全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (5) : 721 - 726
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 03 - 03; 修回日期 : 2008 - 04 - 08
基金项目 : 广东省科技计划项目 (2006B20230004) ; 广东省重大科技专项项目 (2006A20201001)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: XiuL inye@ yahoo1com)
鹤顶兰胚珠发育过程及受精前后同工酶的变化
李冬妹 1, 2 , 段中岗 2 , 叶秀粦 23 , 梁承邺 2
(1 顺德职业技术学院艺术设计系 , 广东佛山 528300; 2 中国科学院华南植物园 , 广州 510650)
摘 　要 : 通过光学显微镜观察发现 : 鹤顶兰 [ Phaius tankervilliae (A iton) B l. ] 授粉后 10 d胎座出现指
状突起 , 20 d形成胚珠原基 , 24 d大孢子母细胞发生 , 30 d功能大孢子形成 , 41 d发育为成熟的八核胚囊 ,
而后完成双受精发育成早期球形胚。用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法研究鹤顶兰从指状突起出现到早期球形
胚形成的全过程中酯酶 ( Est)、酸性磷酸酶 (Acp) 的变化发现 : 这一过程中 Est表达有 7个同工酶位点 ,
Acp有 5个同工酶位点 , 两者均在八核胚囊时期变化最显著。Est27和 Acp24在整个发育过程中都有表达 ;
在八核胚囊时期特异表达的位点有 Est24和 Acp23; 而 Acp22只在这一时期不表达。Est21在八核胚囊时期和
大孢子母细胞减数分裂中期表达。授粉后 Est和 Acp的酶位点变化说明与胚珠发育相关的一系列基因表达
有时序性 , 位点 Est24、Acp22和 Acp23是否直接参与了八核胚囊发育的控制 , 有待于进一步的研究。
关键词 : 鹤顶兰 ; 酯酶 ; 酸性磷酸酶 ; 胚珠 ; 聚丙烯酰胺凝胶电泳
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0520721206
The Rela tion sh ip Between O vule D evelopm en t and Isozym es after Pollina tion
in Pha ius tankervilliae ( A iton) Bl1
L IDong2mei1, 2 , DUAN Zhong2gang2 , YE Xiu2lin23 , and L IANG Cheng2ye2
(1 Shunde Poly technic, Foshan, Guangdong 528300, Ch ina; 2 South China B otany Garden, the Chinese A cadem y of Sciences,
Guangzhou 510650, China)
Abstract: Under m icroscope, the nucellar filament of Phaius tankervilliae (A iton) B l. could be ob2
served on 10th day after pollination, archesporial cell on 20th day, megasporocyte on 24th day, the functional
megaspore on 30th day; and 82nucleate embryo sac on 41th day. And then double fertilization finish and early
globular embryo emerge. The researches on isozymes indicated that some varieties of isozyme loci p resent dur2
ing the embryo development. There are 7 esterase ( Est) loci and 5 acid phosphatase (Acp) loci during the
periods between nucellar filament and early globular embryo; Both of Est and Acp appeared the most diversity
in the stage of 82nucleate embryo sac. Est27 and Acp24 always exp ress in the whole developmental stages ,
and Est24 and Acp23 just exp ress in the stage of 82nucleat embryo sac of Phaius tankervilliae (A iton) B l. ,
but Acp22 exp ress in all developmental stages excep t the 82nucleat embryo stage. Est21 only exp ress in the
stage of 82nucleat embryo sac and metaphase of meiosis. Further studies should be done to confirm if Est24,
Acp22 and Acp23 could regulate the development of 82nucleat embryo sac.
Key words: Phaius tankervilliae (A iton) B l. ; esterase; acid phosphatase; ovule; polyacrylam ide gel
electrophoresis
胚珠发育作为高等植物有性生殖过程的一个重要环节 , 长期以来形态观察都是其重点研究内容
(林金星 等 , 2003)。为了更深入地了解胚珠发育过程中结构和功能的关系 , 20世纪 90年代 , 人们
开始围绕胚珠发育做了一些有关生理生化和遗传分析方面的工作 (Modruman et al. , 1994; Nadeau et
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al. , 1996; 王玲 等 , 1999; 杨弘远 , 1999)。然而 , 对胚珠发育的机理却仍不十分清楚。同工酶作为
基因表达的直接产物 , 它的变化与植物发育关系密切 (万海清 等 , 1998)。
绝大多数被子植物的胚珠在开花时已经发育成熟 , 且由子房壁包被 , 难以制备纯度较高的胚珠酶
提液 , 所以有关胚珠发育过程中同工酶的变化至今未见报道。鹤顶兰子房中有成千上万发育基本同步
的胚珠 , 且胚珠与子房壁极易分离 (李冬妹 等 , 2005, 2006)。作者运用聚丙烯凝胶电泳的方法 ,
对鹤顶兰 [ Pha ius tankervilliae (A iton) B l. ] 胚珠发育过程及受精前后同工酶的变化规律进行了研究。
1　材料与方法
供试材料为中国科学院华南植物园兰花园栽培的鹤顶兰 [ Phaius tankervilliae (A iton) B l. ]。
2005年 3—5月和 2006年 3—5月连续两年对同一批鹤顶兰进行人工异花授粉。授粉 10 d后每天
取样 1次 , 取子房中部的胚珠 , 用 1%戊二醛 (011 mol·L - 1磷酸缓冲液 , pH 618) 于室温下抽气固
定 4 h。磷酸缓冲液冲洗后 , 用 1%锇酸 4 ℃再固定 12 h。梯度酒精脱水 , 环氧丙烷过渡 , Epon812
常规方法包埋 , 玻璃刀半薄切片 , 厚度约 4μm , 015%的甲苯胺蓝溶液染色 , 光学显微镜下观察并照
相。
样品制备 : 结合多年对鹤顶兰胚珠发育形态学研究结果 (叶秀粦 等 , 1996; 李冬妹 等 , 2005,
2006) , 通过光镜检查确定胚珠发育的时期。镜检结果授粉天数与胚珠发育的时期密切相关 , 为了便
于描述均以授粉天数为标准。
取不同发育时期的胚珠 0102 g, 加入 011 mol·L - 1 pH 710的 Tris - 马来酸酐酶提液 120μL, 在
低温 (4 ℃) 下研磨成匀浆 , 10 000 ×g离心 2 m in, 取上清液。
同工酶电泳 : 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法 ( PAGE) , 对酯酶 ( Est)、酸性磷酸酶 (Acp )、淀粉
酶 (Amy)、过氧化氢酶 (Cat) 等同工酶进行了测定。具体操作方法参考文献 (W eeden & W endel,
1990; 孙新立 等 , 1996)。每种酶重复 3次试验。染色完毕 , 立刻用 N ikon 4500数码照相机照相。用
不同植株相同授粉日期的鹤顶兰胚珠进行 3次重复试验。
2　结果与分析
211　光学显微镜观察的结果
一般植物在开花时子房内已形成胚珠 , 胚珠内的胚囊也发育为成熟胚囊 , 蓼型胚囊通常为 7细胞
8核。兰科植物较特殊 , 开花时未形成胚珠 , 只有通过授粉后子房才开始膨大 , 启动胚珠原基的分
化 , 形成胚珠。
鹤顶兰授粉后的第 2天子房开始膨大发育 , 授粉后 10～15 d胎座形成许多指状突起 , 为胚珠原
基 (图版 , 1)。胚珠原基表皮下的一个细胞体积增大 , 分化为孢原细胞 (图版 , 2) , 内珠被在孢原
细胞分化后开始发育 , 内珠被基部的表皮细胞突起则发展为外珠被。
孢原细胞形成后 , 体积不断增大 , 授粉后大约 24 d时分化为大孢子母细胞 (图版 , 3) , 内外珠
被向珠孔方向生长。授粉后 27 d时大孢子母细胞经过减数分裂 (图版 , 4) , 形成两个大小不一的二
分体细胞 , 近珠孔端的细胞较小 , 合点端的细胞较大。二分体形成后 , 两个细胞先后进入减数分裂 ,
形成 4个大孢子 , 其中珠孔端的 3个迅速解体。授粉后 30 d, 合点端的 1个细胞发育为功能大孢子
(图版 , 5)。
功能大孢子随后进行第 1次有丝分裂 , 授粉后 35 d, 形成二核胚囊 , 两核之间出现一个大液泡
(图版 , 6)。二核胚囊形成后 , 很快便进入第 2次有丝分裂 , 形成四核胚囊 , 然后迅速进入第 3次有
丝分裂 , 授粉 41 d时 , 八核胚囊形成 (图版 , 7)。鹤顶兰八核胚囊发育成熟时 , 形成 7个细胞 8个
核。授粉 47 d时 , 已完成双受精作用 (图版 , 8)。授粉后 56 d, 早期球形胚形成 (图版 , 9)。
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　5期 李冬妹等 : 鹤顶兰胚珠发育过程及受精前后同工酶的变化 　
图版说明 : 1. 授粉后 10 d, 胎座形成许多指状突起。2. 授粉后 20 d, 胚珠原基表皮下的一个细胞体积增大 , 分化为孢原细胞。3.
授粉后 24 d, 大孢子母细胞时期 , 内外珠被已开始出现。4. 授粉后 27 d, 大孢子母细胞减数分裂中期。5. 授粉后 30 d, 功能大孢子
(黑箭头 ) 时期 , 珠孔端的 3个大孢子已经解体 (白箭头 )。6. 授粉后 35 d, 二核胚囊时期 , 两核 (白箭头 ) 之间出现一个大液泡。
7. 授粉后 41 d, 八核胚囊时期。8. 授粉后 47 d, 示合子与初生胚乳核。9. 授粉后 56 d, 早期球形胚阶段。
图版中所有图的珠孔端向下 , 合点端向上。1～8均为厚约为 3μm的半薄切片 , 经甲苯胺蓝染色 , 标尺 = 10μm。
Explana tion of pla tes: 1. The nucellar filament on 10 d after pollination. 2. An archesporial cell develop s from a subep idermal nucellar cell in
the nucellar filament on 20 d after pollination. 3. Megasporocyte, the outer and the inner integument begin to appear on 24 d after pollination. 4.
The metaphase of meiosis on 27 d after pollination. 5. Functional megaspore ( black arrowheads) , tree megaspore (white arrowheads) near the
m icropylar end have degenerated on 30 d after pollination. 6. 22nucleate embryo sac, there are a big vacuole between the two nuclei ( black arrow2
heads) after pollination 35 d. 7. 82nucleate embryo sac on 41 d after pollination. 8. Zygote and endosperm cell 47 d after pollination. 9. An early
globular embryo 56 d after pollination.
M icropylar downward in all p lates. Section thickness are about 3μm, stained with tuloidine blue ( TB) , bar = 10μm.
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212　胚珠发育过程中同工酶谱的变化
同工酶试验结果表明 : 鹤顶兰胚珠发育过程中同工酶种类不同 , 变化的差异程度不同。其中酯酶
和酸性磷酸酶 (图 1) 的变化与胚珠发育表现出较大的关联性 , 且重复性好 , 而淀粉酶 (Amy)、过
氧化氢酶 (Cat) 则表现出较大的保守性 , 磷酸葡萄糖异构酶 ( Pgi) 重复性不够理想。因此仅对酯酶
( Est) 和酸性磷酸酶 (Acp) 的变化情况进行分析。
为了便于观察 , 依照电泳图谱绘制了谱带模式图。图中 “1”为最远离阳极的位点 , 其余依次为
“2, 3⋯⋯”。
图 1　电泳结果 (左 ) 和谱带模式图 (右 )
a～j: 授粉后 10 d (指状突起 )、15 d (指状突起 )、20 d (孢原细胞 )、
24 d (大孢子母细胞 )、27 d (减分Ⅰ中期 )、30 d (功能大孢子 )、
35 d (二核胚囊 )、41 d (八核胚囊 )、47 d (初生胚乳核 )、
56 d (早期球形胚 )。
F ig. 1　The electrophorogram ( left) and chema tic illustra tion of isozym e ( r ight)
a - j: 10 d ( nucellar filament) , 15 d ( nucellar filament) , 20 d ( archesporial cell) ,
24 d (megasporocyte) , 27 d (metaphase of meiosisⅠ) ,
30 d ( functional megaspore) , 35 d (22nucleate embryo sac) ,
41 d (82nucleate embryo sac) , 47 d ( endosperm cell) and
56 d ( early globular embryo) after pollination.
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　5期 李冬妹等 : 鹤顶兰胚珠发育过程及受精前后同工酶的变化 　
　　为便于观察 , 把 Est和 Acp在不同阶段的变化情况归纳为表格形式 (表 1) , 酶谱出现以 “ + ”
表示。
表 1　酯酶和酸性磷酸酶在胚珠发育的不同阶段的变化情况
Table 1　The var iety of Est and Acp in d ifferen t stages of ovule developm en t
酶类
Isozyme
酶带
Band
指状突起
Nucellar
filament
10 d
指状突起
Nucellar
filament
15 d
孢原细胞
A rchespo2
rial cell
20 d
大孢子母
细胞
Megaspo2
rocyte
24 d
减分Ⅰ中期
Metaphase
of meiosisⅠ
27 d
功能大孢子
Functional
megaspore
30 d
二核胚囊
22nucleate
embryo sac
35 d
八核胚囊
82nucleate
embryo sac
41 d
初生胚乳核
Endosperm
cell
47 d
早期球形胚
Early globular
embryo
56 d
酯酶 1 + +
Est 2 + + + + +
3 + + + + + + + + +
4 +
5 + + + + + + + + +
6 + + + + + + + + +
7 + + + + + + + + + +
酸性磷 1 + +
酸酶 2 + + + + + + + + +
Acp 3 +
4 + + + + + + + + + +
5 + + + + + +
3　讨论
光学显微观察的结果表明 : 鹤顶兰授粉后大约 15 d分化形成胚珠原基 , 24 d后形成大孢子母细
胞 , 胚珠开始发育 , 授粉后 41 d八核胚囊形成 , 连续两年的观察结果基本一致。因取材地点不同 ,
香港与广州的气温有一定差异 , 栽培措施也不尽相同 , 这一结果比叶秀粦等 (1996) 报道的时间略
早。鹤顶兰一个花序大约有 30朵依次开放的花 , 每个子房内又有成千上万个发育基本的胚珠 , 鹤顶
兰的这一特征可以保证胚珠发育过程中同工酶研究的同源性 , 从而避免因个体差异导致的同工酶谱带
的变化。
作者通过研究鹤顶兰授粉后胚珠中 Est和 Acp的变化发现 : Est和 Acp的变化表现出一定的时期
特异性。Est27和 Acp24在整个发育过程中都有表达 ; 八核胚囊时期 (41 d) 同工酶变化最显著 , 这
一时期特异表达有 Est24和 Acp23, 而 Acp22则只在八核胚囊时期不表达。Est21只在八核胚囊时期和
大孢子母细胞减数分裂中期表达。Est和 Acp的这一变化说明与胚珠发育相关的一系列基因表达存在
明显的时序性 , 这一现象与 Nadeau等 (1996)、王玲等 (1999) 对蝶兰胚珠发育的基因调控的研究
结果比较相似 : 来自大孢子母细胞时期胚珠 cDNA文库的 cDNA , 其 mRNA在孢原细胞期、大孢子母
细胞时期、大孢子母细胞减数分裂期十分丰富 , 而在成熟胚珠中 , 则不再合成 , 而来自成熟胚珠 cD2
NA文库的 cDNA, 其 mRNA只在成熟胚珠中积累。至于位点 Est24、Acp22和 Acp23是否直接控制八
核胚囊的发育 , 有待于进一步研究 , 但可以为鹤顶兰胚珠发育分子调控的研究提供直接参考。
Est在代谢中能催化酯键的水解反应 (董爱华 , 2000) , 可能有转脂的作用 (林宏辉 等 , 1997)。
位点 Est23、Est26在授粉后开始表达 , 受精结束后 , 胚发育阶段 ( 56 d) 停止表达 ; Est22、Est25都
在孢原细胞时期 (15 d) 开始表达 , 不同的是 Est22在功能大孢子时期停止表达 , 而 Est25则表达一
直持续到胚发育阶段 (56 d)。Est不同位点的差别表达 , 可能是由于胚珠发育过程中脂代谢旺盛 , 内
膜系统变化大有关。Acp主要参与磷代谢的催化作用 , Joshi等 (1985) 研究正在分化的棉纤维细胞
的细胞核中的酸性磷酸酶 , 发现它可能参与细胞核中的核蛋白的脱磷酸化过程 , 进而影响基因转录的
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种类和数量。由此看来 , Acp22位点仅在八核胚囊时期不表达 , 而 Acp23位点仅在这一时期表达 , 可
能有着比较深远的遗传学意义。
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