全 文 ：园 艺 学 报 2007，34 (6)：1353—1360
Acta Horticulturae Sinica
新高系梨 10个品种 S基因型的鉴定
袁德义 ，谭晓风 ，张 琳 ，赵思东 ，
(‘中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，
兴城 125100)
乌云塔娜 ，段经华 ，曹玉芬
长沙 410004；。中国农业科学院果树研究所，辽宁
摘 要：以亲缘关系极近的新高系梨 10个品种及被视为 ‘新高’梨亲本的 ‘天之川’和 ‘今村秋 ’
梨等为试验材料，对其基因组 DNA进行了 PCR—RFLP检测、DNA序列测定及生物信息学分析。结果表
明：新高系梨 10个品种即 ‘新高’、 ‘黄金’、‘水晶’、‘早生黄金 ’、‘早蜜新高’、 ‘天皇’、‘金秋 ’、
‘晚大新高’、‘农家新高’和 ‘鲜黄’的 S基因型分别为 ．s S 、．s S 、．s S 、．s S 、．s S。、．s S 、．s S 、
．s S 、．s S 和 S S ；‘天之川’、‘今村秋 ’的S基因型分别为 S。S 和 S。S ，通过基因型判定 ‘今村秋 ’非
‘新高’梨的父本。
关键词：梨；砂梨 ；新高系梨 ；自交不亲和性 ；S基因型；鉴定
中图分类号：S 661．2 文献标识码：A 文章编号 ：0513-353X (2007)06—1353-08
Identification of S-genotype of Ten Cultivars from Niitaka Line Pear
YUAN De-yi ，TAN Xiao-feng ，ZHANG Lin ，ZHAO Si．dong ，WUYUN Ta．na ，DUAN Jing．hua ，and
CAO Yu．fen
(’The Key Laboratory ofNon—wood Forest Product of Forestry Ministry，Central—South ofForestry and Technology University，
Changsha 410004，China； Fruit Tree Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Xingcheng，Liaoning
125100，China)
Abstract：Ten cuhivars with extremely close relationship from Niitaka line pear were used as materials
for S-genotyping．In addition．two cuhivars‘Imamuraaki’ and ‘Amanogawa’that were considered to be the
parents of‘Niitaka’were also included．PCR—RFLP analysis of genomic DNAs of the 1 2 cultivars．nucleo-
tide sequencing of amplifed fragments and sequence analysis were performed．As the results，the ten cuhivars
of Nitaka line were genotyped as folows：‘Nitaka’ (S3S9)，‘Whang Keum Bae’ (S3S4)， ‘Sujeong’
(S3S9)，‘Joseng Whang Keum’ (S3S4)，‘Soumi Tunitaka’ (S3S9)，‘Yewang’ (S3S9)，‘Jinqiu’
(S3S9)，‘Banndai Nitaka’(S3S9)，‘Noka Nitaka’(S3S9)，and‘Sunhwang’ (S3S5)．The S-genotype
of‘Amanogawa’and ‘Imamuraaki’was identified as Sl S9 and Sl S6，respectively，suggesting that‘Imam-
uraaki’is unlikely to be the polen parent of‘Niitaka’．
Key words：Pear；Pyrus pyrifolia；Nitaka line pear；Self-incompatibility；S-genotype；Identifcation
植物的自交不亲和性 (self-incompatibility)是指能产生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌
雄同株植物，在自花授粉或相同基因型异花授粉时不能受精的现象 (孟金陵 等，1997)。它是植物
实现异花授粉，防止近亲繁殖和退化、保持种内遗传变异性的一种重要机制，在植物生殖生物学和杂
交优势利用方面有着重要的理论和实践价值。
收稿日期：2007—05—07；修回日期：2007一o9—3O
基金项目：国家林业局重点项目 (2006-12)；国家 ‘948’项目 (2001—36)
通讯作者 Author for co~espondence(E-mail：tanxiaofencn@yahoo．com．ca)
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梨 (Pyrus pyrifolia)属配子体自交不亲和 (gametophytic serf-incompatibility，GSI)果树，其 自交
不亲和性是由一个基因位点 (S位点)的复等位基因 (self-incompatibility alele，简称 S．alele)所控
制，表现为白花授粉或相同s基因型品种间异花授粉时，花粉虽能在柱头上萌发，但在花柱中生长被
抑制而不能到达胚囊完成受精，造成白花授粉或相同s基因型品种间异花授粉不能结实 (Anderson et
a1．，1986)。目前生产上主要采用配置授粉品种的方法来克服梨品种的自交不亲和，以保证高产稳
产。因此，研究梨的s基因和确定梨品种的s基因型，对于避免授粉品种选择过程中的盲目性，科学
合理地进行栽培品种配置显得非常重要。
从 1993年至今，日本和韩国学者率先对砂梨 (Pyrus p~ifolia Nakai)的自交不亲和性进行了大量
的品种间杂交和分子生物学研究，分离鉴定出了9个 s等位基因 (Norilka et a1．，1996；Ishimizu et
a1．，1998)，并根据梨 s ～s。一等位基因 HV区和内含子序列的差异，建立了从基因组 DNA水平上
快速检测砂梨 sl～s9一等位基因 PCR—RFLP系统 (Ishimizu et a1．，1999；佐藤昭宏，2001；Kim et
a1．，2002)。
近年来，国内对梨的自交不亲和性及 s基因型鉴定方面也开展了系统研究 (谭晓风 等，2005a，
2005b，2006；Tan et a1．，2007；袁德义 等，2007)，但还没见对新高系梨这一重要砂梨种质开展 s
基因型系统研究的报道。
作者以亲缘关系极近的新高系梨1O个品种即 ‘新高’、‘黄金’、‘水晶’、‘早生黄金’、‘早蜜
新高’、‘天皇’、‘金秋’、‘晚大新高’、‘农家新高’、‘鲜黄’及被认为是 ‘新高’梨亲本的 ‘天
之川’和 ‘今村秋’等的s基因型的确定为目标，开展了分子生物学的研究，其结果可为分析梨的s
基因遗传变异特性和丰产栽培提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 植物材料
新高系梨是指以 ‘新高’梨为材料通过人工杂交和芽变选育的系列品种。本试验所用材料 (表
1)采 自中南林业科技大学株洲校区校内教学试验基地梨品种园和中国农业科学院果树研究所 (辽宁
兴城)梨资源圃。．
各材料采集嫩叶500 g，放于液氮中带回实验室，一70~C冷冻保存。
表 1 s基因型试验研究使用的试材
Table 1 Materials for analysis of S·genotypes in pear
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6期 袁德义等：新高系梨 10个品种 S基因型的鉴定
1．2 引物和试剂
梨．s基因由5个保守区、1个高变区及 1个内含子组成 (图1)。而梨 ．s等位基因的多态性主要来
自于高变区 (HV)的变异，且高变区是识别花粉配体的部位，因此根据高变区的不同来鉴定不同的
．s等位基因 (乌云塔娜，2003；乌云塔娜 等，2006)。
—一 FTQQYQ’
墅薹 ! ! l： ![ r ] T 正
anti-(iyr1IWPNV’ ·——一
图1 梨S基因结构及引物的位置
HV：高变区；C1～C5：保守区；E：外显子。
Fig． 1 The gene structure of pear S—RNase and its primer locations
HV：Hyper variable region；C1一C5：Consen,ed regions：E：Exon．
根据报道的梨 ．s．一S9-RNase基因 HV区两段的保守序列，本次试验设计引物序列分别为：P1：
‘FrQQYQ’ (5 一Tn1ACGCAGCAATATCAG一3 )，P2： ‘anti一(I／T)IWPNV’ [5 一AC (A／G)TY(C／
T)GGCCAAATA (A／G)TY．3 ]。
限制酶、Taq DNA聚合酶、h／HindⅢ digest DNA Ladder与TA克隆载体购自日本 TAKARA公司。
DNA回收试剂盒 Gene Clean lI Kit购自日本 BIOIO1公司。其它生化试剂和常规试剂均为超纯或分析
纯。高保真酶 KOD—Plus．Polymerase system购自日本 TAKARA公司。
1-3 基因组 DNA的提取和纯化
基因组 DNA提取采用改良的 CTAB方法 (谭晓风 等，1999)，纯化采用乌云塔娜 (2003)纯化
梨 DNA的方法。
1．4 PCR扩增
PCR扩增参照乌云塔娜(2003)的PCR扩增反应体系和循环条件。
1．5 PCR—RFLP系统检测
由于新高系梨品种基本上为日本梨品种或亲本来自日本梨，因此根据 日本神户大学建立的PCR—
RFLP方法，按照限制酶说明书用各种能识别惟一等位基因的限制性核酸内切酶切割所扩增的片段，
然后依据各种限制性核酸内切酶能否切割及切割片段长度多态性来确定其 ．s等位基因。表 2是 ．s。一
S9-RNase基因的 PCR—RFLP检测系统。
表 2 sl～s9一等位基因PCR—RFLP检测系统
Table 2 The identifying system of Sl—S9-allele by PCR —RFLP
S等位基因 大小 特异限制酶
S-alele Size(bp) Special enzyme
酶切片段大小 识别位点
Size of digested fragments(bp) Recognition site
I
Aft1I
PpuM I
Nde I
PpuM I．AlwN I
nC1I．Acc1I
Acc1I
S厂c I，Acc1I，Nru I
Nde I． ￡B I
C TpuPyAG
C TTAAG
PrG GPwC Cpy
CA TA TG
PrG GPwC Cpy；CAGNNN CTG
GTPy PuAC：CG CG
CG CG
C TpuPyAG：CG CG；TCG CGA
CA TA TG：TI" CGAA
l 7 6 5
7 l 8 5
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1．6 高保真酶扩增及目的片段的回收、克隆和测序
高保真酶扩增及 目的片段的回收分别依照 KOD—Plus Polymerase system和 Gene CleanⅡKit的说明
书进行。将回收的目的片段连接至 pMD18一T克隆载体，选择阳性克隆进行质粒 PCR检测。挑选含 目
的片段的菌液 1 mL送至上海基康生物技术公司进行序列测定。
1．7 生物信息学分析
用 Chromas 3．25软件打开测序图，去掉两段难以确定的序列号和未测出的序列 N，同时打开上游
引物测序图和下游引物测序图，将双向测序图按碱基顺序逐一比较，并按照碱基互补原则相互校正，
使正反向测序结果完全一致。对所得到的s基因序列采用 BLAST软件与 GenBank+EMBL+DDBJ+
PDB中的 “S ～S9-RNase基因”进行同源性比较，确定其基因型。
2 结果与分析
2．1 新高系梨品种 基因的扩增
采用 s等位基因特异性引物 ‘FTQQYQ’和 ‘anti一(I／T)IWPNV’分别对 12个梨品种的基因组
DNA进行 PCR扩增，其结果如图2所示。每个品种分离得到了 1或 2个 s基因特异 DNA片段，分别
约为370 bp和 1 300 bp。12个品种中有 8个品种可扩增出明显的两条带，其余 4个品种 ‘黄金’、
‘早生黄金’、‘鲜黄’和 ‘今村秋’只扩增出一条带，说明这4个品种的S等位基因片段大小可能相
差不大，较难确定其 S基因型。
bp
1 400
l 300
500
400
300
200
100
图2 新高系梨品种s基因特异性引物 PCR扩增
1．新高；2．黄金；3．水晶；4．早生黄金；5．早密新高；6．天皇；7．金秋；
8．晚大新高；9．农家新高；lO．鲜黄；l1．今村秋 ；12．天之川。
Fig．2 Genomic PCR ampfificafion of S·RNase fragments from Niitaka line pears
1．Nitaka；2．Whang Keum Bae；3．Sujeong；4．Joseng Whang Keum；
5．Soumi Tuniitaka；6．Yewang；7．Jinqiu；8．Banndai Niitaka；
9．Noka Niitaka；10．Sunhwang；l1．Imamuraaki；
12．Amanogawa．
2．2 限制酶酶切检测 (PCR—RFLP)
采用S ～S9-RNase的特异性限制酶对产生单带产物的4个品种 ‘黄金’、‘早生黄金’、‘鲜黄’
和 ‘今村秋’的PCR产物进行酶切消化分析。
结果表明，‘黄金’、‘早生黄金’和 ‘鲜黄’的370 bp左右的片段可被 $3-RNase特异性限制酶
PpuM I切割，产生 107 bp和 270 bp的片段 ，因此可以确定这 3个品种中含有一个 S3-RNase基因。
‘黄金’和 ‘早生黄金’的另一个 370 bp左右的片段同时也能被 S4-RNase的特异性限制酶Nde I切
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割，产生 140 bp和228 bp的片段，由此可以确定这两个品种同时还含有一个 s ．RNase基因 (图3)。
‘鲜黄’梨的370 bp左右的片段也可被 s 一RNase的特异性限制酶 AlwN I切割，产生 106 bp和271 bp
的两个片段，可判断该品种含有一个 S5-RNase基因。 ‘金村秋’的370 bp左右的片段可被 S．RNase
和S6-RNase两种特异性限制酶切割：S。一RNase特异性限制酶 S厂c I切割，产生 135 bp和 232 bp的片
段，可以确定其含有一个 S。一RNase基因；被 s 一RNase特异性限制酶 Hinc I切割，产生 133 bp和 214
bp的片段，可以确定这个品种含有一个 S6-RNase基因 (图3)。
由此通过PCR—RFLP方法，确定 ‘黄金’、‘早生黄金’、‘鲜黄’和 ‘今村秋’4个品种的s基
因型分别为：S S4、S S4、S S 和SlS6。
500
400
300
200
100
图3 新高系梨PCR产物特异限制性内切酶酶切分析
M：Marker；1．黄金，Pt)uM I；2．黄金，Nde I；3．早生黄金，PpuM I；
4．早生黄金，Nde I；5．鲜黄，PpuM I；6．鲜黄，AlwN I；
7．今村秋 ， I；8．今村秋，HincI。
Fig．3 Restriction digestion analysis of PCR products from Niitaka line peal"
M：Marker；1．Whang Keum Bae。PpuM I；2．Whang Keum Bae，Nde I；
3．Joseng Wwhang Keum。Pt)uM I：4．Joseng Whang Keum，Nde I；
5．Sunhwang，PpuM I；6．Sunhwang，AlwN I；
7．1mamuraaki，Sfc I；8．Imamuraaki，Hinc I．
2．3 S．RNase基因的序列比对分析
对含有两个扩增片段的8个品种即 ‘新高’、‘水晶’、‘早蜜新高’、‘天皇’、‘金秋’、‘晚大新
高’、‘农家新高’和 ‘天之川’所分离的扩增片段进行回收和测序，并对获得的序列在NCBI(htp：
∥WWW．nebi．nlm．nih．gov)上进行 BLAST分析。结果发现，这8个品种的 1 300 bp左右的片段为同一
基因，与 s。完全吻合；‘新高’、‘水晶’、‘早蜜新高’、‘天皇’、‘金秋’、‘晚大新高’、‘农家新
高’7个品种的370 bp左右的片段为同一基因，与s，完全一致；‘天之川’370 bp左右的片段则与s。
相同。因而确定这 8个品种中含 s。、s，、s 等3个 s等位基因。
通过生物信息学软件对这 3个 s等位基因进行 DNA序列 比对分析，发现其完全符合梨 s—
RNase基因序列特征 ：试验使用的引物 P1和 P2(图4)间的序列包括了梨 S-RNase基因典型的保
守区 1(C1)、保守区 2(C2)和高变区 (HV)，其中高变区中插入了一段内含子 (Intron)。另
外，将测序获得的 s。基因组序列与 GenBank中的s9eDNA (GenBank登录号 AB104909)序列相 比
较，确定了其内含子序列 (图4)。该内含子序列的边界序列符合双子叶植物内含子／外显子保守
的边界序列特征 (5 GT⋯⋯AG3 )(图5)。这进一步证明我们扩增的PCR片段即为梨 S-RNase基
因
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TTTACGCAGCAATATCAGCCGGCCGTATGCAACTCTAATCCTACTCCTTGTAACGATCCTACTGACAAG
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S。内含子：
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图4 克隆的s1、s3、s9等位基因 DNA序列比对图
斜体字母为确定的s。基因内含子序列。
Fig．4 Aliment of DNA sequences for S1，S3 and S9-alleles cloned
halices indicate the nucleotide sequences of S9-allele intron．
160 327
T C a g a G G T A A T A T T c a g A t A a
图5 梨 S1～S9-RNase基因外显子／内含子边界序列
Fig．5 The flanking sequences of exons／introns of pear S1一s9‘RNase
一 ：3l
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6期 袁德义等：新高系梨 l0个品种S基因型的鉴定 l359
3 讨论
(1)本研究通过 PCR—RFLP系统检测和序列测定分析，确定新高系梨 10个品种 ‘新高’、‘黄
金’、‘水晶’、‘早生黄金’、‘早蜜新高’、‘天皇’、‘金秋’、‘晚大新高’、‘农家新高’和 ‘鲜
黄’的S基因型分别为S3S9、S3S4、S3S9、S3S4、S3S9、S3S9、S3S9、S3S9、S3S9和 S3S5； ‘天之川’
和 ‘今村秋’的S基因型分别为S S。和 S S 。
(2)本研究从5基因分子水平判定亲缘关系，证明 ‘新高’与 ‘今村秋’没有直接的亲代与子
代关系。梨的s基因为复等位基因，其遗传遵循孟德尔基因分离遗传规律，分别来自其父母本 (齐
洁 等，2002)。根据梨的S基因型判断是否具有亲子关系是一种有效的方法，这在 日本梨 ‘丰水’
亲子判断上应用过 (Machida et a1．，1982；Sawamura et a1．，2004)。 ‘丰水’曾被认为是 ‘Ri．14’
和 ‘Yakumo(八云)’的杂交后代，但由于 ‘丰水’与上述推测亲本的自交不亲和基因 (‘Ri．14’
和 ‘八云’的分别为 S S 和 S S ，而 ‘丰水’的为 S，S )不一致，从而判定 ‘丰水’的系谱有误，
并且根据这一判断通过 SSR分子标记重新认定 ‘丰水’是 ‘幸水’ × ‘I．33’的后代 (Kimura et
a1．，2003)。本研究确定 ‘今村秋’的 S基因型为 Js S ，这与 Ishimizu等 (1996，1998)和 Castilo
等 (2001)的研究结果一致，而 ‘新高’梨的s基因型为s s ，它与 ‘今村秋’没有共同的s基因。
但过去一直以来都认为 ‘新高’(S，S。)是 ‘天之JI’(S S。) × ‘今村秋’ (S S )的后代 (菊池
秋雄，1948)。‘新高’的S。来 自母本 ‘天之JI’ (S S。)，故 S，应来自父本，但过去被认为是 ‘新
高’父本的 ‘今村秋’却不含 S ，说明它们没有亲子关系。至于 ‘新高 ’梨的父本究竟是什么品
种，将有待于重新定论。
(3)在新高系梨的5个芽变品种中，尽管在树体和果实上存在不同变异，但试验证明S基因型
一 直未发生变异，说明芽变引起S基因型改变的机率极小。同时，以 ‘新高梨 (S S )为母本的4个
杂交后代中，有3个品种遗传了s 基因，由此可以看出，在遗传过程中s，有较明显的遗传优势。
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