全 文 ：园 艺 学 报 2006, 33 (2) : 300～305
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 07 - 20; 修回日期 : 2005 - 10 - 09
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30370947)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wuqj@mail. caas. net. cn)
小菜蛾γ -氨基丁酸受体基因片段的克隆、表达及
特征分析
周小毛 1, 2, 3 吴青君 13 胡美英 2 张友军 1 朱国仁 1 徐宝云 1
(1中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 华南农业大学昆虫毒理研究室 , 广州 510642; 3 湖南农业大学农
药学系 , 长沙 410128)
摘 要 : 利用反转录多聚酶链式反应 ( RT2PCR ) 对小菜蛾 ( Plutella xy lostella ) 的 γ - 氨基丁酸 a
( GABAa) 受体基因 cDNA片段进行了克隆和序列分析。通过简并性上游引物和下游引物扩增出小菜蛾
GABAa受体基因 248 bp的 cDNA片段。该 cDNA基因片段的氨基酸与已报道的烟芽夜蛾 (Helioth is viresce)
的 GABAa受体基因氨基酸序列同源性为 100%。以 GABAa受体基因片段为基础 , 构建了优化的半定量 RT2
PCR法 , 以 18S rRNA为内标 , 研究小菜蛾不同组织以及不同发育阶段 GABAa受体基因表达的差异。结果
表明 , GABAa受体基因在头部表达量最高 , 胸部次之 , 腹部最低 ; 在不同发育阶段的表达量差异不大。
关键词 : 小菜蛾 ; γ -氨基丁酸受体基因 ; 半定量 RT2PCR; 基因表达
中图分类号 : S 436134112 + 4 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2006) 0220300206
C lon ing and Expression Character istics of cD NA Fragm en t of GABAa
Receptor Gene in D iam ondback M oth ( P lu te lla xyloste lla )
Zhou Xiaomao1, 2, 3 , W u Q ingjun13 , Hu Meiying2 , Zhang Youjun1 , Zhu Guoren1 , and Xu Baoyun1
(1 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, Ch ina; 2L aboratory of Insect
Toxicology, Sou th China A gricu ltura l U niversity, Guangzhou 510642, Ch ina; 3D epartm en t of Pesticide Science, Hunan A gricu ltur2
a l U niversity, Changsha 410128, China)
Abstract: One fragment of 248 bp cDNA of the GABAa recep tor gene from the fourth instar larvae of di2
amondback moth (DBM , P lu tella xy lostella) was amp lified, cloned, sequenced and analyzed by using reverse
transcrip tion polymerase chain reaction ( RT2PCR ) method. Homologous analysis showed that it had 100%
homology with the published deduced am ino acid sequences of Helioth is viresce. Based on the GABAa recep tor
gene clone, an op timal sem i2quantitative RT2PCR method was successfully constructed. U sing 18S rRNA as
internal control, the exp ression difference of GABAa recep tor gene in different tissues and different develop2
mental stages was studied. Results showed that the gene was exp ressed the highest level in heads of DBM ,
next was in thorax and the lowest level in abdomen. The exp ression at different developmental stages was not
significantly different.
Key words: P lu tella xy lostella; GABAa recep tor gene; Sem i2quantitative RT2PCR; Gene exp ression
小菜蛾 ( P lu tella xy lostella) 是世界性十字花科蔬菜的主要害虫 , 也是抗药性最为严重的害虫之
一。据不完全统计 , 小菜蛾已对 50多种杀虫剂产生抗性。阿维菌素 (Avermectin) 是在 20世纪 90年
代初期引入我国的抗生素类生物源农药 , 其主要作用靶标是γ - 氨基丁酸 a ( GABAa) 受体 , 对害
虫、害螨及线虫均具有强的生物活性 , 并迅速成为防治小菜蛾的主导药剂 , 目前登记用于防治小菜蛾
的阿维菌素单剂和各种复配剂已达 200多种。同类药剂如此大量多次的应用 , 其后果必然是抗性基因
不断被筛选、加强 , 最终导致抗药性的产生 , 药剂失效。研究表明 GABAa受体的不敏感性在小菜蛾
对阿维菌素抗性中起重要作用〔1〕, 因此深入研究小菜蛾 GABAa受体是进一步明确小菜蛾对阿维菌素
2期 周小毛等 : 小菜蛾γ -氨基丁酸受体基因片段的克隆、表达及特征分析
靶标抗性机理及制定抗性治理策略的基础。
目前人们对于 GABAa受体的认识大多来自对哺乳动物的研究 , 对昆虫 GABAa受体的研究也主要
是以模式昆虫和卫生害虫为主 , 对农业昆虫 GABAa受体研究较少。第 1个被克隆的昆虫 GABA受体
基因是狄氏剂抗性果蝇 , 被命名为 Rd l (R sistance to dieldrin)〔2〕, 埃及伊蚊、德国蜚蠊、赤拟谷盗、
烟芽夜蛾等昆虫 GABA受体的不同亚基基因也相继被克隆〔3, 4〕, 但国内外对于小菜蛾 GABAa受体基
因克隆与序列分析均未见报道。在定量特异 mRNA表达量或不同的实验条件下其表达水平的差异时 ,
经常遇到转录产物表达量很低或样品量很少的情况 , 所以必须采用灵敏可靠的方法进行分析〔5〕。反
转录 -多聚酶链式反应 ( reverse transcrip tion2polymerase chain reaction, RT2PCR ) 是检测微量样品非
常有用的方法 , 它具有很高的灵敏度和特异性〔6〕。本研究拟采用 RT2PCR对小菜蛾 GABAa受体基因
cDNA片段进行克隆和序列分析 , 进而以 GABAa受体基因片段为基础 , 构建优化的半定量 RT2PCR
法 , 以 18S rRNA为内标 , 研究小菜蛾不同组织以及不同发育阶段 GABAa受体基因表达的差异 , 旨在
为深入研究小菜蛾 GABAa受体的分子特征及小菜蛾对阿维菌素的抗性分子机理提供依据。
1 材料与方法
111 供试昆虫
小菜蛾 1990年从深圳田间采集 , 在室内用甘蓝苗连续饲养 , 期间未接触任何杀虫剂 , 室内饲养
温度为 (25 ±2) ℃, RH为 50% ～70% , 光周期为光照 16 h∶黑暗 8 h。
112 方法
11211 总 RNA的提取 用 TR Izol提取总 RNA。分别取小菜蛾 1、2、3、4龄幼虫、蛹、成虫及 4龄
幼虫头、胸、腹部适量 , 放入以 1‰ DEPC或高温处理灭活 RNA 酶的玻璃匀浆器中 , 加入 1 mL
TR Izol研磨 (样品量不能超过 TR Izol量的 1 / 10 ) ,悬浮液用氯仿抽提 ,最后加入等体积的异丙醇于
- 20℃沉淀 RNA, 75%乙醇洗涤两次 , 溶于适量的去离子甲酰胺 , 测 OD260 /280值 , 结合甲醛变性
胶电泳对总 RNA含量及纯度进行精确测定。
11212 单链 cDNA合成和 PCR引物的设计 按大连宝生物工程有限公司 cDNA kit说明书进行。取
2μg总 RNA , 1μL O ligo ( dT) 18 50μmol/L和适量 DEPC处理的水 , 置于 65℃水浴 5 m in, 迅速置于
冰上冷冻 2 m in。加入 dNTP、RNA酶抑制剂、M 2MLV反转录酶。室温 10 m in后 , 在 PCR仪内完成下
述反转录过程 : 42℃保温 60 m in, 72℃灭活 10 m in, 6℃冷却 10 m in, 进行下一步反应或冷藏备用。
PCR引物的设计 : 根据已发表的昆虫 GABAa受体氨基酸序列的保守性区域 (烟芽夜蛾 AF006189
Helioth is virescens; 赤拟谷盗 S78567 Tribolium castaneum ; 蜜蜂 AF094822 A pis m ellifera; 地中海实蝇
AF172352 Cera titis capita ta; 德国蜚蠊 S76552 B la ttella germ anica; 果蝇 NM168322 D rosoph ila m elano2
gaster) , 分别设计简并性上游引物 5’2TG ( T/C) GA (A /G) AT (A /T/C) CA (A /G) TT ( T/C) GT23’和下
游引物 5’2ACCAT(A /G/T/C) AC (A /G) AA (A /G) CATGT23’。
11213 受体基因 cDNA片段的扩增及产物的克隆与测序 50μL反应体系中含第 1链 cDNA 产物
1μL, 5μL LATaq DNA聚合酶缓冲液 , 014 mmol/L dNTP, 1μmol/L上游引物和下游引物 , 2 U Taq
DNA多聚酶。反应条件为 94℃预变性 3 m in, 94℃变性 1 m in, 45℃退火 1 m in, 72℃延伸 1 m in, 循
环 35次 , 72℃延伸 10 m in。
PCR产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收和 PCR纯化回收试剂盒纯化回收后 , 连接于 pGEM 2T
EASY载体上 , 转化于 E. coli DH5α, 用通用引物进行序列阳性克隆的筛选 , 二次 PCR鉴定后 , 送交
上海申能博采生物科技有限公司测序。用 DNAMAN序列分析软件将 DNA序列翻译成氨基酸序列 , 用
BLAST软件做同源性比较分析。
11214 半定量 RT2PCR 参照文献 〔7〕, 以测序结果为基础 , 设计小菜蛾 GABAa受体基因引物。上
游 : 5’2TGTGAAATTCAGTTCGTACG23’; 下游 : 5’2ACCATTACGAAGCATGTACC23’。18S rRNA 内参
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园 艺 学 报 33卷
基因引物〔8〕: 上游 : 5’2CGGCTACCACATCCAAGG23’; 下游 : 5’2GCTGGAATTACCGCGGCT23’。为确
定两对引物是否适合在同 1个体系中进行半定量 RT2PCR, 设计竞争性试验。试验分 3组 : ( 1) cDNA
模板 , GABAa引物 ; (2) cDNA模板 , GABAa引物和 18S rRNA引物 ; (3) cDNA模板 , 18S rRNA引物。
PCR扩增后在同一块凝胶上电泳 , 若 (1) 和 (3) 与 (2) 中各自对应的条带在 2%琼脂糖凝胶电泳
后亮度和特异性一致 , 就可确定引物对之间无竞争。
确定引物对扩增所需的最佳 Mg2 +浓度需构建不同的 Mg2 +浓度的 PCR反应体系。检测的浓度为 :
110, 115, 210, 215, 310 mmol/L。PCR产物在 2%琼脂糖凝胶电泳后 , 鉴定其亮度和特异性 , 确定
适宜的 Mg2 +浓度。
PCR反应程序如下 : 95℃预变性 4 m in, 94℃ 1 m in, 55℃ 1 m in, 72℃ 1 m in, 确定不同的循环
数 , 72℃ 10 m in, 然后 4℃保存。
11215 GABAa受体表达差异的检测 分别取不同发育阶段和 4龄幼虫不同组织总 RNA按照 11212进
行反转录 , 按照 11214所列反应体系和反应条件进行 RT2PCR反应。PCR产物用 EB染色 , 在 TBE电
泳 缓冲液中 ,以 2 %琼脂糖凝胶电泳。拍照用凝胶电泳显像仪 ( ImmagemasterVDS) ,定量分析软件
用 Immage master VDS software。
2 结果与分析
211 小菜蛾 GABAa受体基因 cD NA片段的核苷
酸顺序及推导的氨基酸顺序
通过简并性上下游引物进行 PCR扩增 , 其扩
增产物进行电泳分析 (图 1) , 扩增所得的基因片
段大小约为 250 bp, 与预期的 248 bp扩增片段大
小相符。将 PCR产物克隆到 pGEM 2T EASY载体
中 , 选取阳性克隆 , 用通用引物测序。核苷酸序
列及推导出的氨基酸序列见图 2。包括引物在内 ,
所得 cDNA片段总长度为 248 bp, 推导出 82个氨
基酸残基。
图 1 小菜蛾 GABAa受体基因 cD NA片段的 PCR扩增
M: 100 bp 分子量标准 ; 1: PCR扩增产物。
F ig. 1 Am plif ica tion of cD NA fragm en t of GABAa
receptor gene from P. xylostella
M: 100 bp marker; 1: PCR amp lification p roduct.
图 2 小菜蛾 GABAa受体基因 cD NA片段核苷酸序列及推导的氨基酸序列
加下划线的为引物序列 , 核苷酸序列总长为 248 bp。
F ig. 2 The partia l cD NA sequence and deduced am ino ac id sequence of GABAa receptor in P. xylostella
The underlined sequences rep resent p rimers. The cloned sequence consists of 248 bp.
212 同源性比对
将小菜蛾 GABAa受体基因 cDNA片段推导出的 82个氨基酸残基与已知昆虫的 GABAa受体基因
氨基酸序列进行同源性比对 , 本试验所得小菜蛾 GABAa受体基因 cDNA片段氨基酸序列与烟芽夜
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2期 周小毛等 : 小菜蛾γ -氨基丁酸受体基因片段的克隆、表达及特征分析
蛾的同源性最高 , 达到 100% , 与蜜蜂、赤拟谷
盗、地中海实蝇、果蝇、德国蜚蠊的同源性分别
为 96%、96%、91%、88%、85% ; 与美国龙虾
(AY098945, Hom arus am ericanus) 的同源性也达
到 75%。表明我们获得的该 248 bp核苷酸序列即
为编码小菜蛾 GABAa 受体的部分氨基酸序列
( GeneBank登录号 : AY973948)。
213 小菜蛾不同发育阶段和不同部位 GABAa受
体基因表达情况
引物竞争性试验结果显示 (图 3) , 图中的 2
与 1, 3比较 , GABAa受体基因和 18S rRNA条带
清晰亮度基本一致 , 因此认为这对引物之间无竞
争 , 可以在同一个反应体系中进行。
由图 4可见 , Mg2 + 浓度的变化对 18S rRNA
特异性引物的扩增效率无明显影响 , 但对小菜蛾
GABAa受体基因特异性引物影响较大 , 在 Mg2 +
浓度为 215 mmol/L 时 , 条带清晰 , 扩增效率最
好 , 因此选择此浓度为最佳浓度。
反应的循环数是必须分析的参数。扩增反应
最初以线性递增 , 但是随着酶活性下降和溶液中
反应物的消耗 , 扩增反应会达到 1个平台。在平
台期低水平表达的目的 RNA可能会增加到与高水
平表达目的 RNA相同的浓度。在试验中作者检测
了 21～35个循环 (图 5) , 18S rRNA的 PCR产物
凝胶电泳后条带亮度随循环数增加至 27循环 , 而
后亮度不再增加。目的基因亮度随循环数增强至
29个循环。因此采用内参基因滞后 2个循环加入
的方法 , 即在加入目的基因的引物进行 PCR 反
应 , 待反应进行 2个循环的时候 , 在 72℃延伸期
加入 18S的引物 , 继续进行 27个反应。
图 3 引物竞争性试验电泳结果
M: 100 bp 标准分子量 ; 1: cDNA 模板 , GABAa引物 ;
2: cDNA 模板 , GABAa引物和 18S rRNA引物 ;
3: cDNA 模板 , 18S rRNA 引物。
F ig. 1 Electrophoresis result of com petition between pr im ers
M: 100 bp marker; 1: cDNA temp late + GABAa p rimer; lane
2: cDNA temp late + GABAa p rimer + 18S rRNA p rimer; lane
3: cDNA temp late + 18S rRNA p rimer.
图 4 不同 M g2 +浓度下目的基因和 18S rRNA PCR
产物的电泳分析
M: 100 bp标准分子量 ; 1～5: Mg2 +浓度分别为
110, 115, 210, 215, 310 mol/L。
F ig. 4 Electrophoresis result of GABAa and 18S rRNA PCR
products using d ifferen tM g2 + concen tra tion s
M: 100 bp marker; 1 - 5: Mg2 + concentrations
110, 115, 210, 215, 310 mol/L.
图 5 循环数对平台期影响的电泳分析
M: 100 bp 标准分子量 ; 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35: 循环数。
F ig. 5 Electrophoresis result of effect of cycles on pla teau
M: 100 bp marker; 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35: Number of cycles.
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小菜蛾不同发育阶段 GABAa受体基因表达定量结果 : 分别以不同样品中的 18S rRNA基因作为内
标 , 对该样品中的 GABAa受体基因表达水平进行半定量 RT2PCR分析 , 结果显示 , GABAa受体基因
在小菜蛾幼虫不同龄期及不同发育阶段均有表达 , 但表达量差别不大 , 其 IOD 比值范围为 1131～
1142 (图 6, 表 1)。
表 1 GABAa和 18S rRNA相应条带的完整光密度值
Table 1 In tegra ted optica l den sity ( IOD ) of each band corresponds to GABAa and 18S rRNA
a t d ifferen t developm en ta l stages of P. xylostella
完整光密度值
( IOD)
1龄幼虫
1 st instar larva
2龄幼虫
2nd instar larva
3龄幼虫
3 rd instar larva
4龄幼虫
4 th instar larva
蛹
Pupa
成虫
Adult
r1 13 587 13 933 13 786 13 574 12 891 13 810
r2 10 245 10 321 10 524 9 908 10 654 9 725
r1 / r2 1133 1135 1131 1137 1121 1142
注 : r1, GABAa受体基因 IOD值 ; r2, 18S rRNA IOD值 ; r1 / r2, GABAa受体在不同发育时期相对于内标 18S rRNA的表达量。
Note: r1, IOD of GABAa recep tor gene; r2, IOD of 18S rRNA; r1 / r2, GABAa recep tor exp ression quantity relative to 18S rRNA at different
developmental stages.
从图 7可以看出 , GABAa受体在小菜蛾头、胸及腹部均有分布 , 在头部表达量最高 , 其次为胸
部 , 腹部的表达量最低。头、胸部是中枢神经系统的分布区 , 而腹部主要是周缘神经系统 , 表明
GABAa受体主要分布于中枢神经系统 , 在神经和肌肉接点处的外周神经系统内也有分布。
图 6 GABAa受体在小菜蛾不同发育时期的表达
M: 100 bp标准分子量 ; 1～4: 1～4龄幼虫 ; 5: 蛹 ; 6: 成虫。
F ig. 6 Expression of GABAa receptor gene a t d ifferen t
developm en ta l stages of P. xylostella
M: 100 bp marker; 1 - 4: 1 - 4 instar larva; 5: Pupa; 6: Adult.
图 7 GABAa 受体在小菜蛾不同组织中的表达
M: 100 bp标准分子量 ; 1: 头部 ; 2: 胸部 ; 3: 腹部。
F ig. 7 Expression of GABAa receptor gene
in d ifferen t tissues of P. xylostella
M: 100 bp marker; 1: Head; 2: Thorax; 3: Abdomen.
3 讨论
GABAa受体是环戊二烯类 (如狄氏剂 )、硫丹和六六六等有机氯类杀虫剂的作用靶标 , 而这些杀
虫剂因环境安全问题已逐渐被淘汰。20世纪 90年代初期高效广谱的阿维菌素及其衍生物的出现使
GABAa受体再次受到关注 , 而随之研发的氟虫腈被证实也作用于该受体后 , GABAa受体则立即成为
毒理学研究的焦点和热点。同位素标记药剂的竞争性试验和电生理研究表明 GABAa受体上含有 100
多种化合物的特性结合位点〔9〕, 这些位点的不同使各种化合物表现出杀虫谱、选择性和毒杀活性的
差异。Deng等〔10〕通过家蝇头膜的结合研究认为阿维菌素作用于 GABA门控氯离子通道上的变构耦联
位点。Casida等〔11〕认为氟虫腈是与 GABAa受体的阻断剂位点结合 , 而阿维菌素是 GABAa受体的激
活剂 , 与受体的激活位点结合 , 开放氯离子通道 , 产生急性毒性 ; 也就是说其作用于同一靶标 , 但作
用位点不同 , 故这两类杀虫剂之间没有交互抗性。上述结果主要来自于生理生化的间接试验 , 对
GABAa受体 , 特别是对农业害虫 GABAa受体的明确认识还有赖于分子生物学的直接证据。
本研究首次运用 RT2PCR技术克隆到小菜蛾 GABAa受体基因 cDNA片段 , 并以 GABAa受体基因
片段为基础 , 构建了优化的半定量 RT2PCR法 , 以 18S rRNA为内标 , 研究小菜蛾不同组织以及不同
发育阶段 GABAa受体基因表达的差异 , GABAa受体基因在头部表达量最高 , 胸部次之 , 腹部最低 ;
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2期 周小毛等 : 小菜蛾γ -氨基丁酸受体基因片段的克隆、表达及特征分析
其在不同发育时期的表达量差异不大。这些研究结果对明确小菜蛾 GABAa受体上不同位点的特性及
研究更高活性的克抗药剂有直接指导意义。下一步研究可以此为基础设计特异引物获取小菜蛾
GABAa受体基因全长 , 同时对阐明昆虫 GABAa受体的药理性质及阿维菌素等药剂的靶标抗性机理 ,
对 GABAa受体上新的化合物结合位点的研究以及新杀虫剂的分子设计奠定了基础。
参考文献 :
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