全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (3) : 751 - 754
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 10 - 08; 修回日期 : 2007 - 04 - 17
基金项目 : 国家林业局重点科学技术开发与储备专项 (2006 - 12) ; 湖北省自然科学基金项目 ( 2006ABA186) ; 湖南省科技三项
基金项目 (0JZY2155)3 E2mail: swygl@hgnc1net, guliangyang@1631com
梨自交不亲和新基因 S35 2RN ase的克隆与表达分析
杨谷良 1, 23 , 谭晓风 1
(1 中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 , 长沙 410004; 2 黄冈师范学院生命科学与工程学院 ,
湖北黄冈 438000)
摘 　要 : 通过 RACE技术 , 从早酥梨花柱中分离到一个长度为 681 bp的自交不亲和基因 , DNA序列分
析表明 , 其开放读码框由 227个氨基酸组成 , 具有 S2RN ase基因特有的保守组氨酸和半胱氨酸残基、高变
区和保守区等特征序列 , 与己登录的 S4 2RN ase基因 DNA序列同源性最高 , 达 94% , 登录为一个新基因 :
S35 2RN ase, GenBank接收号为 DQ224344。通过 Northern杂交 , 发现该基因只在花柱中特异性表达 , 并且在
大铃铛期的表达量比花前和花后 3 d的表达量都高。
关键词 : 梨 ; RACE; 自交不亲和性 ; S35 2RN ase; Northern杂交
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0320751204
C lone and Expression Ana lysis of a Novel S 2a llele: S35 2RN ase in Pyrus
bre tschneideri
YANG Gu2liang1, 23 and TAN Xiao2feng
(1 The Key Labora tory of N on2w ood Forest Products of the M in istry of Forestry, Cen tra l South U niversity of Forestry and Technolo2
gy, Changsha 410004, Ch ina; 2B iology D epartm en t, Huanggang N orm al U niversity, Huanggang, Hubei 438000, Ch ina)
Abstract: A new self2incompatibility gene, which contains an open reading frame of 681 nucleotides en2
coding a 227 am ino acid p rotein, was isolated from Pyrus bretschneideri cultivars of Zaosu by rap id amp lifica2
tion of cDNA ends (RACE). DNA sequence analysis revealed that the isolated gene contains the specific se2
quences of S 2RN ase, such as conserved histidines and cysteines, hypervariable region and conserved regions.
It disp layed the highest homology of 94% with the embodied S4 2RN ase (AB014072). The new S2allele was
named S35 2RN ase and its accession number was DQ224344 in GenBank. The northern blot analysis indicated
that this gene only exp ressed in p istil, with a higher exp ression level at the balloon stage than at the stage of 3
days before or after flowering.
Key words: Pyrus bretschneideri; Rap id amp lification of cDNA ends; Self2incompatibility; S35 2RN ase;
Northern blot
自交不亲和性 ( Self2incompatibility, SI) 是植物雌蕊的柱头或花柱可以辨别自体花粉或 S基因型
相同的异体花粉 , 并抑制其萌发或生长的一种特性 , 它使得自体受精不能实现 , 只有遗传组成不同的
异体花粉才能完成受精。因此 , 自交不亲和性是被子植物预防近亲繁殖和保持遗传变异的一种重要机
制 , 在被子植物的早期进化中起了不可低估的作用 (McCubbin & Kao, 1999)。
梨是单一位点多个等位基因控制的配子体型自交不亲和性植物 , 它的花粉 SI表型是由其单倍体
基因组的 S -基因型决定的 , 每一个花粉粒都携带单 S -基因产物 ( Paja et al. , 2004)。
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
自交不亲和性在梨属植物中普遍存在 , 平均自交结实率通常不到 710% ( Yang et al. , 2005; 乌
云塔娜 等 , 2006a, 2006b)。至目前为止 , 梨 1 000多个栽培品种中只发现一个品种 , 即奥萨二十世
纪 (O sa2N iijiseeki) 是自交亲和的 (张绍铃和平塚伸 , 2000; 谭晓风 等 , 2005a, 2005b)。因此 , 在
生产中 , 必须配置授粉品种 , 采取人工授粉等栽培措施。
配置授粉品种常受气候环境条件的制约 , 而且还要考虑花成熟期、花粉量和品种间的亲和程度。
因此 , 通过分子生物学手段 , 确定梨品种自交不亲和基因型 , 对于梨的遗传改良和丰产栽培具有重要
的理论意义和应用价值。
本研究中采用 RACE技术 , 从早酥梨中分离到一个新的 S等位基因 , 通过序列分析和同源性比
对 , 初步确定其为自交不亲和性基因。通过 Northern杂交 , 对该基因的表达时期和表达部位进行了分
析。
1　材料与方法
试材为采自中国农业科学院郑州果树研究所的早酥梨花前 3 d、花后 3 d和大铃铛期的花柱 , 大
铃铛期的花粉和叶片。
所用的引物 P1 (5′2TTTACGCAGCAATATCAG23′)、P2 〔5′2AC (A /G) TTCGGCCAAATAATT23′〕
根据已报道的梨 S1 - 9 2RN ase基因 C1区的 ‘FTQQYQ’和 HV区下游的 ‘anti2IIW PNV’保守氨基酸序
列设计 , 委托上海基康生物技术公司合成。
总 RNA的提取按 Ambiogen公司 RNA提取试剂盒的说明进行。
3′RACE (宝生物 ) 以 P1为上游引物 , 5′RACE (宝生物 ) 以 P2为下游引物。PCR扩增条件为
94℃变性 30 s, 51℃退火 30 s, 72℃延伸 1 m in, 共 30个循环后 , 72℃延伸 10 m in。 PCR 产物用
Agrose Gel DNA Extration Kit (宝生物 ) 回收 , 与 pGEM 2T easy vector连接 , 转化至 DH5α感受态细
胞。
挑选阳性克隆 , 用引物 P1、P2进行 PCR检测 , 然后送上海基康双向测序。测序结果经拼接并用
GeneDoc软件分析后 , 通过 B last进行同源性比较。
取大铃铛期的花柱 RNA 10 ng (1μL) , 以引物 P1、P2进行 PCR扩增 (总 RNA 1μL, 10 ×RNA
PCR Buffer 1μL, MgCl2 2μL, dNTPs 1μL, AMV Reverse Transcrip tase XL 015μL, RNase Inhibitor
0125μL, O ligo dT23 sites Adap tor Primer 015μL, RNase Free dH2 O 4175μL)。PCR扩增程序为 : 94℃
变性 15 s, 51℃退火 30 s, 72℃延伸 1 m in, 共 35个循环后 , 72℃延伸 10 m in。
取 100μg (10μL) 逆转录得到的早酥的 cDNA, 按试剂盒说明进行 RT2PCR (扩增体系和反应条
件同说明书 ) , 根据 S35 2RN ase基因高变区 ( hyper variable region, HV ) 核苷酸序列 , 利用 p rime2a2
gene labeling system标记探针 , 然后用 Promega W izard PCR p rep s DNA purification System试剂盒将此
探针纯化。
2　结果与分析
211　早酥梨总 RNA提取
从早酥梨花前 3 d、花后 3 d和大铃铛期的花柱 , 大铃铛期的花粉和叶片提取的总 RNA的电泳结
果显示 , 28S、18S和 5S rRNA 3条带明显 , 表明所得到的 RNA完整性较好 ; 其 OD260 /280值介于
1183～1198之间 , 纯度也比较理想。获得的 RNA能够满足 RACE和 Northern杂交试验的要求。
212　RACE试验和 cD NA克隆序列分析
提取早酥梨大铃铛期花柱总 RNA , 分别利用 P1和 P2为引物 , 进行 3′/5′RACE试验 , 扩增出了
一条 580 bp (3′RACE) 左右的带和一条 300 bp (5′RACE) 左右的带。
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　3期 杨谷良等 : 梨自交不亲和新基因 S35 2RN ase的克隆与表达分析 　
将条带回收 , 克隆并转化大肠杆菌 DH5α后 , 挑选阳性克隆 , 利用引物 P1和 P2进行菌落 PCR,
均扩增出 200 bp左右的目的带。
将阳性克隆进行双向测序并进行拼接、分析后 , 发现拼接后片段的长度为 681 bp, 编码 227个氨
基酸。
对序列进行同源性比较 , 发现其 DNA 序列与日本梨中分离的 S4 2RN ase ( GenBank接收号为
AB014072) 同源性最高 , 达 94% , 推导氨基酸序列的同源性达 8816%。
所分离的 S2RNase蛋白具有日本梨 S2RNase蛋白的序列特征 : 5个保守区和两个高变区、具有 8
个保守的半胱氨酸残基以及 2个保守的组氨酸残基 (图 1) , 可以认定其为一个新的 S等位基因 , 登
录为一个新基因 : S35 2RN ase ( GenBank接收号为 DQ224344)。
从早酥梨中分离得到的另一个 S 2RN ase基因经过 B last比对 , 其序列与已经登录的 S22 2RN ase
(AY250990) 完全一致。
图 1　S35 2RN ase基因推导氨基酸序列与 S4 2RN ase基因氨基酸序列比较
F ig. 1　Com par ison of the deduced am ino ac id sequence between S35 2RN ase and S4 2RN ase
213　S35 2RN ase的差异表达分析
为了验证所克隆的基因是否只在花柱中特异表达 , 并探讨其表达时期 , 用 Northern印迹杂交法比
较分析了 S35 2RN ase在 3种不同部位 (花柱、叶片和雌蕊 ) 和花柱中 3个不同时期 (大铃铛期、花前
3 d和花后 3 d) 的表达情况。
结果 (图 2, 图 3) 显示 , 只在花柱中检测到杂交信号 , 大铃铛期的表达量明显高于花前 3 d和
花后 3 d的表达量。
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园 　　艺 　　学 　　报 34卷
图 2　早酥梨花前 3 d ( A)、花后 3 d ( B) 和大铃铛期 ( C)
花柱的 Northern杂交
F ig. 2　Northern blot ana lysis of the pistilpis S gene expression of 3 days
before flower ing ( A) , 3 days after flower ing ( B) and flowering ( C)
图 3　早酥梨大铃铛花期的叶片 ( A)、花柱 ( B) 和
花粉 ( C) 的 Northern杂交
F ig. 3　Northern blot ana lysis of the S genepis expression
in leaf ( A) , p istil ( B) and pollen ( C)
3　讨论
从中国白梨早酥梨中分离得到的 S35 2RN ase基因的推导氨基酸序列具有从日本梨中分离得到的 S2
RNase蛋白的序列特征 : 保守区和高变区 , 保守的半胱氨酸和组氨酸残基 , 这些区域是维持 S 2RN ase
的高级结构或作用位点 (W ang et al. , 2003)。
S 2RN ase具有组织表达特异性和时期表达特异性 , 即只在花柱中特异性表达 , 大铃铛期的表达量
明显高于花前 3 d和花后 3 d。这与蕾期自交亲和的现象一致。探讨雌蕊自交不亲和基因的表达调控
方式 , 可能在配子体自交不亲和性的作用机制方面取得突破。
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