ⅰ→Ⅱ
The fourth successive transfer culture compared to the third Ⅳ→Ⅱ
第 5次较第 4次 53197 Ⅱ→Ⅰ 46103 Ⅰ→Ⅱ
The fifth successive transfer culture compared to the fourth Ⅰ→Ⅲ
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　11期 聂丽娟等 : 菊花组织培养继代过程中的 DNA甲基化变化 　
21212　不同继代次数之间甲基化变化的稳定性 　以单芽系 a为例 , 其 5次继代材料的 MSAP分析表
明 , 6对引物扩增的 234条带中 , 仅有 4条带在发生变化后趋于稳定 (如表 5所示 , 个体 a1a由 Ⅲ型带
变为 a1b的 Ⅰ型带 ) , 这种变异在以后的继代个体中稳定下来 , 能够稳定下来的带占 1172% ; 而另一
些带型变化趋势则不稳定 , 同一幼芽产生的丛生芽材料在之后的组织培养继代过程中个别个体也发生
DNA甲基化变化 , 产生不同的带型 : 2199%的 DNA甲基化变化为继代个体间一个或两个个体发生了
变化 (如表 5的 a4a24 )。所有继代个体中 18138%的带型不一致 , 除了一个或两个植株的带型变化外 ,
另有 10168%是多个个体 (3个以上 ) 均发生了带型变化 , 这便使得带型呈现不稳定的随机变化。在
这些变化的带型中 , Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型带间的相互转换没有一定的规律 , 这表明在组织培养过程中不
断的发生着 DNA甲基化增加或者减少的变化 (表 5)。但源于同一丛生芽的个体间带型一致 , 无明显
DNA甲基化差异 (如图 1中 b2a21 , b2a22和 b2a23间无差异 , b2b21 , b2b22和 b2b23间无差异 , 数据未列出 )。
表 5　E04 /TCAA引物对时不同样本间的条带变化情况
Table 5　The band pa ttern s var ia tiona l phenom enon in d ifferen t stylebook by the E04 /TCAA prim er com b ina tion
材料 Material 变异类型 Variant type
a Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅲ Ⅲ
a’ Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅲ Ⅲ
a1a Ⅲ Ⅲ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅲ Ⅲ
a1b Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a2a21 Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a2a22 Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a2b21 Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a2b22 Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a3a21 Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a3a22 Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅲ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a3a23 Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a3b21 Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a3b22 Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅱ
a3b23 Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a4a21 Ⅲ Ⅰ Ⅲ Ⅱ Ⅲ Ⅱ Ⅱ Ⅲ Ⅰ Ⅰ
a4a22 Ⅲ Ⅰ Ⅲ Ⅲ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a4a23 Ⅲ Ⅰ Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a4a24 Ⅲ Ⅰ Ⅲ Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅰ
a4b21 Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅲ
a4b22 Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a4b23 Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
a4b24 Ⅲ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ
　　注 : 空白处未出现条带 , 即Ⅳ。
Note: No band in blank. Ⅳ type.
3　讨论
对菊花品种 ‘墨麒麟 ’组织培养过程中的 DNA甲基化情况进行分析 , 发现组织培养材料相对田
间材料而言 , 有部分 DNA甲基化类型发生了变化 , 这与之前在苹果中的研究结果 (L i et al. , 2002)
相一致 , 但并没有发生表型性状变异。试验观测到的 DNA甲基化变异率约达到 9% , 并且高度不稳定 ,
所有单芽系继代材料中 , 部分个体与田间材料的带型不一致 (个体发生了甲基化变化 ) , 这可能是由于
外界的植株与培养室的组培苗在生长条件上有所差别所致 , 而这种 DNA甲基化变异并不引起性状变化。
材料继代过程中不一致的带型变化表明 , 在组织培养过程中虽然材料之间生长条件比较一致 , 但
仍然在不断进行着 DNA甲基化减少或者增加的表观遗传变化。DNA甲基化变化可能是培养基中的植
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物生长调节因子所致。Bucherna等 (2001) 的研究表明悬浮培养中 DNA甲基化的程度较高 , 并且细
胞分裂素导致的甲基化程度高于生长素。另外 , 本试验结果表明在菊花营养生长过程中 5′2CCGG23′
位点较多发生了内胞嘧啶的甲基化修饰 , 即 5′2CmCGG23′; 而半甲基化次之。如果打破这种常规的
表观遗传现象 , 是否能导致菊花营养生长到生殖生长的转变 , 是我们进一步亟待解决的问题。
将组织培养中的体细胞无性系变异与 DNA甲基化变化相联系具有一定的研究意义。本研究结果
表明 , 组织培养过程中材料表型性状没有变异 , 但基因组 DNA却发生了无数次的甲基化变化 , 这种
不稳定的甲基化修饰仅有个别位点能够维持下去 (带型稳定 ) , 大多数在以后的继代过程中会逐渐消
失或者产生新的修饰。而 DNA甲基化有可能阻断遗传信息的传递 , 引起形态性状的变化 (Holliday,
1987) , 并且 52mC易发生变化 , 导致 C: G到 T: A转变 , 亦有可能导致染色质结构改变和基因表达
变化。因而在组织培养诱发体细胞无性系变异的过程中可以借助 DNA甲基化变化来研究相关基因的
活性和作用 , 如一些结构基因发生了去甲基化或者甲基化增加 , 引起这些基因重新激活或使这些基因
以及相关联的基因失活 , 从而导致相关的表型变化。所以我们应当关注无性系变异中 DNA甲基化改
变引起的形态变化 , 从而由突变表型分析相关基因的作用。
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