全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (3) : 337 - 342
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 08 - 13; 修回日期 : 2008 - 01 - 10
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30571284) ; 高等学校博士学科点专项科研基金项目 ( 20040335022) ; 高等学校学科创新引
智计划项目 (B06014)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: akun@zju1edu1cn)
感谢新西兰国家园艺与食品研究所 Ian Ferguson院士、Andrew A llan博士、Judith Bowen和 Sakuntala Karunairetnam女士提供的帮助。
基于 EST库的猕猴桃脂氧合酶基因家族成员的克隆
张　波 , 李　鲜 , 陈昆松 3
(浙江大学果实分子生理与生物技术实验室 , 农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室 , 杭州 310029)
摘　要 : 利用猕猴桃 EST库及相关生物信息学手段 , 从果肉组织克隆了 LOX基因家族成员 6个 , 命名为
AdLox126。AdLox1、AdLox2、AdLox3和 AdLox4为全长 cDNA, 编码区长度分别为 2 739、2 595、2 739和
2 709 bp, AdLox5和 AdLox6为 cDNA片段 , 长度为 1 359和 1 557 bp。猕猴桃 AdLox2和 AdLox5氨基酸序列同
源性最高 , 约 74% , 而 AdLox3和 AdLox5仅为 49%。生物信息学分析表明 , AdLox1、AdLox3、AdLox4和
AdLox6可能具有 132LOX活性 , 在 N端含有额外约 60个氨基酸残基 , 而 AdLox2和 AdLox5则属于 92LOX类型。
猕猴桃 A dLox1与番茄 TomLoxD具有最高氨基酸序列同源性 (约 80% ) , AdLox2和 AdLox5与 TomLoxA高度聚
类 , 序列同源性分别为 68%和 75% , AdLox4和 AdLox6与 TomLoxC的氨基酸序列同源性分别为 62%和 63% ,
AdLox3与番茄 LOX基因序列同源性低于 55%。
关键词 : 猕猴桃 ; 脂氧合酶 ; LOX基因家族 ; EST; 克隆
中图分类号 : S 66314　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0320337206
M olecular Clon ing of L ipoxygenase Gene Fam ily M em bers in K iw ifru it Ba sed
on EST Da tabase
ZHANG Bo, L I Xian, and CHEN Kun2song3
(Laboratory of Fruit M olecular Physiological and B iology, Zhejiang U niversity; The S tate Agriculture M inistry Laboratory of Horti2
cultural P lant Grow th, D evelopm ent and B iotechnology, Hangzhou 310029, China)
Abstract: From Actin id ia EST database, six LOX were cloned from kiwifruit flesh tissue, i1e. AdLox126.
AdLox1, AdLox2, AdLox3 and AdLox4 contained full2length cDNA s with 2 739, 2 595, 2 739 and 2 709 bp, re2
spectively, AdLox5 and AdLox6 were cDNA fragments of 1 359 and 1 557 bp. Among the six kiwifruit LOX
genes, AdLox5 and AdLox6 had the highest am ino acid sequence identity, which was 74% , while AdLox3 and
AdLox5 p roduced the lowest am ino acid sequence identity, which was 49%. Phylogenetic analysis showed that
AdLox2, AdLox5 clustered as 92LOX, AdLox1, AdLox3, AdLox4 and AdLox6 clustered as 132LOX. There was a
signal pep tide sequence of 60 am ino acids in all members of the 132LOX group, but no sim ilar sequence in the
92LOX genes. AdLox1 wasmost sim ilar to tomato TomLoxD at 80% identity at the am ino acid level, AdLox2 and
AdLox5 matched to TomLoxA with 68 and 75% identity, respectively, and AdLox4 and AdLox6 showed 62% and
63% sequence identity to TomLoxC, AdLox3 had less than 55% identity to LOX genes from tomato.
Key words: kiwifruit; lipoxygenase; LOX gene fam ily; EST; cloning
对拟南芥测序的结果显示 , 60%的基因以基因家族形式存在 , 其中 50%为超过 5个成员的基因
家族 ( The A rabidopsis Genome Initiative, 2000)。在其它植物如水稻、大麦和番茄中也发现大量基因家
族。研究显示 , 基因家族不同成员存在功能差异 , 并具有不同调控机制 ( Griffiths et al. , 1999; Yok2
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
oyama & N ishitani, 2001; Chen et al. , 2004; Zhang et al. , 2006)。从基因家族角度开展研究是深入了
解基因功能与调控的有效途径之一。
利用已公开的基因组数据库 , 可进行基因资源快速挖掘。虽然基因组测序提供完整的遗传信息 ,
但因工程量巨大而影响了测序进度。目前在植物界只完成了拟南芥和水稻基因组的完全测序 , 而番茄
等其它植物则以另一种方式在进行 , 即表达序列标签 ( exp ressed sequence tag, EST)。 EST概念于
1991年被提出 , 它是 cDNA 的部分序列 , 长度一般为 200～500 bp, 由大规模 cDNA克隆后进行一次
性测序得到 , 其有限序列可特异性代表一个特定基因 ( http: ∥www1ncbi1nlm1nih1gov /About/p rimer/
est1htm l#ests)。2007年 3月 9日 GenBank已公布了约 4 200万条 EST序列信息 , 涉及约 1 300种生物 ,
比 2004年增加了约 2 000万条 ( http: ∥www1ncbi1nlm1nih1gov/dbEST/dbEST_ summary1htm l)。EST
技术已成为发现新基因和搜寻基因家族成员的有力工具 , 受到越来越多的关注 ( Kuh et al. , 2004;
Newcomb et al. , 2006; Park et al. , 2006)。
脂氧合酶 ( lipoxygenase, LOX) 基因家族在植物界广泛存在 , 具有 92LOX和 132LOX两种类型 ,
它们参与种子萌发、调控生长发育和各种抗逆反应 ( Feussner & W asternack, 2002; Porta & Rocha2
Sosa, 2002) , 并在果实乙烯合成、后熟软化和香气形成等成熟衰老进程中起作用 (张波 等 , 2007)。
确认 LOX基因家族成员存在的数量并获取其序列信息 , 有助于从分子水平阐述其在果实成熟衰老进
程中的作用。作者利用 EST数据库作为基因挖掘平台 , 进行猕猴桃 LOX基因家族成员的克隆 , 为进
一步研究 LOX基因功能及其调控提供依据。
1　材料与方法
111　LO X基因 ESTs获取与序列组装
登录新西兰 HortResearch的猕猴桃 EST数据库 (约含有 50万条 EST, 目前尚未释放序列 ) , 利用
检索系统 , 选择非冗余数据库 ( nonredundant database, NRDB ) , 输入检索词 lipoxygenase检索。设定
检索结果的格式 , 选定的记录内容存入计算机中 , 利用相关生物信息学软件进行序列分析和组装。
112　LO X基因家族成员的确认和克隆
根据 EST库初步筛选的 LOX候选基因 EST序列号 , 选取质粒开展双向测序 , 获得非编码区序列
( untranslated region, UTR)。3′UTR序列信息用于确认 LOX基因家族成员的数量 , 同时结合 EST的 5′
UTR或编码区序列信息开展 RT2PCR。按 Chang等 (1993) 的方法进行 ‘布鲁诺 ’猕猴桃 (A ctin id ia
deliciosa‘B runo’) 果实组织的总 RNA提取。单链 cDNA合成反应体系包括 210μg总 RNA , Super2
scrip t Ⅲ逆转录酶 ( Invitrogen) 和 O ligod ( T) 20。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后 , 切割目的条带 ,
使用试剂盒进行 PCR回收和纯化 (Q iagen) , 使用 pMD182T载体 ( TaKaRa) 进行 PCR产物克隆 , 并
送上海英骏公司测序。
113　LO X序列的生物信息学分析与登录
使用 Vector NTI ( v 91110; Invitrogen) 对 LOX基因家族成员编码的氨基酸序列进行排列 , 并输
出至 GenDoc ( v 216102; http: ∥www1bioon1com /Soft/Class1 /Class17 /200408 /1651htm l) 软件。均采
用默认参数。序列确认后的猕猴桃 LOX基因家族成员重新登录 EST数据库 , 并递交至 GenBank。
2　结果与分析
211　LO X基因家族成员序列的获取
3′UTR序列的特异性用于 LOX 基因家族成员确认 , 获取的基因序列可进一步用于同源性分析、
基因表达分析和基因功能验证 (图 1)。
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　3期 张 　波等 : 基于 EST库的猕猴桃脂氧合酶基因家族成员的克隆 　
图 1　LOX基因家族成员鉴别与应用流程图
图中虚框内容表示 EST库的检索工作 , 实线箭头表示本文研究工作 , 虚线表示相关的延伸工作。
F ig. 1　Schem e for LOX gene fam ily m em ber iden tif ica tion and applica tion
Dashed box indicated gene search work in EST database, real line arrow indicated work in p resent research,
dashed line arrow indicated future work.
通过检索和测序发现 6个 EST在 3′UTR区域存在明显的长度和序列信息差异 (图 2) , 它们可能
是猕猴桃 LOX基因家族不同成员 , 分别命名为 A dL ox1 (DQ497792 ) , A dL ox2 (DQ497797) , A dL ox3
(DQ497795) , A dL ox4 (DQ497793) , A dL ox5 (DQ497796) 和 A tL ox6 (DQ497794)。A dL ox1具有最长的
3′UTR, 长度为 231 bp, 而最短的 AdL ox2仅为 106 bp。
图 2　猕猴桃 LOX基因家族 6个成员的 3′UTR序列比较
F ig. 2　Sequence com par ison of 3′UTR of six k iw ifru it LOX gene fam ily m em bers
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LOX 基因家族 AdL ox1、A dL ox2、A dL ox3 和 A dL ox4 为全长 cDNA 序列 , 其编码区长度分别为
2 739、2 595、2 739和 2 709 bp, A dL ox5和 A dL ox6为 cDNA片段 , 编码区序列长度分别为 1 359和
1 557 bp。
212　LO X基因家族成员序列同源性分析
图 3为猕猴桃 LOX信息与其他植物 LOX基因家族的氨基酸序列比对分析结果 , 显示 92LOX和 132
LOX在序列上具有长度差异 , 132LOX在 N端含有额外约 60个氨基酸残基。
猕猴 桃 AdL ox1、AdL ox3、AdL ox4、AdL ox6, 拟 南 芥 A tL ox2、A tL ox3、 A tL ox4、A tL ox6, 番 茄
TomL oxC、TomL oxD以及马铃薯 S tL oxH1、S tLoxH3等属于 132LOX; 猕猴桃 AdLox2、AdLox5, 拟南芥
A tLox1、A tLox5, 番茄 TomLoxA、TomL oxB、TomLoxE以及马铃薯 PotLX1等则属于 92LOX类型 (图 3)。
图 3　植物 LO X的 N端氨基酸序列比较 (猕猴桃 LOX用框表示 )
F ig. 3　N2term ina l am ino ac ids sequence com par ison of plan t LOX genes ( k iw ifru it LOX genes are represen ted by box)
基因名称 ( GenBank登录号 ) Genes name ( GenBank accession number) : 猕猴桃 A ctinidia deliciosa: A dLox1 (DQ497792) ,
AdLox2 (DQ497797) , A dLox3 (DQ497795) , A dLox4 (DQ497793) , AdLox5 (DQ497796) , AdLox6 (DQ497794) ;
拟南芥 A rabidopsis thaliana: A tLox1 (AAA32827) , A tLox2 (AAA32749) , A tLox3 (AT1G17420) , A tLox4 (AT1G72520) ,
A tLox5 (AT3G22400) , A tLox6 (AT1G67560) ; 番茄 Lycopersicon esculen tum : TomLoxA (AAA53184) , TomLoxB (AAA53183) ,
TomLoxC (AAB65766) , TomLoxD (AAB65767) , TomLoxE (AAG21691) ; 烟草 N icotiana tabacum : N tLox1 (AAP83134) ,
N tLox2 (AAP83137) , N tLox3 (AAP83138) ; 马铃薯 Solanum tuberosum : PotLX1 (AAB67858) ,
S tLoxH1 (CAA65268) , S tLoxH3 (CAA65269) ; 水稻 O ryza sativa: O sLox1 (CAA45738) , O sLox2 (A53054) ;
大豆 Glycine m ax: GmLox1 (AAA33986) , GmLox2 (AAA33987) , GmLox3 (CAA31664) , GmLox4 ( P38417) ,
GmLox5 (AAB67732) , Gm vLxC (AAA96817) , GmLox7 (AAC49159) ;
大麦 Hordeum vulgare: HvLoxA (AAA64893) , HvLoxB (AAB60715) .
猕猴桃 LOX基因家族 6个成员存在序列同源性差异。A dL ox2 和 A dL ox5的氨基酸序列同源性最
高 , 约 74% , A dL ox4和 A dL ox6约 70% , A dL ox1和 A dL ox3的序列同源性低于 55% ; A dL ox2和 A dL ox5
与 TomL oxA高度聚类 , 序列同源性分别为 68%和 75% , AdL ox4和 A dL ox6与 TomL oxC的氨基酸序列
同源性分别为 62%和 63% , AdL ox3与其它植物 LOX序列同源性低于 55% (表 1)。另外 , A dL ox2与
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　3期 张 　波等 : 基于 EST库的猕猴桃脂氧合酶基因家族成员的克隆 　
陈昆松等 (1998) 克隆的 pKLC片段高度同源 (97% )。
表 1　猕猴桃与其它植物 LOX的氨基酸序列同源性
Table 1　Hom ologous percen tage of LOX am ino ac id sequences between k iw ifru it and other plan ts /%
TomLoxD AdLox3 AdLox4 AdLox6 TomLoxC A tLox2 A tLox1 A dLox2 AdLox5 TomLoxA TomLoxB TomLoxE
AdLox1 80 54 45 44 44 42 44 43 50 46 44 44
TomLoxD 55 46 45 45 43 45 43 50 46 44 45
AdLox3 47 47 47 45 44 43 49 42 42 43
AdLox4 70 63 56 44 43 51 43 41 43
AdLox6 62 51 40 36 51 37 36 37
TomLoxC 57 42 42 49 42 40 41
A tLox2 44 43 51 43 41 43
A tLox1 66 70 67 63 68
AdLox2 74 68 63 68
AdLox5 75 71 77
TomLoxA 72 77
TomLoxB 79
　　注 : 表格中的基因名称和 GenBank登录号见图 3; 猕猴桃 LOX基因家族用粗体字母表示。
Note: Genes name and GenBank accession number see Fig. 3; Kiwifruit LOX genes are rep resented by bold.
3　讨论
本研究克隆了猕猴桃 6个 LOX基因 , 命名为 A dL ox126, 其中 A dL ox2和 A dL ox5属于 92LOX类型 ,
其它 4个成员为 132LOX。已有研究显示 , 猕猴桃 LOX基因家族成员具有含 38个氨基酸的保守序列 ,
该序列在植物和动物界中均普遍存在 , 它可能是 LOX螯合金属铁离子 , 进而形成催化活性中心所必
要的元件 ( Zhang et al. , 2006)。
番茄 LOX基因家族成员 TomL oxC具有 132LOX活性 , 利用绿色荧光蛋白 ( green fluorescent p ro2
tein, GFP) 标记该基因并在烟草原生质体中表达 , 共聚焦显微镜检测表明 TomL oxC定位于叶绿体
(Chen et al. , 2004)。另外 , 拟南芥 A tL ox2 (Bell et al. , 1995) 和水稻 RC I21 (即 O sL ox1) ( Schaffrath
et al. , 2000 ) 也具有相同亚细胞器定位。我们的研究表明 , 猕猴桃 A dL ox1、A dL ox3、A dL ox4 和
AdL ox6与上述 3种植物的 LOX基因同属 132LOX类型 , 且在 N2端具有信号肽序列。目前认为这些信号
肽具有导向作用 , 可能参与蛋白质向叶绿体等细胞器的运输过程 ( Feussner & W asternack, 2002)。由
此认为 , 猕猴桃 LOX 基因家族成员 A dL ox1、A dL ox3、AdL ox4和 A dL ox6可能在叶绿体等细胞器中分
布。
132LOX可能参与了多聚不饱和脂肪酸 ( PUFA s) 向茉莉酸 (JA ) 的转化 , 以及植物挥发性化合
物如己醛和己烯醛合成 ( Porta & Rocha2Sosa, 2002)。抑制 A tL ox2表达的拟南芥转基因植株 , 叶片组
织 JA含量显著低于野生型 (Bell et al. , 1995) , 烟草 N tL ox3是 JA生物合成特异性成员 (Halitschke
& Baldwin, 2003)。番茄 LOX 基因 TomL oxC的反义表达 , 极显著减少果实香气物质含量 ( Chen et
al. , 2004) , 转基因抑制马铃薯 S tL oxH1转录本水平也同样显著减少叶片己醛积累 (León et al. ,
2002)。近年有关 92LOX功能的研究得到了转基因证据支持 , 如降低马铃薯 PoxLX1表达导致块茎变
小和产量下降 ( Kolom iets et al. , 2001) , 拟南芥突变体报道显示 92LOX参与了侧根的发育进程 , 同时
还介导了植株叶片组织的抗逆反应 (Vellosillo et al. , 2007)。猕猴桃 A dL ox1和 AdL ox3与烟草 N tL ox3
聚类 , A dL ox2和 A dL ox5 与马铃薯 PoxLX1 氨基酸序列高度同源 , 而 A dL ox4 和 A dL ox6 则与番茄
TomL oxC和烟草 S tL oxH1聚类。这些生物信息学分析结果与我们的先前结果 ( Zhang et al. , 2006) 一
致。猕猴桃 LOX基因家族 6个成员在果实成熟衰老进程中具有不同表达模式 , 推测各成员间可能存
在功能差异 ( Zhang et al. , 2006)。
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综上所述 , 基于 EST库的序列信息 , 从猕猴桃中克隆了 LOX基因家族 6个成员 , 它们分为 92LOX
和 132LOX两种类型 , 且与已知功能的番茄、烟草和马铃薯等植物 LOX 基因家族成员具有序列同源
性。这些结果为利用生物信息学手段解析基因家族成员功能提供有益的借鉴 , 也为研究 LOX基因家
族在猕猴桃果实采后成熟衰老进程中的功能及其调控提供依据。
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