全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (4) : 935 - 940
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 12 - 30; 修回日期 : 2007 - 03 - 12
基金项目 : 科技部资助项目 (2004EP090020)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhangjx1210@yahoo1com1cn)
黑木耳栽培菌株的 ISSR分析
李辉平 , 黄晨阳 , 陈　强 , 张金霞 3
(中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 应用锚定 ISSR技术对 21个栽培黑木耳 (A uricu laria auricu la) 菌株进行了遗传多样性研究。
从 20个引物中选出 10个 ISSR引物 , 扩增得到 185个扩增位点 , 大小分布在 200～3 000 bp之间 , 其中多态
性位点 181个 , 多态性位点占 97184% , 表明 ISSR标记的多态性非常高。平均每个位点的观察等位基因数
(N a) 为 119784, 每个位点的有效等位基因数 (N e) 为 112396; 菌株间平均 N ei基因多样性 ( h ) 为
012732, Shannon信息指数 ( I) 为 014278。N ei (1972) 遗传距离矩阵分析表明 21个黑木耳菌株间遗传距
离在 0136到 0155之间 , 基因流 (Nm ) 达到 217528, 表明我国栽培黑木耳的遗传背景十分丰富 , 遗传多样
性很高 , 同时表明我国各地域间栽培黑木耳菌株存在着很大的菌种交流。
关键词 : ISSR; 胶质菌 ; 遗传多样性 ; 遗传标记
中图分类号 : S 64616　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0420935206
ISSR Ana lysis of Cultiva ted A u ricu la ria au ricu la
L I Hui2p ing, HUANG Chen2yang, CHEN Q iang, and ZHANG J in2xia3
( Institu te of A gricultural Resources and Reg ional P lann ing, Chinese A cadem y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, China)
Abstract: Genetic diversity was assessed in 21 cultivated strains of A. au ricu la by ISSR ( inter simp le
sequence repeats). Ten p rimers were screened out from twenty ISSR p rimers in this study. One hundred and
eighty five loci were p roduced from the p rimers, of which 181 loci (97184% ) were polymorphic in the organ2
ism. The size of these loci ranged from 200 bp to 3 000 bp. H igh genetic diversity of A. auricu la in China was
detected: the observed number of alleles (N a) averaged 119784 and the effective number of alleles (N e) was
112396, for every locus; Neipis genetic diversity ( h) was estimated to be 012732, while Shannonpis information
index ( I) was 014278, on average1 The Neipis ( 1972) genetic distance among strains ranged from 0136 to
0155, but the gene flow (Nm ) was 217528. Analysis showed that there were high genetic diversity and large
spawns exchange among p rovinces for A. auricu la in China.
Key words: ISSR; Jelly fungus; Genetic diversity; Genetic marker
黑木耳 [A uricu laria auricu la (L. ex Hook. ) Underwood ] 在我国已有 1 400多年的栽培历史 , 目前
其栽培遍布 20多个省 (市、区 )。经历长期的栽培 , 黑木耳在人工和自然的双重选择下 , 形成了不
同农艺性状的栽培菌株 , 但与绿色植物和伞菌类食用菌相比较 , 黑木耳子实体形态差异小 , 以形态辨
别栽培菌株相当困难。
近年来随着分子生物技术的发展 , 已有很多分子标记方法运用到木耳属的遗传分析中。边银丙等
(1998, 2000) 利用脉冲场凝胶电泳对 3株木耳染色体 DNA进行分析 , 认为双核体菌株间染色体大小
存在着多样性 ; 后来对 10株木耳栽培菌株酯酶同工酶的分析也表明其酶谱存在丰富的多样性。阎培
生等 (1999) 对木耳属 8个种 rDNA的 ITS和 28S区域的 RFLP研究表明 , 这个区域种间有较强的保
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
守性 ; Yan等 (2002) 利用 RAPD标记探讨了木耳属 8个种的分子系统发育关系 , 将 8个种分为 3
组。对于我国黑木耳的主要栽培菌株尚未见到较全面的种质分析和分子遗传学评估的报道。
微卫星在真核基因组中广泛分布 (Roder et al. , 1998) , 使得在此基础上建立的 ISSR技术 ( Ziet2
kiewicz et al. , 1994) 具有丰富的扩增多态性 (Nagaoka & Ogihara, 1997) , 在作物品种鉴定 ( Fang &
Roose, 1997) 和多样性分析 (Joshi et al. , 2000; 杜金昆 等 , 2002) 中应用日益广泛。
本研究中收集了我国黑木耳主产区 46个栽培菌株 , 经栽培性状观察、对峙反应、酯酶同工酶分
析等多种方法进行区别性鉴定 , 剔除了同物异名菌株 25个 , 将具区别性的栽培菌株进行了 ISSR分
析 , 目的在于调查我国黑木耳栽培菌株的多样性 , 为黑木耳菌株的鉴定鉴别和种质资源的评价提供技
术和方法。
1　材料与方法
111　供试菌株
供试菌株 21个 (表 1) , 主要收集于我国的湖北、陕西、吉林和黑龙江等黑木耳主产区 , 分别保
藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心 (ACCC) 和本实验室。
表 1　供试菌株
Table 1　Tested stra in s of A. au ricu la
编号 Code 菌株 Strain 来源 O rigin 保藏号 Conservation No.
1 薛平 10 Xuep ing 10 湖北南漳 Nanzhang, Hubei ACCC 51019
2 793 湖北房县 Fangxian, Hubei ACCC 51023
3 沪耳 3 Hupier 3 陕西宁强 N ingqiang, Shaanxi ACCC 51025
4 黄天菊花 Huangtian Juhua 湖北南漳 Nanzhang, Hubei ACCC 51027
5 9721 陕西西乡 Xixiang, Shaanxi ACCC 51043
6 9724 陕西留坝 L iuba, Shaanxi ACCC 51045
7 26 湖北 Hubei ACCC 51048
8 9703 陕西留坝 L iuba, Shaanxi ACCC 51049
9 9722 陕西留坝 L iuba, Shaanxi ACCC 51050
10 延 7 Yan 7 吉林延边 Yanbian, J ilin ACCC 51051
11 天桥岭 Tianqiaoling 吉林天桥岭 Tianqiaoling, J ilin ACCC 51083
12 长城 1号 Changcheng 1 吉林延吉 Yanji, J ilin ACCC 51086
13 草优 1号 Caoyou 1 黑龙江 Heilongjiang ACCC 51087
14 Au 004 黑龙江哈尔滨 Harbin, Heilongjiang ACCC 51089
15 8712 黑龙江 Heilongjiang ACCC 51092
16 88016 内蒙古 InnerMongolia ACCC 51094
17 9910 黑龙江 Heilongjiang ACCC 51095
18 长白山 7号 Changbaishan 7 吉林延边 Yanbian, J ilin Lab 00070
19 176 黑龙江牡丹江 Mudanjiang, Heilongjiang Lab 00082
20 RF 172 陕西 Shaanxi Lab 00069
21 A5 黑龙江哈尔滨 Harbin, Heilongjiang Lab 00075
112　D NA的提取
用马铃薯葡萄糖液体培养基 , 25℃避光培养 , 纱布过滤收集菌丝体。采用 CTAB法提取基因组
DNA (Lee & Taylor, 1990) , 018%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量 , 紫外分光光度计检测 DNA浓度 ,
于 - 20℃保存。
113　 ISSR扩增
ISSR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 , 引物序列参照加拿大哥伦比亚大学
(UBC) 公布的 ISSR引物序列 , 确定了重复单元后自主设计锚定碱基序列。
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　4期 李辉平等 : 黑木耳栽培菌株的 ISSR分析 　
PCR反应体系 : 约 50 ng DNA模板 , 1 ×Ex Taq buffer, 4种 dNTP各 012 mmol/L, 014μmol/L引
物 , 1 U Ex Taq (大连宝生物 ) , 双蒸水补充到 20μL。使用 B iorad iCycler (B iorad, USA ) 循环扩增
仪 , 94℃预变性 4 m in; 94℃变性 1 m in, 55℃复性 1 m in, 72℃延伸 2 m in, 35个循环 ; 72℃ 10
m in; 4℃终止反应。
114　电泳和染色
电压 4 V /cm, 114%琼脂糖凝胶电泳 , EB (溴化乙锭 , 015μg/mL ) 染色 , 凝胶成像系统 (B io2
rad, USA) 照相、记录并观察。
115　数据处理
重复试验中稳定出现的条带用于数据分析 , 根据各分子标记的迁移率及其有无统计二元数据 , 染
色结果中条带的有无分别记为 1和 0。由 POPGENE 1132计算平均每个位点的观察等位基因数 (N a)、
平均每个位点的有效等位基因数 (N e)、Nei平均基因多样性 ( h ) 和 Shannonpis信息指数 ( I) (Le2
wontin, 1972; Nei, 1973; Yeh et al. , 1997)。由 NTSYSpc 2110e按 Nei计算菌株间遗传距离 , 基于
此遗传距离再按算数平均数的非加权成组配对法 (UPGMA 方法 ) 聚类分析 (Nei, 1972; Rohlf,
1998)。
按地理区域来源将菌株分组 , 数据利用 POPGENE 1132计算各组之间 Nei的遗传距离和基因流
(Nm )。
2　结果与分析
211　扩增图谱
本试验使用了 20个引物 , 其中 10个引物扩增条带清晰 , 反应稳定 , 多态性丰富 (图 1)。将其用
于供试菌株 DNA样品的扩增 , 每个引物均多次重复 , 以保证数据采集和分析的准确。结果表明 , 10
个引物将供试菌株共扩增出 185个位点 , 大小分布在 200～3 000 bp之间 , 其中多态性位点 181个 ,
占 97184% , 有 6个引物多态性达到 100% , 其他 4个引物的扩增多态性也都在 85%以上 (表 2)。
图 1　引物 P9和 P8对 21个黑木耳 ( A. au ricu la ) 菌株的扩增图谱
上 : P9扩增图谱 ; 下 : P8扩增图谱。1～21: 菌株编号 ; M: 22Log DNA ladder (NEB)。
F ig. 1　 ISSR prof iles from P9 and P8 for 21 stra in s of A. au ricu la
Up: Profiles from P9; Below: Profiles from P8. 1 - 21: Code of strains; M: 22Log DNA ladder (NEB).
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表 2　 ISSR引物序列和扩增位点统计
Table 2　Sequence of ISSR pr im ers and the ir num ber of am plif ied loc i
引物
Primer
序列
Sequence
扩增位点数
Number of amp lified loci
多态性位点数
Number of polymorphic loci
多态性比例
Percentage of polymorphic loci( % )
P1 TGC (AC) 6 12 12 100
P2 GTG(AC) 6 　7 　7 100
P6 A ( GT) 7 　7 　7 100
P7 CCA ( GTG) 4 23 22 95165
P8 GGA ( GTG) 4 19 18 94173
P9 (AG) 8 G 37 37 100
P12 (AG) 8 GC 16 15 93175
P14 (AC) 8 CG 24 24 100
P17 (AC) 8 　9 　8 88189
P18 (AC) 8 C 31 31 100
总计 Total 185 181 97184
212　遗传分析
由 POPGENE 1132计算得到平均每个位点的观察等位基因数 (N a) 为 119784 ( SD = 011458 ) ,
平均每个位点的有效等位基因数 (N e) 为 112396 ( SD = 012517 ) , Neipis基因多样性 ( h ) 平均为
012732 (SD = 011340) , Shannonpis信息指数 ( I) 为 014278 ( SD = 011789) , 表现出较高的遗传多样
性水平。
应用 NTSYSpc 2110e软件计算菌株间的 Nei遗传距离为 0136～0155。应用 UPGMA方法进行的遗
传距离聚类分析结果见图 2。
图 2　21个黑木耳 ( A. au ricu la ) 菌株 UPGM A树状图
F ig. 2　D endrogram s of UPGM A ana lysis of 21 A. au ricu la stra in s
总体看来 , 各产区都有各自的主栽菌株类型 , 但是也显然存在着产区间菌种的交换和交流。菌株
之间尽管有按产区分组的趋势 , 如来自地理位置相近的黑龙江和吉林的菌株大部分分布在同组中 , 陕
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西和湖北菌株也大部分在同一组中 , 但并不完全
吻合。
人为地将各地菌株分成小组作为群体 , 用
POPGENE 1132进行遗传关系和基因交流 , 结果
表明 , 各省之间菌株的遗传距离很小 , 全部小于
011, 在 0101～0105 (表 3) ; 而各省之间菌株基
因流 (Nm ) 值较大 , 为 217528。 表 3　黑木耳各省 Nei的遗传距离Table 3　Ne ipis genetic d istances am onggroups of A. au ricu la组 Group 湖北 Hubei 陕西 Shaanxi 吉林 J ilin陕西 Shaanxi 010265吉林 J ilin 010490 010464黑龙江 Heilongjiang 010283 010107 010305
3　讨论
本试验结果表明 , ISSR在黑木耳栽培菌株中扩增多态性高 , 用较少的引物即可得到多态性丰富
的条带 , 可用于黑木耳栽培菌株种质遗传多样性分析和种质评价。
食用菌栽培菌株的遗传学研究主要集中在香菇、双孢蘑菇、金针菇和糙皮侧耳 , 而黑木耳栽培菌
株遗传多样性研究较薄弱 , 目前尚未见到相关报道。龚利娟等 ( 2005 ) 对 32 个中国栽培香菇
(L en tinu la edodes) 品种进行 RAPD分析 , 结果表明栽培菌株间的遗传距离在 013～015。詹才新等
(1998) 对我国 9个主栽双孢蘑菇 (A ga ricus bisporus) 菌株 RAPD 分析表明其遗传距离相似性为
85%。詹才新等 (1995) 对 9个金针菇 ( F lamm ulina velu tipes) 菌株的 RAPD分析表明菌株间遗传距
离在 0111～0171。孟宇等 (2003) 对 14株产自不同地区的糙皮侧耳 ( P leu rotus ostrea tus) 的 AFLP分
析表明其遗传距离差异较大 , 为 0119～0175。
本研究与此类研究结果相似 , 我国栽培黑木耳菌株间 Nei遗传距离在 0136～0155之间。这表明
虽然黑木耳子实体形态分化的多样性远低于各种伞菌类食用菌 , 但是其遗传背景也是非常丰富的。
黑木耳在我国分布广泛 , 目前只有青海、内蒙古、宁夏未有野生分布的记载 (卯晓岚 , 1998) ,
这表明黑木耳种群具有广泛的适应性。据此 , 我们推测 , 黑木耳虽然形态差异相对较小 , 但是遗传学
的差异应该是显著的 , 这种差异可能更多地体现在生理学特性上 , 如色素的形成、对环境条件的反应
等。
我国黑木耳主要栽培菌株几乎完全来自野生样本的分离驯化 , 具有野生样本特有的群体地域性。
黑木耳主产区与野生分布基本一致 , 传统的黑木耳主产区基本都是黑木耳野生分布较多的地区 , 如湖
北、陕西、四川、吉林和黑龙江等。这种地域性也可从子实体的形态得以表现 : 中部地区野生子实体
色泽较浅 , 从浅黄褐色到红褐色 , 耳片较薄且柔软 ; 东北产区的子实体色泽较深 , 呈黑褐色 , 耳片较
厚。
但是 , 本试验没有得出菌株完全按产区聚类的结果 , 这可能与栽培菌株的跨省区交流有关。20
世纪 90年代中期 , 中国黑木耳代料栽培技术成熟后 , 传统的黑木耳栽培区域被打破 , 栽培区域迅速
扩大 , 目前已扩大到全国 20多个省 (市、区 )。随着栽培的不断扩大 , 栽培者对新品种的需求加大 ,
为了获得更好的栽培效益 , 栽培者常多方购种 , 增加了黑木耳种质的基因交流。
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