全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (4) : 866～868
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 09 - 16; 修回日期 : 2005 - 12 - 22
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30170785) ; 黑龙江省博士后政府经费资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lyhshen@1261com)
‘津田 ’芜菁消减 cDNA文库的构建及分析
许志茹　李玉花 3
(东北林业大学生命科学学院 , 黑龙江哈尔滨 150040)
摘 　要 : 以 ‘津田 ’芜菁红色块根和白色块根为材料 , 利用 SSH技术成功构建了消减 cDNA文库并富
集相关基因片段。从消减文库中筛选到 960个阳性克隆 , PCR鉴定插入片段长度主要分布于 300～800 bp
之间。克隆测序后与 GenBank中的同源序列进行比较 , 特异基因片段为 302个 , 其中 99个与数据库中的序
列具有相似区域且功能已知 , 与数据库中序列没有显著同源性及功能未知的序列为 203条。
关键词 : 芜菁 ; SSH; 消减 cDNA文库 ; 差异表达基因
中图分类号 : S 634　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0420868203
Con struction and Ana lysis of‘Tsuda’Turn ip Subtracted cD NA L ibrary
Xu Zhiru and L i Yuhua3
(L ife Science College, N ortheast Forestry U niversity, Harbin, Heilongjiang 150040, Ch ina)
Abstract: A substracted cDNA library was constructed by using SSH technique to enrich related genes.
cDNA p repared from red root peel of‘Tsuda’turnip was used as tester, and that from white ones was used as
driver. 960 positive clones were got from the library. The inserted size was between 300 and 800 base pair as
it was determ ined by PCR method. After sequencing and clustering, 302 unique geneswere obtained. By run2
ning blastn p rogram of NCB I, 99 ESTs were found to have the homologous genes of the database with known
function, and 203 ESTs without remarkable homology or with unknown function.
Key words: Turnip; SSH; Subtracted cDNA library; D ifferentially exp ressed gene
1　目的、材料与方法
抑制性差减杂交 ( Supp ression subtractive hybridization, SSH ) 技术已成功地用于植物研究〔1, 2〕,
利用此技术可有效地分离花青素生物合成相关基因。花青素的合成既需要催化酶基因的表达〔3〕, 又
需要转录因子的调控〔4〕, 并且与光信号转导密切相关〔5〕。
本试验选用温室种植的 ‘津田 ’芜菁 (B rassica cam pestris L. ssp. rapifem Metzg. ‘Tsuda’) 自交
纯合系 , 生长过程中块根始终在土中避光。取膨大的未见光的白色块根进行日光光照处理。以处理后
的红色块根和未光照的白色块根为试材 , 提取块根皮总 RNA构建文库。
消减文库特异基因片段 PCR 扩增的引物序列为 : Nested p rimer 1 引物 , 5pi2TCGAGCGGCCGC2
CCGGGCAGGT23pi; Nested p rimer 2R引物 , 5pi2AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT23pi。Trizol RNA提取液 : 018
mol·L - 1盐酸胍 , 014 mol·L - 1硫氢酸铵 , 011 mol·L - 1醋酸钠 (pH 510) , 5%甘油 , 38% Tris - 饱和
酚。
利用 Trizol提取液提取总 RNA, 通过 mRNA purification kit分离纯化 Poly (A) + 。 cDNA合成和消
减杂交的具体步骤按 Clonetech PCR2selectTM cDNA Subtraction Kit操作手册进行。取 3μL纯化产物与
pGEM 2T载体连接 , 转化大肠杆菌 JM109, 通过蓝白斑筛选阳性克隆。随机挑选阳性克隆提取质粒 ,
以 Nested p rimer 1和 2R为引物进行 PCR扩增 , 鉴定消减 cDNA片段。测定质粒中插入片段的序列。
　4期 许志茹等 : ‘津田 ’芜菁消减 cDNA文库的构建及分析 　
选择 200 bp以上的序列提交 GenBank进行 BLAST分析。
2　结果分析与讨论
211　总 RNA的质量和消减杂交结果
提取的总 RNA在含有甲醛的变性凝胶上电泳 (图 1) , 28S和 18S条带的亮度比接近 2∶1, A260 /
280即 260 nm和 280 nm的吸光度比为 1184和 1191, 总 RNA完整性良好。消减杂交后的二次 PCR产
物凝胶电泳结果如图 2, 电泳图谱显示消减后的基因片段主要分布在 011～1 kb之间。
图 1　‘津田’芜菁总 RNA
1、2为试验方 , 3、4为驱动方。
F ig. 1　Tota l RNA of‘Tsuda’ turn ip
1, 2 is tester; 3, 4 is driver.
图 2　消减文库二次 PCR产物
F ig. 2　The second PCR product of subtraction library
212　消减文库中插入片段大小的鉴定
从消减 cDNA文库中随机挑取多个阳性克隆 , 提取质粒后用 Nested p rimer 1和 Nested p rimer 2R
为引物进行 PCR扩增。插入片段长度主要分布于 300～800 bp之间 (图 3) , 与 SSH预期的插入片段
大小吻合。
图 3　插入片段的 PCR产物
F ig. 3　PCR product of the in serted fragm en ts
213　基因序列相似性比较
序列测定后共得到 960条读序较好的序列。聚类后得到非重复序列 302个。通过上网比对 , 有
99个与网络数据库中的序列具有相似区域且功能已知 , 与数据库中序列没有显著同源性和功能未知
的序列有 203条。根据已有的关于植物代谢和胁迫状态下各种代谢途径之间复杂关系的报道 , 将消减
文库中获得的特异基因序列归纳为花青素生物合成基因 ( PAL、CHS、F3H、D FR和 AN S )、转录因子
基因、活性氧清除基因、翻译调控因子基因、胁迫抗性基因、跨膜运输和离子动态平衡相关蛋白基
因、信号传导基因、光合作用基因、细胞结构和发育蛋白基因、细胞代谢相关基因。其中编码 PAL
(DQ167187)、CHS (AY935256 )、 F3H (DQ167185 )、DFR (DQ167184 )、WD - 40 (DQ167189 )、
cytochrome P450 (DQ167182)、 cytochrome P450 98A3 (DQ167183)、Myb (DQ167186) 和 Transcrip2
tion factor L IM (DQ167188) 的基因片段已经登录。表 1例举了筛选到的花青素生物合成过程中催化
酶的基因片段。
‘津田’芜菁的膨大块根经日光照射后 , 主要的表型变化是块根皮变成紫红色 , 合成花青素 , 这
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与花青素生物合成途径中关键催化酶基因的表达直接相关。另外 , 花青素的合成也与糖类物质存在相
关关系 , 涉及到细胞内的基础代谢途径〔6〕。目前已有报道证明谷胱苷肽 S转移酶 ( Glutathione2S2
transferase, GST) 和细胞色素 P450家族的酶类在特殊的化学反应过程中参与花青素的生物合成〔7, 8〕。
除了花青素生物合成催化酶基因之外 , 消减文库中筛选到的其他特异表达的基因片段是否与花青素合
成直接相关还需进一步验证。
表 1　消减文库中部分花青素生物合成相关的基因片段 3
Table 1　Som e gene fragm en ts rela ted to an thocyan in b iosyn thesis in subtracted library
基因 ID
Gene ID
B lastX分析结果
Result of B lastX analysis
期望值
Expect
相似程度
Positives ( % )
30690175 Cytochrome P450, putative (A rabidopsis thaliana) 2e269 87 (235 /268)
42570397 Cytochrome P450 98A3 (A rabidopsis thaliana) 2e286 89 (271 /304)
19310726 Phenylalanine ammonialyase (A rabidopsis tha liana) 7e242 83 (250 /301)
2642605 Chalcone synthase (R aphanus sa tivus) e2139 90 (401 /444)
30693436 Flavanone 32hydrocylase (A rabidopsis tha liana) e2116 87 (414 /475)
29423732 D ihydroflavonol 42reductase (B rassica oleracea) e2159 97 (310 /318)
29423728 Anthocyanidin synthase (B rassica oleracea) 2e233 91 (352 /387)
　　3 花青素生物合成基因 Anthocyanin biosynthesis
本研究利用 SSH技术构建了津田芜菁消减文库 , 同时结合基因的序列比对结果 , 对光下特异表
达的基因进行分析 , 这将为大规模筛选花青素生物合成的相关基因 , 探讨依光型花青素的合成机理奠
定基础。
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