全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (4) : 915 - 922
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 05 - 08; 修回日期 : 2007 - 07 - 04
基金项目 : 国家自然科学基金重点项目 (30330400) ; 重庆市自然科学基金重点项目 (8446)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: chaiyourong1@1631com; ljn1950@ swu1edu1cn)
羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸 - 4 - 羟化酶基因的
克隆及分析
陈安和 1, 2 , 李加纳 13 , 柴友荣 13 , 王　瑞 1 , 吕　俊 1
(1 西南大学农学与生物科技学院 , 农业部生物技术与作物品质改良重点实验室 , 重庆市油菜工程技术研究中心 , 重
庆 400716; 2 重庆邮电大学生物信息学院 , 重庆 400065)
摘 　要 : 以羽衣甘蓝为材料 , 克隆了全长 2 431 bp的肉桂酸 - 4 - 羟化酶基因 B oC4H。它有两个内含
子 , mRNA为 1 715 bp, 编码一个 481个氨基酸的推导蛋白 , 与其它植物 C4H有广泛同源性。它含有细胞
色素 P450保守域和特征基序 , 如血红素结合域、E - R - R三联体、含 T的结合槽基序、酶正确定向必需
的铰链基序。B oC4H具有 C4H /CYP73A5的大部分特征性底物结合位点基序 ( SRSs) 和酶活性位点残基 ,
但与拟南芥等植物 C4H相比其编码区 3′发生了 C2242单碱基缺失和相应移码 , 导致其蛋白 C - 末端缺失 /变
异了 36个残基 , SRS6基序和其上的活性位点残基也相应缺失 , 因此 B oC4H可能无功能或活性低。BoC4H
为膜蛋白 , 可能定位于内质网 , 其二级结构主要为α - 螺旋和随机卷曲。Swiss2Model不能预测出其三级结
构。甘蓝中存在一个至少由 5个成员构成的 C4H基因家族。
关键词 : 羽衣甘蓝 ; 克隆 ; 肉桂酸 - 4 -羟化酶 (C4H) ; 突变 ; 序列分析
中图分类号 : S 635　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0420915208
C lon ing and Sequence Ana lysis of a M uta tion2type C innama te242hydroxyla se
Gene from B rassica o le racea L. var. acepha la DC.
CHEN An2he1, 2 , L I J ia2na13 , CHA I You2rong13 , WANG Rui1 , and LΒ Jun1
( 1 Chongqing Rapeseed Engineering R esearch Cen ter; Key Laborotary of B iotechnology and C rop Q uality Im provem ent of M in istry of
A griculture; College of A gronom y and B iotechnology, Southw est U niversity, Chongqing 400716, Ch ina; 2 College of B io2inform a2
tion, Chongqing U niversity of Posts and Telecomm unica tions, Chongqing 400065, Ch ina)
Abstract: A 2 4312bp full2length cinnamate242hydroxylase gene, B oC4H , was cloned from B rassica oler2
acea L. var. acepha la DC. It contains 2 introns. Its mRNA is 1 715 bp, encoding a deduced 4812am ino2acid
polypep tide with wide homologies to C4H s from other p lants. It possesses cytochrome P450 conserved domains
and motifs such as the haem2iron binding motif, the E - R - R triad, the T2containing binding pocket motif
and the hinge motif necessary for op timal orientation of the enzyme. It also has most of the canonical C4H /
CYP73A52featured substrate2recognition sites ( SRSs) and active site residues. But owing to a single2base de2
letion at C2242 and subsequent frame shift within the 3′coding region as compared with C4H genes from A rabi2
dopsis tha liana and other p lants, B oC4H shows a 362aa deletion /variation at its C2term inus, and the SRS6 mo2
tif together with active site residues therein are absent. Thus B oC4H may be of no function or low activity.
BoC4H is a membrane p rotein and is p robably associated with endop lasm ic reticulum. Its secondary structure
is dom inated by alpha helices and random coils. Swiss2Model could not p redict its tertiary structure. B. olera2
cea contains a C4H gene fam ily with at least 5 members.
Key words: B rassica oleracea L. var. acepha la DC. ; Cloning; Cinnamate242hydroxylase ( C4H ) ;
Mutation; Sequence analysis
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
苯丙烷途径是指从 L -苯丙氨酸到羟基肉桂酸及其各种衍生物的合成途径 , 可以产生多种具有重
要生理功能的多酚类次生物质 , 如木质素和类黄酮等 (Barber & M itchell, 1997)。木质素是植物细胞
壁的主要成分之一 , 还与纤维素一起使植物的根、茎加粗和加固 , 增加植物抵抗病虫害和抗倒伏的能
力 (李波 等 , 2006)。黄烷酮、黄酮醇、花色苷、原花青素 (种皮色素 )、异黄酮等类黄酮物质 , 对
植物的生长发育、抗病性、抗逆性、品质形成等有重要作用 (W inkel2Shirley, 2001; Harakava,
2005)。
肉桂酸 - 4 -羟化酶 (Cinnamate242hydroxylase, C4H) 是细胞色素单加氧酶 P450超家族的成员之
一 , 处在细胞溶质中的苯丙烷途径酶复合物和定位于膜上的电子传递链之间的交接处 , 将苯丙烷途径
的合成酶复合物固定在内质网上。C4H是公共苯丙烷途径中的第二个关键酶 , 催化反式肉桂酸转变
为ρ -羟基肉桂酸。后者通过ρ-羟基肉桂酸辅酶 A连接酶 (4CL ) 转变为对香豆酰辅酶 A, 进入类
黄酮、木质素等下游途径。ρ-羟基肉桂酸也可进一步羟化直接进入木质素途径 , 产生咖啡酸 , 然后
在邻位转甲基酶作用下形成阿魏酸 , 阿魏酸经羟基化和甲基化而生成芥子酸 , 这些酚酸可为木质素和
一些植保素的生物合成提供苯丙烷碳骨架 (Barber & M itchell, 1997; 李波 等 , 2006)。
C4H是细胞色素单加氧酶家族中研究得最广泛的酶之一。根据 Nelson的 P450 数据库网站
( http: / / drnelson1utmem1edu /biblioD1htm l #73A) 的数据 , 目前至少已有 54个来自多种植物的 C4H
基因被克隆。但是在 GenBank登录的十字花科 C4H全长基因除了来自模式植物拟南芥的 C4H和芸薹
属的几条 C4H短片段标签序列外 , 还没有其他 C4H酶及其编码基因方面的文章报道。
研究 C4H基因对于羽衣甘蓝的抗性、生长发育、品质等性状改良具有重要意义 , 也有助于阐明
十字花科植物 C4H基因的分子进化。目前 GenBank中甘蓝只有 4个 C4H短片段标签序列 (AF230674
～AF230677) , 没有全长 C4H基因登录。本研究从羽衣甘蓝 (B rassica oleracea L. var. acepha la DC. )
中克隆了一条全长 C4H基因 , 并进行了系统的序列分析。
1　材料与方法
111　材料
羽衣甘蓝的叶和根取自重庆市油菜工程技术研究中心实验地。大肠杆菌菌株 DH5α由本中心保
存。GeneRacer试剂盒购自 Invitrogen公司 , 植物小量 RNA抽提试剂盒、小量胶回收试剂盒购自上海
华舜生物工程公司 , pMD182T载体连接试剂盒、 Taq DNA 聚合酶购自宝生物 (大连 ) 有限公司。
dNTP、琼脂糖、CTAB、蛋白胨、酵母膏、氨苄青霉素 (Amp)、X2gal、 IPTG等主要分子生物学试剂
购自上海生工生物技术服务公司。引物合成、DNA测序由上海英骏公司商业完成。
112　方法
11211　羽衣甘蓝基因组总 DNA和根总 RNA的提取 　采用 CTAB法提取羽衣甘蓝基因组总 DNA (Re2
chards, 1995)。因为 C4H基因一般接近组成性表达且根的木质化程度较高 , 所以取现蕾期羽衣甘蓝
的伸长根抽提总 RNA。
11212　保守区扩增 　通过对拟南芥等物种 C4H的序列比对 , 设计一对保守区引物 : FBNC4A ( 5′2
AGAGCTCCTTCGGAAACTGGCTCCAAG23′) 和 RBNC4A ( 5′2AGGATCCCTCAAAGCTCTG AGCCAACC2
3′)。PCR体系为 : 10 ×PCR缓冲液 5μL, 25 mmol/L MgCl2 3μL, 10 mmol/L dNTP 1μL, 10μmol/
L FBNC4A 1μL, 10μmol/L RBNC4A 1μL, 羽衣甘蓝 DNA 1μL (014μg) , 5 U /μL Taq DNA聚合酶
0125μL, 加重蒸水至 50μL。 PCR扩增条件为 : 94℃ 4 m in, 扩增 30个循环 ( 94℃ 1 m in, 55℃ 1
m in, 72℃ 1 m in) , 72℃ 10 m in。PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳、Goldview染色后照相 , 特异扩
增条带进行回收。
11213　亚克隆和测序 　胶回收的 DNA片段按说明连接重组到 pMD182T, 采用 Seidman等 (1995) 的
619
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　4期 陈安和等 : 羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸 - 4 -羟化酶基因的克隆及分析 　
CaCl2重悬法制备和转化 DH5α感受态 , 涂布含 X2gal + IPTG +Amp的 LB平板。PCR阳性的白斑克隆
子采用 M13F /M13R引物测序。
11214　RACE操作 　采用 GeneRacer试剂盒 , 取 5μg羽衣甘蓝根 RNA按说明进行 5′末端去磷酸化、
5′脱帽、5′连接 RNA O ligo、O ligo dT反转录等 RACE操作 , 获得单链总 cDNA。
11215　3′RACE扩增 　根据克隆的羽衣甘蓝 C4H保守区设计两条正向引物 : FC4H5231 ( 5′2ACT2
TACGGATGGGTCAACGAG23′) 和 FC4H5232 ( 5′2GATCGTGGTGAGGAAGCGT23′)。3′RACE初次扩增
的引物为 FC4H5231和 GeneRacer 3′Primer (5′2GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG23′) , 模板为 2μL
根总 cDNA, 62℃退火 , 循环中延伸 115 m in, 其它 PCR 条件同上。3′RACE巢式扩增的引物为
FC4H5232和 GeneRacer 3′Nested Primer ( 5′2CGCTACGTAACGGCATGACAGTG23′) , 模板为 011μL初
次扩增 PCR产物 , 其它 PCR条件同初次扩增。回收目的片段 , 亚克隆和测序。
11216　5′RACE扩增 　根据克隆的羽衣甘蓝 C4H保守区设计两条反向引物 : RC4H5251 (5′2CAACTG2
CAAACGCTTCCTCAC23′) 和 RC4H5252 ( 5′2CTCGTTGACCCATCCGTAAGT23′)。5′RACE初次扩增的
引物为 GeneRacer 5′Primer ( 5′2CGACTGGAGCACGAGGACACTGA23′) 和 RC4H5251, 模板为 2μL根
总 cDNA。5′RACE巢式扩增的引物为 GeneRacer 5′Nested Primer ( 5′2GGACACTGACATGGACTGAAG2
GAGTA23′) 和 RC4H5252, 模板为 011μL初次扩增 PCR产物。PCR条件同 3′RACE。回收目的片段 ,
亚克隆和测序。
11217　全长 cDNA和基因组序列扩增 　根据羽衣甘蓝 C4H的 5′和 3′cDNA末端序列 , 设计一条上游
引物 FP ( 5′2GAACTTGAGTTACTTATATTAAATAAATAATAAC23′) 和一条下游引物 RP ( 5′2AAA2
GATTTTACACAATATGGCTTATTC23′) , 用于扩增全长 cDNA和对应的基因组序列。全长 cDNA扩增时
的模板为 1μL根总 cDNA , 基因组序列扩增时的模板为 1μL ( 014μg) 羽衣甘蓝基因组总 DNA ,
PCR其它成分同保守区扩增 , 循环参数为 : 94℃ 4 m in, 扩增 35个循环 ( 94℃ 1 m in, 52℃ 1 m in,
72℃ 215 m in) , 72℃ 10 m in。回收目的片段 , 亚克隆和测序。
11218　生物信息学分析 　序列比对、开放读码框 (ORF) 查找和翻译、分子参数计算等在 Vector
NTIAdvance 910上进行。序列 BLAST在 NCB I ( http: / /www1ncbi1nlm1nih1gov/BLAST/ ) 上进行 ,
蛋白结构预测主要在 Expasy网站 ( http: / / cn1expasy1org / tools/ ) 提供的连接上进行。
2　结果与分析
211　羽衣甘蓝 C4H 基因的序列克隆
电泳和 OD值检测表明提取了适宜浓度和质量的羽衣甘蓝基因组总 DNA和根总 RNA (图略 )。
采用基因组总 DNA进行的保守区扩增获得了一条与预测长度一致的约 550 bp的电泳条带 (图略 ) ,
测序后的实际序列为 538 bp (不计人工酶切位点 )。采用根总 RNA进行 GenRacer操作获得单链总
cDNA后 , 采用 GeneRacer 5′Primer和 3′Primer进行放大扩增后电泳显示为约 100 bp～8 kb, 重心在约
115 kb处 , 说明反转录获得成功 (图略 )。3′RACE初次扩增的电泳显示在大于 1 kb有宽带 , 巢式扩
增的电泳显示 1条约 112 kb的特异条带 (图略 ) , 测序后的实际序列为 1 079 bp (不计 poly dA )。5′
RACE初次扩增的电泳显示在 650 bp左右有宽带 , 巢式扩增的电泳显示一条约 400 bp的特异条带
(图略 ) , 测序后的实际序列为 353 bp (不计由 RNA O ligo衍生的 5′接头序列 )。采用根据 3′和 5′cD2
NA末端序列设计的引物组合 FP /RP, 以根总 cDNA为模板成功扩增出了一条与预测长度一致的约
117 kb的条带 , 而以基因组总 DNA为模板则扩出了一条约 215 kb的条带 (图略 ) , 测序后的准确长
度分别为 1 715 bp和 2 431 bp, 相互间在外显子区完全一致 , 证明它们来自同一条基因 , 命名为
B oC4H。
719
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
212　B oC4H 基因分析
21211　B oC4H基因的基本特性 　B oC4H全长基因组序列为 2 431 bp, 有 3个外显子和 2个内含子
(910～984 bp和 1 113～1 753 bp处 )。其 mRNA为 1 715 bp (不计 poly A ) , 5′非编码区 (5′UTR )
为 124 bp, 3′UTR为 145 bp , 125～1 570 bp处有一个 1 446 bp的 ORF, 推导编码一个 481个氨基酸的
蛋白 (图 1)。5′UTR和 3′UTR的 GC含量分别为 3515%和 3512% , 内含子 1和 2的 GC含量分别为
3313%和 3112% , 而编码区的 GC含量为 49110% , 明显高于非编码区。
图 1　B oC4H 基因全长序列及其推导的氨基酸序列
ATG: 起始密码子 ; TAG: 终止密码子 ; 加虚下划线的碱基为内含子。加实下划线的氨基酸序列
P34 ～R481为保守域 pfam00067 (p450)。碱基 G2241与 T2242加框表示它们之间缺失了与其它植物 C4H对应的 C2242 ,
加阴影的 C -端 14个氨基酸残基由 G2241之后的移码区所编码。
F ig. 1　The full2length B oC4H gene and its deduced am ino ac id sequence
ATG: Start codon; TAG: Stop codon; introns are dash2underlined. Solid2underlined am ino acids from P34 to R481 correspond
to conserved pfam00067 (p450) domain. Between boxed G2241 and T2242 , a single2base deletion has occurred on C2242 as compared
with C4Hs from other p lants. The C2term inal 14 residues in gray background are encoded by the frame2shifted bases after G2241.
21212　B oC4H基因的同源性分析 　NCB I B lastn表明 , B oC4H与其它植物的 C4H有较高的同源性 ,
其中与拟南芥 C4H (A tC4H , ATU71080) 在局部比对的一致为 84% ～92% , Vector NTI计算的全长序
819
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　4期 陈安和等 : 羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸 - 4 -羟化酶基因的克隆及分析 　
列一致性为 5411% , 内含子区明显小于外显子区。B oC4H与芸薹属 C4H短片段标签序列有较高的同
源性 , 比如与白菜 (B. rapa cultivar R500) C4H2B R 21 (AF230678)、C4H2BR 23 (AF230680) 局部比
对的一致性为 87% ～90% , 与甘蓝 C4H2BO 21～C4H2BO 24 (AF230674～AF230677) 局部比对的一致
性为 86% ～89%。B oC4H 与十字花科以外的 C4H 也有广泛的同源性 , 比如与亚洲棉 C4H mRNA
(AF286648) 局部比对的一致性为 77% ～78%。
213　推导的 BoC4H蛋白的分析
21311　BoC4H的基本参数、亚细胞定位和可能的转录后修饰 　BoC4H有 481个氨基酸残基 , 分子量
为 55138 kD , 等电点为 9106, 为碱性蛋白。NetNGlyc 110 (B lom et al. , 2004 ) 和 PROSITE预测
BoC4H没有 N -糖基化位点。NetPhos 210预测显示 BoC4H分别有 11、5和 3个潜在的丝氨酸、苏氨
酸和酪氨酸磷酸化位点 , 暗示磷酸化可能在 BoC4H的活性调节上发挥作用。SignalP 310 (Bendtsen et
al. , 2004) 预测 BoC4H有信号肽和信号锚定的概率分别是 01473和 01518, 在 G28 ～K29间断裂的概率
为 01362。TargetP 111 ( TusnÀdy & Simon, 2001) 预测 BoC4H有信号肽的概率是 01859, 但未预测到
断裂点。因此 BoC4H很可能象其它 C4H一样具有信号锚定而不是剪切型的信号肽。 Softberry2Prot2
Comp 611预测 BoC4H是一个膜结合蛋白 , 定位于内质网膜上 , 可信度为 3133。TMp red (Hofmann et
al. , 1993) 预测 BoC4H有两个极显著的跨膜区 : L9 ～P26和 S444 ～V463。
21312　BoC4H 的同源性分析 　NCB I B lastp 表明 BoC4H 与其它植物 C4H 有广泛同源性 , 与白菜
(AAK14957、AAK14959) 和甘蓝 (AAK14953～AAK14955)、甘蓝型油菜 (AAK14951、AAK14952)
已经登录的一些 C4H 短片段 ( 104～137 aa) 的一致性分别为 82% ～84%、84% ～86%、82% ～
84% , 相似性分别为 93%、92% ～94%、91% ～92% , 与拟南芥 C4H (A tC4H: AAB58355) 的一致
性为 89% (423 aa / 471 aa) , 相似性为 95% (450 aa / 471 aa)。Vector NTI上进行的全长序列比对
表明 , BoC4H与拟南芥、喜树 ( Cam ptotheca acum ina ta )、亚洲棉 C4H 的一致性和相似性分别为
8410%和 8819%、7716%和 84%、7614%和 8314%。采用分类学上代表性的全长 C4H蛋白在 Vector
NTIAdvance 910上建立的系统树 (图 2) 表明 , BoC4H首先与 A tC4H聚在一起 , 然后它们与来自裸
子植物银杏和另一双子叶植物冰叶日中花的 C4H聚在一起 , 再与单子叶植物洋葱和菊芋的 C4H聚在
一起 , 最后与部分其它双子叶植物的 C4H相聚。
图 2　 BoC4H与其它植物 C4H蛋白的系统树
F ig. 2　Phylogenetic tree of BoC4H and C4Hs from other plan ts
21313　BoC4H的保守域、保守基序和酶活性位点预测 　NCB I保守域 (CD ) 搜索 (Marchler2Bauer &
B ryant, 2004) 检测到 BoC4H含有细胞色素 P450保守域 pfam00067 (p450) 和 COG2124 (CypX) , 分别
919
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
位于 P34 ～R481和 L31 ～R481。BoC4H具有 P450的特征基序 , 如血红素结合域 P437 FGVGRRSCPG447、含 T
结合槽基序 A304A IETT309、E361 - R364 - R418三联体以及酶正确定向必需的铰链基序为 P34 PGP IPVP41 (Ru2
pasinghe et al. , 2003) ; BoC4H具有 C4H /CYP73A5的 5个特征性底物结合位点基序 ( SRS) 的前 4个
( SRS1、SRS2、SRS4、SRS5) , 但缺乏位于 C -末端的 SRS6基序 KGGQFSLH I (图 3)。BoC4H具有典型
的 C4H /CYP73A5的酶活性位点氨基酸 (Hasemann et al. , 1995; Schoch et al. , 2003) , 如 I109、K113、
V118、F220、N302、R366等 , 但位于 SRS6等 C -末端序列上的活性氨基酸则随着 SRS6的缺失而缺失。
029
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　4期 陈安和等 : 羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸 - 4 -羟化酶基因的克隆及分析 　
图 3　BoC4H与其它植物 C4H蛋白的多重比对
参 加比对的 C4H蛋白序列同图 2。反显表示最保守的 (各蛋白完全一致的 ) 氨基酸 , 深灰、浅灰和白色背景分别表示相对保守、
低相似性和不相似的氨基酸。一致序列 (Consensus) 中 , 双下划线表示 P450特征基序即铰链区、富 T结合槽基序、
E361 - R364 - R418三联体、血红域基序 , 单下划线表示 5个底物结合区基序 , 其上可能的活性位点残基加灰背景表示。
BoC4H序列的 C末端 36个残基的方框区域表示与其它植物 C4H相比发生的移码和缺失突变。
F ig. 3　M ulti2a lignm en t of BoC4H w ith C4Hs from other plan ts
C4H p roteins aligned are the same as those in Fig. 2. Comp letely identical residues are reverse2disp layed, while residues with dark gray,
light gray and white backgrounds are conserved, weakly sim ilar and non2sim ilar residues. In the consensus, double2underlined regions/
residues indicate P4502featured motifs, i. e. the hinge region, the T2containing binding pocket motif, the E361 2R364 2R418 triad and
the haem domain, while single2underlines rep resent the 5 SRS regions in which the possible active site residues are in gray background.
The m issing/mutated 362residue region of the C2term inus of BoC4H is boxed.
21314　BoC4H的二级和三级结构预测 　BoC4H的二级结构主要是α - 螺旋 (51135% ) , 其次是随机
卷曲 (35114% ) , 还有 9198%的延伸链和 3153%的β -转角 (图 4)。Swiss2Model未能预测出 BoC4H
的三级结构。
图 4　BoC4H蛋白质的二级结构
F ig. 4　Secondary structure of BoC4H
3　讨论
B oC4H是通过基于从 mRNA反转录成 cDNA的 RACE锚定扩增技术策略克隆获得的 , 说明该基
因在体内被正常转录表达。SRS5和 SRS6及 SRS4的羧基端是与底物的芳香环结合的重要部位 , SRS1
和 SRS2及 SRS4的氨基端在与底物的脂肪链结合时发挥重要作用 (Hasemann et al. , 1995; Schoch et
al. , 2003)。SRS6的缺失也许意味着 BoC4H失去底物结合能力 , 或酶活性很低。通过对 BoC4H与其
它植物 C4H基因的多重比对发现 , 导致其缺失 SRS6的根本原因是在该基因的 G2241之后缺失了一个碱
基 C2242 , 从而导致 ORF的移码 , 与 A tC4H相比其 C -末端缺失了 36个氨基酸 , 其取代性序列 F468 ～
R481与已知蛋白没有任何同源性。Swiss Model不能预测出其三级结构 , 因此 BoC4H蛋白很可能无功
能或活性极弱。重复克隆测序证明这一突变在本研究所采用的羽衣甘蓝材料中是真实突变。
B oC4H的退化性突变并没有影响羽衣甘蓝的生长发育 , 因为我们采用的材料是正常生长发育的
典型黑籽型品种。Fourmann等 (2002) 利用拟南芥功能基因对芸薹属植物进行分子标记鉴定时克隆
了 4个甘蓝 C4H短片段 , BLASTn表明 B oC4H与它们都没有对应关系 , 序列差异较大 , 说明甘蓝中
129
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
至少存在一个由 5条以上的 C4H成员构成的基因家族。图 2中聚类方式与各物种间的生物学分类距
离很不一致 , 也说明植物界的 C4H存在几种类型。该基因家族中有多少成员保留了典型 C4H蛋白的
完整结构 , 多少成员象 BoC4H一样发生了蛋白基序水平的缺失突变 , 成员间在功能上有多大差异 ,
有待于对羽衣甘蓝整个 C4H基因家族进行全长克隆、分子鉴定和功能验证 , 而 B oC4H全长序列的克
隆为整个基因家族的序列克隆和研究 C4H蛋白 C -末端缺失突变的功能效应打下了基础。
C4H酶活性受抑制后转基因植物的木质素含量减少 , 调控该基因的表达还可以改变木质素的成
分构成 ( Sewalt et al. , 1997; B lee et al. , 2001)。通过上调 C4H的表达 , 促进木质素、防卫性植保素
的合成 , 可以增强植物的抗病性、抗逆性和抗倒伏性。理论上 , 通过上调或下调 C4H的表达来增加
或减少进入花色素苷的物质流 , 可以对植物的花色深浅进行修饰 , 此外调控种皮中 C4H的表达可以
调控种皮色素和木质素的合成 , 改良种皮性状。B oC4H的克隆将为通过分子手段调控或改造这些性
状打下基础。本研究也为研究近缘物种如白菜、甘蓝型油菜等的 C4H进化提供了基础。
References
BarberM S, M itchell H J. 1997. Regulation of phenylp ropanoid metabolism in relation to lignin biosynthesis in p lants. Int. Rev. Cytol. , 172:
243 - 293.
Bendtsen J D, N ielsen H, von Heijne G, B runak S. 2004. Imp roved p rediction of signal pep tides: SignalP 3101J. Mol. B iol. , 340: 783 - 795.
B lee K, Choi J W , OpiConnell A P, Jupe S C, Schuch W , Lewis N G, Bolwell G P. 2001. Antisense and sense exp ression of cDNA coding for
CYP73A15, a classⅡ cinnamate 42hydroxylase, leads to a delayed and reduced p roduction of lignin in tobacco. Phytochem istry, 57: 1159 -
1166.
B lom N, Sicheritz2Ponten T, Gup ta R, Gammeltoft S, B runak S. 2004. Prediction of post2translational glycosylation and phosphorylation of p ro2
teins from the am ino acid sequence. Proteom ics, 4: 1633 - 1649.
Fourmann M, Barret P, Froger N, Baron C, Charlot F, Delourme R, B runel D. 2002. From A rabidopsis tha liana to B rassica napus: development
of amp lified consensus genetic markers (ACGM) for construction of a gene map. Theor. App l. Genet. , 105: 1196 - 1206.
Harakava R. 2005. Genes encoding enzymes of the lignin biosynthesis pathway in Eucalyptus. Genet. Mol. B iol. , 28 (3S) : 601 - 607.
Hasemann C A, Kurumbail R G, Boddupalli S S, Peterson J A, Deisenhofer J. 1995. Structure and function of cytochromes P450: a comparative
analysis of three crystal structures. Structure, 3: 41 - 62.
Hofmann K, StoffelW , Mbase T. 1993. A database of membrane spanning p roteins segments. B iol. Chem. Hoppe2Seyler, 374: 166.
L i Bo, L iang Ying, Chai You2rong. 2006. Achievements in research on p lant cinnamoyl2coA reductase (CCR) genes. Molecular Plant B reeding,
4 (3S) : 55 - 65. ( in Chinese)
李　波 , 梁　颖 , 柴友荣. 2006. 植物肉桂酰辅酶 A还原酶 (CCR) 基因的研究进展. 分子植物育种 , 4 (3S) : 55 - 65.
Marchler2Bauer A, B ryant S H. 2004. CD2Search: p rotein domain annotations on the fly. Nucleic Acids Res. , 32: 327 - 331.
Rechards E J. 1995. Preparation and analysis of DNA. In: Ausubel F M, B rent R, Kingston R E, Moore D D, Seidman J G, Sm ith J A, Struhl
K eds. Short Protocols in Molecular B iology. New York: John W iley and Sons.
Rupasinghe S, Baudry J, SchulerM A. 2003. Common active site architecture and binding strategy of four phenylp ropanoid P450 s from A rabidopsis
tha liana as revealed by molecular modeling. Protein Eng. , 16: 721 - 731.
Schoch G A, A ttias R, Le RetM, W erck2Reichhart D. 2003. Key substrate recognition residues in the active site of a p lant cytochrome P450,
CYP73A1. Homology guided site2directed mutagenesis. Eur. J. B iochem. , 270: 3684 - 3695.
Seidman C E, Struhl K, Sheen J. 1995. Escherich ia coli, p lasm ids, and bacteriophages. In: Ausubel F M, B rent R, Kingston R E, Moore D D,
Seidman J G, Sm ith J A, Struhl K eds. Short Protocols in Molecular B iology. New York: John W iley and Sons.
Sewalt V J H, N iW , B lount J W , Jung H G, Masoud S A, Howles P A, Lamb C, D ixon R A. 1997. Reduced lignin content and altered lignin
composition in transgenic tobacco down2regulated in exp ression of L2phenylalanine ammonia2lyase or cinnamate 42hydroxylase. Plant Physiol. ,
115: 41 - 50.
TusnÀdy G E, Simon I. 2001. The HMMTOP transmembrane topology p rediction server. B ioinformatics, 17: 849 - 850.
W inkel2Shirley B. 2001. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochem istry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiol. ,
126: 485 - 493.
229
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net